我々のプロトコルは、単一粒子チェック分析を使用して、ダイナミクスの位置と向きを監視し、細胞膜上の金色ナノロッドの拡散を特徴付けます。この方法を用いて、金色ナノロッドの並進と回転のダイナミクスを両方得ることができ、その動的を総合的に分析して提示することができます。このプロトコルは、他のタイプの複雑な生物学的システムの研究に使用される可能性を有する。
まず、エタノールを浸したガラスカバースリップを炎に燃やし、フェノールレッドのない2ミリリットルの細胞培養培地を含む35 x 10ミリメートルの細胞培養皿にカバースリップを入れることから始めます。関心のある細胞懸濁液の50マイクロリットルをカバースリップに加え、皿を前後左右に軽く振って細胞を均等に分配します。CTABコーティングされた金ナノロッドの20マイクロリットルを皿に加える前に、細胞が20〜40%の合流に達するまで約12時間、細胞培養インキュベーターに皿を入れます。
皿の向こう側にナノロッドを均等に分散させるために穏やかに揺れた後、5分間加湿した雰囲気の中に皿を置きます。インキュベーションの終わりに、皿から100マイクロリットルの上澄み物をガラススライドの溝にゆっくりと移し、カバースリップセル側をスライド溝の上に慎重に置き、カバースリップの端をマニキュアで密封し、マニキュアを乾燥させてから、暗視野顕微鏡ステージにスライドさせます。暗視野顕微鏡による単一粒子追跡の場合、油の上に油滴を浸しダークフィールドコンデンサーに置き、コンデンサーがガラススライドに接触するまでノブを回します。
カバーガラスの上部に油を一滴置き、60倍油浸出目的が油に触れるまで焦点を合わせます。光源をオンにし、焦点を合わせるノブを少し回して、イメージング平面に焦点を合わせます。次に、顕微鏡ソフトウェアのカメラアイコンをクリックして、カラーCMOSカメラを使用してサンプル散乱光画像時系列を記録し、TIFF形式で画像を保存します。
1 つの長期軌跡を抽出するには、ImageJ でイメージを開き、画像、タイプ、および 8 ビットをクリックして、RGB モードから 8 ビット モードにイメージを変換します。コントラストを調整するには、画像をクリックし、調整し、明るさのコントラストを調整し、パラメータを設定します。ターゲット パーティクルを選択し、コントロール X を使用して時系列の背景を切り取ります。
クリックプラグイン、パーティクルトラッカークラシック、およびパーティクルトラッカーをクリックして、パーティクル検出ウィンドウとパーティクルリンクウィンドウを開き、半径を 6、カットオフを 0.01%に設定し、パーセンタイルを 0.01%に設定し、リンク範囲を 10 に設定し、変位を 10 に設定して[OK]をクリックして、パーティクル トラッカーの結果ウィンドウを開いて結果を確認します。生成された軌道を検査するには、すべての軌道をクリックして視覚化します。ソフトウェアが生成した軌道と金ナノロッドの移動軌道が一致する場合は、[完全なレポートを保存] をクリックして結果を保存します。
ソフトウェアによって生成された軌道が金ナノロッドの移動軌道と一致しない場合は、再リンクパーティクルをクリックして、検出されたパーティクルを異なるリンク範囲とパーセンタイルパラメータで再リンクします。XY 座標に従って各フレームの金ナノロッドの中心ピクセル座標を求めるには、xy コーディネーションを使用します。m関数。
3 x 3 ピクセルの行列を区切る場合は、赤または緑のチャンネルの 9 つの散乱強度値を抽出し、平均値を計算する場合は、rgextract を使用します。m関数。その後、偏光を使用します。
m関数は、デュアルチャネル差動法を用いて極角を計算する。表の数式を使用して動的パラメータを計算するには、2 つの解析スクリプトを実行します。軌道の視覚的な分析では、X 座標を X、Y 座標を Y、時間を Y に設定し、プロット、散布図、およびカラー マップをクリックし、グラフ パラメータを設定し、カラー バーを追加します。
平均平方変位時間間隔の数値を生成するには、時間間隔をX、平均二乗変位をY.Clickプロット、散布、解析、継手、非線形曲線の継手、開いたダイアログとグラフパラメータを設定します。複数粒子統計解析の場合、対象の動的パラメータを Y に設定し、プロットとヒストグラムをクリックします。ヒストグラムをダブルクリックして、分割サイズまたは分割数を設定し、[適用] をクリックします。
次に、列を追加し、グラフのパラメータを設定します。時系列分析の場合は、時間を X、時系列パラメーターを Y に設定します。ポップアップ ウィンドウで、[行] を選択して [OK] をクリックします。次に、グラフのパラメータを設定します。
縦断プラズモニック最大40×85ナノメートルのCTAB被覆金ナノロッドは約650ナノメートル、横共鳴は520ナノメートルです。U87細胞膜上のCTABコーティングされた金ナノロッドの散乱強度は、この実験で追跡されたCTABコーティングされた金ナノロッドが十分に単分散していることを示すガラス上のCTABコーティング金ナノロッドのそれと一致する狭い幅を有する典型的なガウス分布を示す。図示したように、500以上のCTABコーティングされた金ナノロッド軌道は、暗視野顕微鏡で追跡することができ、長距離拡散軌道と閉じ込められた拡散軌道に分けることができる。
この代表的な分析では、500本の軌道の旋回半径は、旋回半径0.5マイクロメートルの平均値分布を示し、最大変位は小さな値でより分布していた。このアンサンブル時間平均平均平方変位解析で示されているように、CTABコーティングされた金ナノロッドは通常、およそ1のアルファで拡散する。しかし、すべての軌道から得られる拡散係数とアルファの密度分布は、金ナノロッドのダイナミックさが、スーパーディフュージョン、ブラウン、および沈水運動を伴う異種分布を示すことが明らかである。
さらに、単一粒子統計解析と時系列パラメータ解析を使用して、2つの代表的な長期限定軌道と移動軌道を特徴付けることができます。一般的にいくつかの困難なトレードオフがあるので、単一の粒子追跡分析の読み出しからデータの単一の新しい解釈を要約して抽出する必要があります。
