共焦点断層撮影は、細胞の障壁およびニッチと相互作用する癌細胞行動の完全な範囲を得るために開発された。この方法は、転移が発生したときにメタスタを研究するための基礎を提供します。この方法は、ライブセルの動作を定量化するのに役立ちます。
共焦点断層撮影は、機械学習と組み合わせると、さまざまなオルガンオンチッププラットフォームに役立ちます。原発性腫瘍、再発性腫瘍細胞、循環腫瘍細胞の分析は、脳転移を予測し、非脳転移細胞から脳転移を識別するための重要な診断ツールとなる可能性があります。マイクロ流体BBNデバイスを組み立てるには、吸入口を下に向けて真空デシケータから適切な表面にデバイスを転送し、セットアップ全体をプラズマチャンバに配置します。
セットアップ全体をプラズマチャンバーに入れ、真空を引っ張ってから、80ワットで30秒間プラズマで処理します。治療の最後に、ガイドを使用して素早くデバイスを配置し、入口側をラボベンチのガラススライドに上に置き、デバイスのPDMとスライドの間に永久結合を作成します。次に、200マイクロリットルピペットチップを挿入し、先端から2ミリメートルを全ての入口と出口に切り、8分間、200ワットのプラズマ処理のためにデバイスをプラズマチャンバーに入れます。
装置が冷却された後、デバイスを無菌二次容器に入れ、プラスミド処理の15分以内に、コラーゲンアストロサイト溶液の120マイクロリットルを底チャンバのピペットチップを通してデバイスに移します。ソリューションが反対側のピペットチップにチャンバーを横切ってウィックし、デバイスの次のチャネルを埋めることを可能にします。装置の4つのチャネルすべてが満杯になったら、細胞培養インキュベーターにチップを1時間置きます。
コラーゲンがセットされたら、すべてのピペットチップに適切な完全な細胞培養培地を底チャンバーに供給し、完全な内皮培地で2%成長因子減少マトリゲルで上のチャンバーをコーティングします。両方のチャンバーがコード化されたら、適切な媒体で上の部屋をすすくう前に、1時間インキュベーターに装置を入れます。交互のヒントは、適切な培地のミリリットル当たり10〜6番目の内皮細胞の30マイクロリットルを見て、15分ごとに上の部屋に先端を通して、チップ当たり合計4つのアリコートの細胞を見る。
シーディングの間に装置をインキュベートする。すべての内皮細胞を播種したら、すべての先端を培地で満たし、48時間細胞培養インキュベーターに戻します。内皮層が成熟したら、チップ中の培地を交換して細胞培養培地を補充し、各トップチャンバチャネルを10倍の30マイクロリットルで播種し、適切な培地の6ミリリットル当たり6個の癌細胞をシードする。
各30マイクロリットルの細胞アリコートを播種した後、デバイスを15分間インキュベーターに戻し、適切な培地ですべてのチップを充填し、デバイスを細胞培養インキュベーターに24〜48時間戻します。装置が培養され、画像化された後、癌細胞の表現型を測定し、提供されたソフトウェアを開いて、共焦点像をメモリに読み込む。ソフトウェアは、3D共焦点画像から別のTIFFファイルに各カラーチャンネルを保存します。
「各顕微鏡チャンネルの不透明度値を変更」を選択し、背景が除去され、細胞内の蛍光だけが残るような、画像内のカラーチャンネルのチャンネルアルファ値を調整します。効果を視覚化するには、[3D レンダリングを表示] を選択してしきい値が正しく設定されていることを確認し、画像が正しく表示される場合は、実験トラッカー スプレッドシートに不透明度の値を保存します。次に、マーチング キューブを使用して、ボリューム イメージを VTK データ形式で保存された個々の 3D 三角形メッシュ オブジェクトに変換します。
平面を内皮バリアに合わせるには、まず細胞の重心を見つけます。ポリデータ接続フィルタを使用して VTK ファイル内のメッシュのリストを反復処理し、接続されていない領域を抽出します。各メッシュの中心を計算し、大きすぎるメッシュまたは小さすぎるメッシュの中心のフィルタリングのリストに測定を追加します。
内皮細胞の重心のリストに平面を合わせるには、誤差法の最小化を使用し、RFP重心と平面適合を視覚化して平面適合を生成およびプロットし、必要に応じて手動でフィットを調整します。平面が適切に取り付けられている場合は、平面の法線を実験トラッカー ファイルに保存します。平面で内皮層を特徴付けた後に各癌細胞表現型を測定するには、細胞分析機能をロードし、実験トラッカー情報で読み取りを実行し、存在するチャネルを分析する」を繰り返し、VTKファイル内の各領域を分析する。
各領域について、各セルをクリップして、膜の下のメッシュが計算されます。細胞表現型を測定するには、各癌細胞の形状、体積および位置を計算する。次に、各クリッピング癌細胞の体積と位置を測定し、内皮バリアを通って飛び出した細胞の割合を計算する。
複数の実験でこれらの手順を実行した後、データを単一の xlsx ファイルとしてエクスポートして、データをスプレッドシートに保存します。コンフルエント内皮バリアを備えたマイクロ流体BBNチップは実験に適していますが、特に内皮被覆性の悪い微流体BBNチップは許容されません。この代表的な分析では、がん細胞株を求める脳は、内皮障壁を越えて飛散し、マイクロ流体BBNチップの脳ニッチ空間に深く移動する細胞の亜集団を示す暴露後2日と9日で、親の癌細胞は脳ニッチ空間から離れた障壁の上に細胞のかなりの割合を維持した一方、脳転移性癌細胞集団は100%を超える細胞の割合を維持した。
癌細胞の形態学的定量化は、親の細胞が播種後1日目に球形細胞の数が少なく、2日と9日後の相互作用の後、両方の癌細胞株が球形を減少させる傾向があることを示した。さらに、アストリシディックニッチに飛入した癌細胞の亜集団は、脳に飛び込まずに内皮バリアと相互作用したままの癌細胞と比較して、サイズが小さかった。がん細胞株および患者由来の異種移植片を求める脳は、機械学習によって脳転移性および非脳転移性癌細胞を区別するために利用され得るマイクロ流体BBNチップに現象パターンを示す。
自己選択は重要です。より高く、低い通路数を有する内皮細胞は、可変的なバリア挙動を示した。また、がん細胞とその蛍光発現は時間の経過とともに変化する可能性があります。
この手順の後、研究者は、転移の分子メカニズムを研究するために、デバイス内の秘密の家庭または細胞の分子プロファイリングを採用することができます。この技術は、設計された微小環境とニッチ成分の定量的イメージングを時間の経過とともに組み合わせることで、癌細胞とその微小環境との複雑な相互作用を探索することを可能にする。
