この研究は、NIH(1R35GM133496-01)からZ.ガオへの助成金によって支えられた。ライアン・ホッブス博士の切り離し支援に感謝します。ペン州立医科大学の中核施設(ゲノム科学とバイオインフォマティクス、先端光顕微鏡イメージング、フローサイトメトリーなど)に感謝します。また、今村有香先生のRNA-seq解析のお手伝いに感謝します。

1. mESC文化
<ol><li>10 cmの組織培養処理プレートに0.1%のゼラチンをコーティングし、ゼラチンを少なくとも15〜30分間セットしてから吸い出します。</li>
	<li>種子γ照射マウス胚性線維芽細胞(MEF)は、予め温めたmESC培地(Dulbeccoの改変イーグル培地(DMEM)に15%の胎児ウシ血清(FBS)、非必須アミノ酸を含むMESCを培養する前日に、 β-メルカプトエタノール、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、LIF、PD0325901(PD)、およびChir99021(CH))</li>
	<li>e14細胞を培養する前に、γ照射されたMEFをプレート表面に沈着させます。</li>
	<li>37 °Cの水浴でE14 ESCを解凍し、すぐに暖かいmESC媒体と15 cmの円錐形の管の細胞を移す。細胞を200xgで3分間ペレットし、上清を取り除きます。</li>
	<li>細胞をmESC培地の10mLに再懸濁し、先に播種したγ照射されたMEFを含む培養プレート上の細胞をプレートに入れた。5%CO2未満の37°Cインキュベーターで細胞培養をインキュベートする。</li>
	<li>培養パスケージングの場合、培地を吸引し、滅菌1xPBSでプレートを洗浄する。プレート表面を覆うのに十分な0.05%のトリプシンを加え、37°Cで3分間インキュベートします。</li>
	<li>mESC培地とピペットでトリプシンを中和し、単一細胞懸濁液を生成します。細胞を200xgで3分間遠心し、上清を取り除きます。</li>
	<li>血球計または細胞カウンターで細胞を数え、10cm培養プレートに約5.0 x105個 の細胞を播種します。</li>
	<li>細胞をmESC培地の10mLに再懸濁し、先に述べたようにゼラチンコーティングされた組織培養プレート上の細胞をプレートし、培養をインキュベートする。 注: 細胞がコロニー内で分化するのを防ぐために、mESC を 2 日ごとに通過させることが推奨されます。フェノール赤は、pHインジケーターとしてのみ機能し、細胞密度に応じて、2日よりも早く黄色(より酸性)に変えることができます。したがって、毎日培地を変更する必要があるかもしれません。γ照射されたMEFは、いくつかの通路の後に最終的に死ぬでしょう。</li>
</ol>2. EB、NPC、およびニューロンの分化
<ol><li>前述のカルチャパスパサイジング プロトコルを実行し、セルをカウントします (手順 1.7 ~ 1.10)。</li>
	<li>ぶら下げ方法 (日 0)<ol>
<li>10cmの細胞培養プレートの場合、5.0 x 102細胞が20μL分化培地(15%FBS、非必須アミノ酸、βメルカプトエタノール、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピロビン酸を含むDMEM)に懸濁する約2.5 x 104細胞を数えます。細胞を含む約502μLの液滴は、10cmのプレートにメッキすることができる。</li>
		<li>適切な数の細胞をアリコートし、次いで細胞を200xgで3分間遠心し、上清を除去する。</li>
		<li>細胞密度5.0 x 102細胞 /20μL(例えば、分化培地1mLの2.5 x104細胞 )の適切な分化培地の細胞を再懸濁する。</li>
		<li>マイクロピペットまたはリピータピペットを使用して、細胞懸濁液の20μL液滴を組織培養プレートの蓋上に置く。液滴が互いに近すぎないようにして、液滴がマージされないようにします。 注:液滴は、プレート自体ではなく蓋の上に置かれるので、組織培養処理された取り付けプレートまたはサスペンションプレートのいずれかにメッキすることができます。より実現可能で無菌のアプローチのために、液滴を付着組織培養プレートにプレートし、以下に説明するように懸濁液プレートに移します。</li>
		<li>1x PBSの5~10 mLでプレートを満たし、蓋を慎重にプレートに戻します。培養液を37°Cインキュベーターで培養します。 注:PBSは、液滴が乾燥するのを防ぐために培養プレートに添加されます。</li>
	</ol></li>
	<li>2日目には、マイクロピペットを使用して蓋から液滴を回収し、10mLの分化培地で満たされた10cmの細胞培養懸濁液板に入れます。インキュベーターで低速で揺れる軌道シェーカー上の培養物をインキュベートします。</li>
	<li>4日目に、EBを収穫し、細胞を採取し、200xgで3分間遠心分離し、上清を取り除く。 注: その後の実験の要件に従って、1x PBS で EJB を洗浄することもできます。</li>
	<li>処置を継続し、EB分化を神経前駆細胞(NPC)に誘導し、5μMレチノイン酸(RA)で分化培地を調製する。</li>
	<li>100 x g で 3 分間のエブをペレットにして古い培地を取り除くか、古い培地を吸い出す前に EB が沈着するようにします。培養プレートに5μM RAを含む分化培地10mLを加えます。</li>
	<li>6日目に、プレートを傾けて上記のように培地をピペットアウトして、培地の少なくとも半分を5μM RAを含む新鮮な培地に置き換えます。 注:5日目と7日目には、少なくとも半分の媒体を新鮮なRA含有培地に置き換えるのが推奨されます。フェノール赤いインジケータのメモを取る;黄色がかった場合は、すべての媒体を置き換えるのが最善です。</li>
	<li>8日目に、細胞を採取し、200xgで3分間遠心し、上清を取り除いてNPCを収穫する。 注:NPCは、その後の実験のニーズに応じて1倍のPBSで洗浄することもできます。必要に応じて、NPCを凍結して再び解凍して、後で培養および分析することができます。NPCを培養する場合、アキュタスはトリプシンの代替として使用することもできます。</li>
	<li>手順を継続し、NPCをニューロンに分化するには、遠心分離によって15 mLの円錐管にNPCを収集し、トリプシンで解体し、37°Cで3分間インキュベートします。ピペットNPCは、すべてのNPC凝集体が解別され、トリプシンを培地で中和することを確実にする。</li>
	<li>40 μmナイロン細胞ストレーナーで細胞をフィルターし、N2培地(DMEM/F12培地+ 3 mg/mLグルコース + 3 mg/mL 脂質豊富なウシ)の密度1.5 x 105/cm2 でめっきする前に細胞を数える 血清アルブミン(LBSA)+1:100 N2サプリメント+ 10 ng/mL bFGF + 50 U/mLペン/ストレップ + 1 mM L-グルタミン) その後のPCRおよびウェスタンブロット実験のための組織培養処理プレート;または免疫蛍光実験のための組織培養室で。</li>
	<li>9日目に、古い媒体を新鮮なN2培地に交換します。</li>
	<li>10日目にN2培地をN2/B27培地(50%DMEM/F12および50%ニューラル基底、3mg/mL LBA、1:200 N2サプリメント、1:100 B27サプリメント、50 U/mLペン/ストレップ、1mM L-グルタミン)に切り替えます。</li>
	<li>11日から12日に、次のようにニューロンを収穫します。細胞を1x PBSで洗浄し、トリプシンを加え、37°Cインキュベーターで3分間培養してから、トリプシンを培地で中和し、遠心分離機を200xgで3分間培養します。</li>
</ol>3. mESCと分化セルの特性
<ol><li>アルカリホスファターゼ(AP)アッセイ 
	<ol>
<li>キットを使用してアルカリホスファターゼの活動を評価します( 材料表を参照)。</li>
		<li>培養プレートから培地を取り出し、1x PBSでESCを洗います。</li>
		<li>キットに付属の1mLの固定溶液(ホルムアルデヒドとメタノール)をプレートに加え、室温で2〜5分間インキュベートします。 注: 修正ソリューションの過剰インキュベーションは AP アクティビティを危険にさらす可能性があります。</li>
		<li>修正液を取り出し、1x PBSでESCを洗い、プレートにいくらかの量のPBSを残します。 注: AP アクティビティを損なわないよう、PBS で ESC を湿らせておいてください。</li>
		<li>A、B、Cの基板溶液を1:1:1比で混合してAPソリューションを準備します。最初にAとB溶液を混合し、C溶液を添加する前に2分間室温で混合物をインキュベートします。</li>
		<li>1x PBS を取り外し、先ほど用意した AP ソリューションを追加します。</li>
		<li>培養プレートをアルミ箔で包むか、暗い部屋でステップ3.5を行って、暗闇の中で約15分間ESCをインキュベートします。</li>
		<li>反応を監視し、溶液が明るくなったときに反応液を除去し、非特異的な染色を避けます。</li>
		<li>1x PBSでESCを2回洗います。</li>
		<li>ESCを1x PBSまたは取り付け媒体で覆うことで、サンプルの乾燥を防ぎます。 注: AP 表現には赤または紫の染色が表示されます。プレートは4°Cの冷蔵庫に収納できます。</li>
	</ol></li>
	<li>RT-qPCR 
	<ol>
<li>ESC と EB および NPC の手順 1.6 ~ 1.7 と 2.4 に従って、さまざまな段階でセルを収集します。</li>
		<li>RNA、DNA、およびタンパク質抽出溶液を使用してRNAを分離します( 材料表を参照)。</li>
		<li>逆転写キットを使用して cDNA を生成し( 資料表を参照)、製造元のマニュアルに従います。</li>
	</ol></li>
	<li>固定と埋め込み 
	<ol>
<li>上記のようにEBとNPCを収穫し(ステップ2.6)、室温で30分間1xPBSで4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液で固定します。</li>
		<li>PFAを取り出し、サンプルを1x PBSで5分間洗います。</li>
		<li>サンプルを1x PBS、10%、20%、および30%スクロース溶液を25\u201228 °Cで連続希釈し、30分のインキュベーション後にサンプルを次の溶液に移します。 注:サンプルは、埋め込みステップを続行する前に、4 °Cで30%スクロース溶液に保存することができます。</li>
		<li>サンプルを(積み重ねずに)凍結鋳型の中心に置く前に、スクロース溶液でピペットチップを濡らし、余分な液体をピペットアウトします。 メモ: フィルター ペーパーを使用して、余分なソリューションを削除することもできます。チップチップをスクロース溶液で濡らすと、先端の壁にEBやNPCが付着するのを防ぐことができます。</li>
		<li>サンプルを再中断することなく、最適な切削温度(OCT)溶液を慎重に金型に追加し、ピペットで余分な気泡を除去します。</li>
		<li>サンプルを用いてラボのミキサーに低速で金型を置き、サンプルを軽く攪拌して15分間温かく攪拌します。これは、OCT ソリューションで再中断された場合に、EB と NPC を最下位に解決するのに役立ちます。</li>
		<li>液体窒素またはドライアイスに金型を入れることで、サンプルを素早く凍結します。 メモ:サンプルは、次のステップに進む前に-70°Cの冷凍庫に保管することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>凍結切断 
	<ol>
<li>クライオスタットを -20 ~ -18 °C に冷却してから、サンプルを器具に移します。</li>
		<li>凍結したOCTブロックを金型から取り外し、ホルダーの表面に少しOCT溶液を置いてホルダーに固定します。</li>
		<li>切り離し中にサンプルが失われないように、EB と NPC がブレードに最も近いように OCT ブロックを位置合わせします。</li>
		<li>慎重にブロックの10 μmをセクションし、サンプルを含むスライスに細心の注意を払います。</li>
		<li>サンプルを含むOCTスライスを組織埋め込みガラススライドに素早く置き、OCTスライスを室温で1時間空気乾燥させます。 メモ:サンプルは、後で使用するために-70°Cで保存することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>免疫蛍光(IF) 
	<ol>
<li>OCTセクションまたは培養チャンバーは、ニューロンを10%正常ロバ血清/0.1%トリトンX-100で1x PBSで1時間室温で1時間ブロックします。</li>
		<li>サンプルを5%正常ロバ血清/0.05%トリトンX-100で希釈した一次抗体で、4°Cで一晩1x PBSでインキュベートする。</li>
		<li>1回の洗浄でサンプルを1x PBS/0.1%トリトンX-100で洗浄します。</li>
		<li>サンプルを5%正常ロバ血清/0.05%トリトンX-100で1時間室温で1時間希釈した二次抗体でインキュベートします。</li>
		<li>1x PBS/0.1% トリトンX-100でサンプルを洗浄し、各洗浄を5分間洗浄し、1 μg/mL DAPIでサンプルをインキュベートします。</li>
		<li>カバースリップといくつかの取り付け媒体でサンプルを取り付け、乾燥させます。</li>
		<li>蛍光顕微鏡でサンプルを観察します。</li>
	</ol></li>
	<li>RNA-セクの分析 
	<ol>
<li>様々な段階で細胞を収集し、RNA抽出を行う(ステップ3.2参照)。</li>
		<li>cDNAライブラリを準備し、Wangら8に記載されているプロトコルに従って深いシーケンシングとデータ分析を行う。</li>
		<li>R パッケージ、クラスタープロファイルを使用して遺伝子オントロジー (GO) 分析を実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>フローサイトメトリー 
	<ol>
<li>手順 1.6 ~ 1.7 に従って ESC を収集し、セルを培地で再中断します。手順 2.4 に従って、EB と NPC を収集し、セルをメディアで再中断します。</li>
		<li>40 μm ナイロンセルストレーナーを使用して、新しい 15 mL 円錐チューブにセルサスペンションをフィルターします。</li>
		<li>フローサイトメーター(施設のコア施設によって実行される)を使用してサンプルのGFP信号を測定します。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+imaging+(HCI)+on+miniaturized+three-dimensional+(3D)+cell+cultures.">High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures.</a> Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).</li></ol>

著者は、競合する財政的利益はないと宣言しています。

マウス胚性幹細胞の神経分化の方法は何十年も確立されており、研究者は以前のプロトコルを変更したり、様々な目的のために新しいプロトコルを作成し続けています7,10,11.一連のアッセイを用いて、マウスやヒトESCの他の系統分化の解析に用いることができるニューロンへのmESCの分化段階の効率と進捗状況を総合的に分...

開発中マウス胚盤胞1,2の内細胞塊からの初の導出以来、マウス胚性幹細胞(mESC)は幹細胞自己再生と分化を研究する強力なツールとして用いられてきた3。さらに、mESC分化を研究することは、神経変性疾患などの疾患の治療における幹細胞ベース療法における効率と安全性を向上させる可能性のある分子機構の多大な理解につながる4。動物モデルと比較して、このin vitroシステムは、実際と評価におけるシンプルさ、動物とは対照的に細胞株を維持する際の低コスト、および遺伝子操作における相対的な容易さなど、多くの利点を提供する。しかし、分化された細胞タイプの効率と品質は、多くの場合、mESCの異なるラインと分化方法5、6の影響を受けます。また、分化効率を評価する従来のアッセイは、堅牢性に欠ける選択されたマーカー遺伝子の定性的検査に依存しているため、遺伝子発現の世界的な変化を把握することができません。
ここでは、神経分化の系統的評価にアッセイの電池を使用することを目指しています。選択したマーカーとRNA-seqに対する従来のインビトロ分析を用いて、分化効率とこのプロセス中の転写変化を測定するためのプラットフォームを確立します。既に確立されたプロトコル7に基づいて、吊り下げ低下技術を通じて胚体(EB)を生成し、続いて上端菌量のレチノイン酸(RA)を用いて神経前駆細胞(NPC)を生成し、その後神経誘導培地でニューロンに分化した。分化の効率を調べるために、従来のRT-qPCRおよび免疫蛍光(IF)アッセイに加えて、RNA-seqおよびフローサイトメトリーを実施した。これらの分析は、ステージ固有の分化の進行を包括的に測定します。

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X</td><td>Corning</td><td>25-052-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>Prepared in de-ionized water</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>Diluted in 1X PBS</td></tr><tr><td>40-&amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Albumax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>Antibody was diluted at 1:500 for IF</td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase Staining Kit II</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td></td></tr><tr><td>AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox</td><td>Azura Genomics</td><td>AZ-2105</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto</td><td>BD</td><td>657338</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>11123149001</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Chir99021</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>C298-500</td><td>Fisher Chemical</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>R37606</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EB buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>111000200</td><td>Pharmco</td><td>Diluted in de-ionized water</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S10250</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 Sequencing System</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>BDH1133-4LG</td><td>BDH VWR Analytical</td><td>Diluted in de-ionized water</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Collected from MEF supernatant</td></tr><tr><td>m18srRNA primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-GCAATTATTCCCCATGAACG-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3&#039;</td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>mNanog primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3&#039;</td></tr><tr><td>mNes primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3&#039;</td></tr><tr><td>mNeuroD1 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3&#039;</td></tr><tr><td>mOct4 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3&#039;</td></tr><tr><td>mPax6 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3&#039;</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Nestin primary antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>Antibody was diluted at 1:200 for IF</td></tr><tr><td>Neural basal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilament primary antibody</td><td>DSHB</td><td>2H3</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit</td><td>BioO Scientific</td><td>NOVA-5138-07</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13034</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Prepared in de-ionized water</td></tr><tr><td>- Potassium chloride</td><td>P217-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>- Potassium phosphate monobasic anhydrous</td><td>0781-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>- Sodium chloride</td><td>BP358-10</td><td>Fisher Bioreagents</td><td></td></tr><tr><td>- Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate</td><td>SX0715-1</td><td>Milipore</td><td></td></tr><tr><td>Random hexamer primer</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Prepared in DMSO</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>84097</td><td>Diluted in 1X PBS</td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064022</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>TriPure Isolation Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11667165001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Rapid</td><td>Illumina</td><td>20020616</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP176-100</td><td></td></tr></tbody></table>

differentiation and characterization of neural progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells

マウス胚性幹細胞を神経系統に分化し、次に分化した細胞を特徴付ける一連のアッセイを行うステップバイステップの手順について述べています。E14マウス胚性幹細胞を使用して吊り下げドロップ法を介して胚体を形成し、次にレチノイン酸によって神経前駆細胞に分化し、最終的にニューロンに分化した。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)および免疫蛍光実験により、神経前駆物質およびニューロンが、8日目と12日目の分化後に対応するマーカー(神経前駆物質用のネチンとニューロンの神経フィラメント)をそれぞれ示すことが明らかになった。 Sox1 プロモーター主導のGFPレポーターを発現するE14ラインでのフローサイトメトリー実験は、8日目の細胞の約60%がGFP陽性であることを示し、この段階で神経前駆細胞の分化が成功したことを示した。最後に、RNA-seq分析を使用して、世界的な転写変化をプロファイリングしました。これらの方法は、神経細胞の分化中の細胞の同一性遷移を調節する際の特定の遺伝子および経路の関与を分析するのに有用である。

この方法の表現として、E14細胞に対してEB、NPC、およびニューロン分化実験を行いました。E14細胞は、γ照射されたMEF集団が希釈されるまでγ照射MEF(図1A)で培養した。E14細胞の多能性を確認した結果、ナノグおよびOct4マーカーに対してアルカリホスファターゼ(AP)染色(図1B)および後述のRT-qPCR(下記参照)を行うことで、E14細胞の多能性を確認し...

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Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

吊り下げドロップ法を用いて、マウス胚性幹細胞を神経細胞に分化する手順について説明する。また、RT-qPCR、免疫蛍光、RNA-seq、フローサイトメトリーを通して包括的なフェノミック解析を行っています。

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

differentiation-characterization-neural-progenitors-neurons-from

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.8K ビュー.  Penn State Hershey Cancer Institute. 吊り下げドロップ法を用いて、マウス胚性幹細胞を神経細胞に分化する手順について説明する。また、RT-qPCR、免疫蛍光、RNA-seq、フローサイトメトリーを通して包括的なフェノミック解析を行っています。

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Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

発生生物学

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

マウス胚性幹細胞の皮質介在ニューロン前駆細胞への分化

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

神経科学

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

運動ニューロンにマウス胚性幹細胞の効率的な分化

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

生物学

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

マウス萌芽期の神経幹細胞の分離と培養

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Generating Neural Progenitors from Mouse Embryonic Stem Cells by the Hanging Drop Method

Source: Hanafiah, A., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61446">Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video demonstrates the differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) to embryoid bodies (EBs) by the hanging drop method. Upon suspending the mESCs in hanging drops and incubating, the cells aggregate to form EBs, which are further differentiated into neuronal progenitor cells (NPCs) using a differentiation medium supplemented with retinoic acid (RA).

ハンギングドロップ法によるマウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞の生成

1. mESC culture

	Coat a 10 cm tissue-culture-treated plate with 0.1% gelatin and allow the gelatin to set for at least 15&#8211;30 min before aspirating ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

神経細胞培養技術

一次神経細胞培養

Differentiating Human Embryonic Stem Cells into Neural Progenitors

Source: Jeon, K. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60571">Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates the differentiation of human embryonic stem cells, or hESCs, directly into neural progenitor cells without using feeder cells or any intermediate steps. The selective inhibition of bone morphogenetic protein or BMP and transforming growth factor-beta, or TGF-&#946;, signaling pathways leads to hESCs differentiation into neural progenitor cells, or NPCs.

ヒト胚性幹細胞の神経前駆細胞への分化

1. Preparation of human embryonic stem cells (hESC)-qualified Basement Membrane Matrix-coated Plates

	Slowly thaw the hESC-qualified basement membrane ...

高度な神経細胞モデル

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

マウス胚性幹細胞から神経前駆細胞を作製する技術

1. Mouse embryonic stem cell culture

	Prepare 0.1% gelatin coated cell culture dishes or plates.
	
		Add 2 mL of sterilized 0.1% gelatin (0.1% w/v in ...

Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neurons

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video showcased a cell culture method for differentiating neural progenitor cells into neurons. By incubating cells in a nutrient-rich medium supplemented with growth factors, the progenitor cells matured into neurons with developed axons and dendrites. A stabilizing agent ensured cell viability and protected against oxidative damage throughout the differentiation process.