このプロトコルは、タバコの煙が肺上皮細胞のシュードモナス菌負荷に影響を与えるかどうかを判断するために3つのアプローチを使用します。この方法は、内皮細胞または他の細胞タップに拡張することができる。タバコの煙抽出の調製、細菌感染および細菌負荷による決定は、このビデオで詳細に説明されている。
この手順は、新しいユーザーにとって非常に簡単に実行できます。10ミリリットルの無血清細胞培養培地を60ミリリットルのシリンジに引き込む。トリムの狭い端をシリンジのノズルに1ミリリットルのピペットチップに取り付け、タバコを保持するアダプターとして取り付けます。
タバコからフィルターを取り外し、タバコをアダプターに取り付けます。アッセイを行う前に30分以上タバコを燃焼し、シリンジに空気を含む煙の40ミリリットルを引き込みます。煙と煙を激しく振って媒体と混ぜます。
タバコが完全に燃え尽きるまで描画プロセスを繰り返し、約7分で約11回の引き出しが必要になります。培地から微生物や不溶性粒子を除去するには、0.22ミクロンのフィルターを通して濾過します。次いで、閉じた滅菌チューブに培地を移す。
選択したシュードモナス株でトリプティック大豆ブロスまたはTSBオーガープレートを接種する。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。炭素源として5%グリセロールを有するTSBの20ミリリットルを含むチューブを調製する。
オーガープレートから汚れを収集し、TSBを接種します。シュードモナス懸濁液を200RPMで37度の摂氏シェーカーでインキュベートし、約1時間、600ナノメートルでの光学密度が0.6になるまで。原稿に記載されているように肺上皮細胞を培養した後、0.25%トリプシンの1ミリリットルを細胞に加える。
約5分後、細胞がプレートの底から完全に剥離したら、トリプシンを中和するために完全なハイツ培地の10ミリリットルを加えます。細胞を15ミリリットルのチューブに移します。その後、セルを摂氏4度で5分間、G.300回遠心分離し、上清を取り除いて捨てます。
その後、セルを10%FBSでハイツ培地のミリリットルに再懸濁します。上皮細胞懸濁液のピペット10マイクロリットルを新しいプレートに上に。細胞濃度を求めるには、自動セルカウンターを使用します。
肺上皮細胞を1ミリリットル当たり5番目の細胞の3倍の濃度で、井戸当たり2ミリリットルの培地の総量でプレートします。プレートを一晩インキュベートします。セルが約 80% のコンフルエンスに達したら、高さの媒体に 1%FBS を加えた媒体を取り替えます。
その後、ウェルに4%CSEを加え、プレートを3時間インキュベートします。CSE処理肺上皮細胞の各ウェルにシュードモナスを加える。その後、5%の二酸化炭素で摂氏37度で1時間プレートをインキュベートします。
次に、6つのウェルプレートの培地を、4%CSEと1ミリリットルのゲンタマイシンを含む新鮮なハイツ培地の2ミリリットルに交換します。5%の二酸化炭素で摂氏37度で1時間プレートをインキュベートした後、ウェルから培地を吸引する。ゲンタマイシン処理細胞を2ミリリットルの冷たいPBSで2回洗浄する。
肺上皮細胞に負荷が入った細菌は、ドロッププレート法、qRT-PCR法、またはフローサイトメトリーによって検出することができる。肺上皮細胞の各ウェルに細胞ライシスバッファーの1ミリリットルを追加します。.1から10から10、000までの範囲の細胞溶菌の連続希釈を修復する。
次にTSBオーガープレートを接種します。16時間のインキュベーションの後、細菌コロニーの数を数えることによって、肺上皮細胞に存在したコロニー形成ユニットの数を決定する。肺上皮細胞の各ウェルにグアニジニウム・チオシアネート・ライシス緩衝液を0.35ミリリットル加える。
セルスクレーパーでセルを収集します。ライセートをマイクロ遠心分離チューブにピペットし、ピペットとやさしく混ぜます。0.35ミリリットルの新鮮な準備をして、70%エタノールをlysateに加え、よく混ぜます。
すべてのサンプルを2ミリリットルの回収チューブに入れたスピンカラムに移します。コレクションチューブを10,000倍G、摂氏20~25度で30秒間遠心分離します。回収管のバッファーを廃棄し、0.7 ミリリットルの洗浄バッファーでカラムを洗浄します。
列を10,000倍のGで30秒間遠心分離します。0.5ミリリットルのバッファーでカラムを2回洗います。10,000回Gで遠心分離を2分間繰り返します。
カラムを新しい1.5ミリリットルの回収チューブに入れ、30~50マイクロリットルのRNaseフリー水を加えます。チューブを10,000倍Gで1分間遠心した後、流れを集め、RNA濃度を測定します。20マイクロリットル逆転写反応の準備のために、反応バッファーの10マイクロリットル、逆転写酵素およびRNaseフリー水の1マイクロリットルを有する総RNAの1マイクログラムを作る。
メーカーのプロトコルに従って、37°Cで1時間、摂氏95度で5分間逆転写反応を行います。次に、各cDNAサンプルの1マイクロリットルを、サイバー色素を含むマスターミックスの5マイクロリットルと、各200ナノモル特異的プライマーの1マイクロリットルと混合します。20マイクロリットルの総容量のための水を加えます。
メーカーの推奨に従って PCR 分析を実行します。次に、比較CT法を用いて式を決定します。BEAS-2B細胞では、細胞を3時間4%CSEで処理しても生存率は大きく変化しなかった。
シュードモナス感染として1時間も生存率に実質的に影響を及ぼさなかった。最後に、培養培地中のシュードモナを殺すためにゲンタマイシンを使用しても、細胞の生存率に統計的に有意な影響を及ぼさなかった。ドロッププレート法により測定したとおり、BEAS-2B細胞における細菌感染はCSEによる処理により実質的に増加した。
同じことがHSAECのCSE治療にも当てはまり、CSE処理BEAS-2B細胞の細菌感染も、16S rRNAの存在量を定量化するためにRT-PCRを用いて評価し、シュードモナス・フルギノーサの増加を示した。CSEで処理され、シュードモナスフルオレセンスミグラに感染したBEAS-2B細胞を、509ナノメートルのフローサイトメトリーで分析した。
結果はまた、CSE治療が細菌感染を増加させることも示した。蛍光顕微鏡の結果、シュードモナスフルオレセンスミグラ感染実験において、GFP標識細菌がBEAS-2B細胞と共局化することが示された。細胞は、人間の行動を模倣し、肺上皮細胞に対するタバコの煙の影響を直接研究することを可能にするロボット喫煙でタバコの煙にさらされる可能性があります。
この技術は、肺感染症の文脈で他の細胞タップでタバコの煙を探索するために使用することができます。記載されたアプローチは、タバコの喫煙後回り肺損傷およびC0PD余分に対する効果的な治療法の発達の基礎となる
