Name: real-time imaging of ccl5-induced migration of periosteal skeletal stem cells in mice
Uploaded: 2020-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice at JoVE.com

この作品は、テキサス州骨疾患プログラム・オブ・テキサス賞、キャロライン・ヴィース法律基金賞、国立衛生研究所のNIAMSによって、賞番号R01 AR072018、R21 AG064345、R01 CA221946からD.P.の下で支援されました。 BCM光イメージングおよびバイタル顕微鏡コアのM.E.ディキンソンとT.J.ヴァダカン、NIH(AI036211、CA125123、DK056338)からの資金提供を受けたBCMアドバンストテクノロジーコアに感謝します。
.

すべてのマウスは病原体のない状態で維持され、すべての手順はベイラー医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. マウスの準備
<ol><li>クロスMx1-Cre17とRosa26-loxPストップロックスP-tdTomato(トム)18マウス(ジャクソン研究所から購入)は、αSMA-GFPマウス(イヴォ・カラジッチ博士とヘンリー・クローネンバーグ博士が提供)を使用してMx1-Cre+Rosa26トマト+α SMA-GFP+(Mx1/トマト/αFP+)を生成します。</li>
	<li>Mx1-Cre誘導の場合、1日おきに25mg/kg pIpCを10日間注射します。</li>
	<li>野生型C57BL/6マウス(WT-BMT)19から1 x 106全骨髄単核細胞の静脈移植の1日前に9.5Gyでマウスを照射する。</li>
	<li>6〜8週間の回復の後、被験者マウスは、以下に説明するペリオスチール細胞移行プロトコルのin vivoイメージングに。 注: Mx1-Creマウスの照射およびWT-BMTは、傷害に反応する可能性のある内因的に Mx1標識造血細胞を排除するために必要です。照射後6~8週間、宿主の造血細胞数は<5%であり、したがってイメージング19の準備ができている。</li>
</ol>2. マウスの拘束とイメージングマウント
<ol><li>50 mL の円錐チューブでマウスの拘束を作成します(図 1A)。<ol>
<li>尖ったはさみを使用して、円錐形の底に穴を突きます。底部の穴から円錐形の上端にカットします(カット側が拘束の上部になります)。</li>
		<li>前のカットと平行に約4〜5cmの長さのカットを行い、拘束の上部から半分下(〜2cm)します。円錐形のこのセクションを削除し、エッジを滑らかにする必要がありました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>調整可能な角度プレート、0.5インチの光ポスト、0.5インチポストの直角クランプ、0.1875インチ16進数(図1B および 材料表)を使用して、円錐形のチューブイメージングマウントを構築します。<ol>
<li>角度プレートを35°の角度に調整します。角度プレートの左側で、光学ポストをプレートの背面から2番目の穴にねじ込みます。</li>
		<li>調整可能なプレートの右側に、バネ付きの 0.1875 インチ六角ロック 0.25 インチのつまみねじをプレートの前面と最後の穴から 2 番目の穴に挿入します。直角クランプは、コニカルマウスの拘束を所定の位置に固定するために、光学ポストと一緒に使用されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 術前手術の手術
<ol><li>マウス麻酔<ol>
<li>疼痛管理のために、手術前に持続的放出ブプレノルフィン(1mg/kg BW)30~60分でマウスを皮下注射します。</li>
		<li>37.5 mg/mLケタミン、1.9 mg/mLキシラジン、および0.37mg/mLアセプロマジンを含むげっ歯類III CCM併用(コンボIII)麻酔を使用してマウスを麻酔する。マウスの適切な投与量は体重1kgあたり0.75〜1.50 mLである。投与量は30〜45分続く。</li>
		<li>マウスを麻酔したら、眼の脱水を防ぐために、無菌綿棒で眼に眼軟膏を適用します。</li>
		<li>長期イメージング(>45分)の場合、麻酔を再び投与し、適切な麻酔深さを次のように維持する。<ol>
<li>1 mL シリンジを十分な量のコンボ III で準備して、計画されたイメージング期間(追加のセデレーションの 30 分あたり 0.75 mL/kg BW)の麻酔を維持します。12インチのチューブセットを備えた25Gバタフライニードル注入を注射器に取り付け、チューブと針を通して麻酔薬を押します。</li>
			<li>腹腔内に蝶の針を挿入し、針を所定の位置にテープで貼ります。 注:これは、画像処理中に追加のコンボIIIを管理する方法であり、動物を動かしたり、視界を乱したりする必要はありません。</li>
		</ol>
</li>
		<li>手順全体を通して37°Cに保たれた加熱パッドで熱サポートを提供します。長時間のイメージング(>1時間)のために、追加の流体サポートが必要になります。 補足液は、イメージング中に追加のコンボIIIをI.P.または33 mL /kg生理食物(0.9 NaCl)皮下に提供することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>手術部位のマウス拘束と準備<ol>
<li>頭の上からできるだけ多くの髪を除去するためにバリカンを使用してください。剃毛部位に脱毛クリームを塗布し、外科部位の残りの毛を取り除きます。</li>
		<li>つま先のピンチに対する応答が不足している場合に、マウスが完全に麻酔状態になっていることを確認します。15分後、マウスが完全に麻酔されていない場合は、コンボIII(<0.75 mL/kg BW)の第2の小さな用量を投与する。</li>
		<li>拘束尾から最初にマウスを置き、鼻が円錐形の端にわずかに掛かるようなほど後方にスライドさせます。</li>
		<li>医療テープを使用して、前足を円錐管の底にテープで貼ります。</li>
		<li>35°の角度に設定され、直角クランプを使用して固定されたイメージングマウントにマウスを使用した円錐チューブを配置します(図1C)。</li>
		<li>マウスがイメージングマウントで固定されたら、ベタジンスクラブと70%イソプロピルアルコールの交互スクラブで手術部位3xをきれいにします。繰り返しますが、動物が完全に鎮静されていることを確認してください。</li>
		<li>マウスをきれいな吸収パッドに移動し、マウスの上にドレープを置いて、大きな無菌フィールドを作成します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 外科的処置
<ol><li>開口切開<ol>
<li>細かい先端の鉗子を使用して、すぐに右耳に内側に皮膚を拾う。マイクロディシスはさみで、鉗子に保持されている皮膚を切断します。 注: 上記の方法を使用して切開を起用すると、手順後の縫合に適した丸い切開が作成されます。</li>
		<li>左耳(<1cm)に向かって最初の切開から始まる横断切開を行います。 最初の切開から始めて、動物の鼻に向かって別の切開を行います(右目を通り過ぎるのは〜2〜3mm)。</li>
		<li>鉗子とはさみを使用して皮膚を骨膜から分離し、皮膚とカルバリア骨膜を分離する結合組織を穏やかに切断する。</li>
		<li>滅菌綿棒を使用して、皮膚のフラップの上部にいくつかの眼科軟膏を適用します。 皮膚のフラップをそっと拾い、左目の上に折りたたみます。矢状縫合糸と冠状縫合糸の交点ははっきりと露呈する必要があります(図1E)。 注:眼科軟膏は、皮膚のフラップを所定の位置に保つために使用されます。</li>
		<li>無菌PBSで開いた表面を洗い流して、血液や残留毛の領域をきれいにします。 注:必要に応じて、細かいチップの鉗子を使用して、フラッシュ後に残っているヘアを除去しますが、骨膜を損傷しないように注意してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>微小骨折<ol>
<li>カルヴァリアに微小骨折を発生させるには、29Gインシュリンシリンジのプランジャーを取り外し、300〜400uLマークの周りにシリンジのバックエンドを切断します。 注: このステップは、損傷を生成する際に解剖スコープの下で操縦することが容易になります。</li>
		<li>傾斜角の先端(1~2針幅)を、冠状縫合糸から鼻の方に、矢状縫合糸の右側に1~2本の針幅を置きます(図1E)。</li>
		<li>シリンジを時計回りに軽く回転させ、反時計回りに数回回転させます。 注:若いマウスでは、円形の微小骨折を作成するために非常に少量の下降圧力が必要です。これは出血を引き起こし、イメージングを妨げるので、針が脳に浸透しないように注意してください。</li>
		<li>27G針を使用して微小骨折を~0.4mmに広げます。骨片が微小骨折に残っている場合は、PBSで領域をフラッシュします。骨片が依然として微小骨折に残っている場合は、29Gの針を使用して穏やかにそれらをすくい取ります。</li>
		<li>ステップ 4.2.1 ~ 4.2.4 を繰り返して、矢状縫合の左側に損傷を起こす。 注: この時点で、2 つのオプションがあります: 1) すぐに CCL5 処理 (セクション 4.3) とイメージング (セクション 5) に進みます。または2)セクション6の術後処置に従って外科部位を閉じる。24時間後、再びマウスを麻酔し、手術視力を再開し、CCL5(セクション4.3)で傷害を治療し、生体内イメージング(セクション5)および術後ケア(セクション6)を行う。</li>
	</ol>
</li>
	<li>CCL5治療<ol>
<li>RANTES(100 ng/mL)の在庫から、基膜マトリックス(材料表)を使用して10 ng /mLの溶液を作ります。この溶液を氷の上に置いて、マトリックスを液体の形に保ちます。</li>
		<li>2~20 μLのピペットを使用して、各損傷を2~20 μL(10 ng/μL)で処理します(このピペットチップは、粘性液体を使用する場合にはより効果的です)。マトリックスを固めます。</li>
		<li>マトリックスが固まったら、カルバリアを皮膚フラップで静かに覆い、組織が脱水にならないようにします。イメージングの前に1時間インキュベートする。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 生体内イメージング
<ol><li>顕微鏡の設定<ol>
<li>マルチフォトンレーザー(フェムト秒チタンサファイアレーザー)をオンにします。波長を880 nmに設定し、骨の第2高調波発生(SHG)イメージング(440 nm)の電力を調整します。</li>
		<li>GFPおよびtdTomato発現細胞の励起用に、488 nmおよび561 nmの固体レーザーをオンにします。</li>
		<li>第2ハーモニック発生(405~455 nm検出)およびGFP(505~550 nm検出)信号用のPMT(光増倍管)検出器をオンにします。トマト(590-620 nm検出)信号のHyD 3検出器をオンにします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マウンティング<ol>
<li>マウスをスコープに移動する前に、マウスの頭部の後ろを軽く押してカルバリアのビジュアルプレーンを確認します。平面がレベルでない場合は、マウスの拘束を左または右に軽く回転させることで、位置を調整します。 注: これは、十分な画質を確保するための重要な手順です。</li>
		<li>滅菌2%メチルセルロースを水中(w/v)に塗布して、カルバリアと皮膚のフラップ全体を覆い、組織の乾燥を防ぎます。</li>
		<li>XYZ軸の電動顕微鏡ステージにマウスを置きます(図1G)。蛍光光を用いて、マウスを1)顕微鏡に向くように、2)角縫合糸と矢状縫合糸の交点がステージの中心参照点になるように位置合わせする。</li>
		<li>ガラスカバーを撮像領域に置き、位置合わせを再確認します(図1H)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>タイムラプスイメージング<ol>
<li>低倍率レンズ(NA = 0.95の25倍の水浸し目的)を使用してカルバリアをスキャンします。矢状および冠状縫合線の交差の参照画像を取得します。</li>
		<li>細胞からのSHGおよび蛍光信号を使用して、各傷害視力を見つけ、XYZ座標と矢状および冠状縫合糸からの距離を記録します(図2B)。</li>
		<li>長期的なイメージングのために、コロナまたは矢状縫合線の位置を選択します。イメージング中の参照から、この領域の詳細なZスタック画像を撮ります。 注:縫合線は既知のP-SSCニッチを表すので、カルバリアの損傷に応答して細胞が移行する場所です。</li>
		<li>タイムラプスソフトウェアの設定を使用して、1分ごとに1時間ごとに画像を記録します。スナップショット間の時間で、現在の視野と初期視野を比較します。これらの値が異なる場合は、Z スタック イメージを使用して、視野を調整する必要がある方向を決定します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 術後動物のケア
<ol><li>イメージング後、露出したカルバリアを無菌PBSでリンスし、メチルセルロースを除去する。</li>
	<li>切開を閉じるには、皮膚フラップをカルバリアの上にそっと置きます。無菌綿棒を使用して、残りの眼軟膏を除去し、切開部位を乾燥させます。</li>
	<li>モノフィラメントナイロン5-0サイズの非吸収性縫合糸をC-1逆切断針付きで使用し、外科部位を閉じる。滅菌綿棒を使用して、閉切開にトリプル抗生物質軟膏を塗布します。 注:瘢痕化は高品質の縫合技術および最低出血と減少する。</li>
	<li>暖かい表面にきれいなケージにマウスを置き、胸部の不全が達成されるまで15分ごとにチェックします。</li>
	<li>第2回投与後のブプレノルフィン72時間を投与する。</li>
	<li>縫合糸が取り除かれるまで、寄り添う挙動、フリルファー、および/または外見の欠如を毎日監視します(〜1週間)。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+healing:+mechanisms+and+interventions.">Fracture healing: mechanisms and interventions.</a> Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).</li><li>Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteal+cells+are+a+major+source+of+soft+callus+in+bone+fracture.">Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture.</a> Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).</li><li>Colnot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+cell+fate+decisions+within+periosteum+and+bone+marrow+during+bone+regeneration.">Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).</li><li>Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+periosteum+for+skeletal+regeneration:+the+stem+cell+that+lies+beneath.">Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath.</a> Bone. 70, 10-18 (2015).</li><li>Duchamp de Lageneste, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteum+contains+skeletal+stem+cells+with+high+bone+regenerative+potential+controlled+by+Periostin.">Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin.</a> Nature Communications. 9 (1), 773 (2018).</li><li>Olivos-Meza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+of+periosteum+with+TGF-beta1+in+situ+enhances+the+quality+of+osteochondral+tissue+regenerated+from+transplanted+periosteal+grafts+in+adult+rabbits.">Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits.</a> Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).</li><li>Debnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+periosteal+stem+cell+mediating+intramembranous+bone+formation.">Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation.</a> Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).</li><li>Ransom, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axin2-expressing+cells+execute+regeneration+after+skeletal+injury.">Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury.</a> Scientific Reports. 6, 36524 (2016).</li><li>Ouyang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prx1+and+3.2kb+Col1a1+promoters+target+distinct+bone+cell+populations+in+transgenic+mice.">Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice.</a> Bone. 58, 136-145 (2013).</li><li>Wilk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+Calvarial+Skeletal+Stem+Cells+Expressing+PRX1+Reside+Exclusively+in+the+Calvarial+Sutures+and+Are+Required+for+Bone+Regeneration.">Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).</li><li>Ortinau, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Functionally+Distinct+Mx1+alphaSMA++Periosteal+Skeletal+Stem+Cells.">Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).</li><li>Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+gene+expression+identifies+distinct+molecular+signatures+of+bone+marrow-+and+periosteal-skeletal+stem/progenitor+cells.">Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 13 (1), 0190909 (2018).</li><li>Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+remodeling+during+fracture+repair:+The+cellular+picture.">Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli1+identifies+osteogenic+progenitors+for+bone+formation+and+fracture+repair.">Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).</li><li>Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin-receptor-expressing+mesenchymal+stromal+cells+represent+the+main+source+of+bone+formed+by+adult+bone+marrow.">Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).</li><li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells.">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).</li><li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+marrow+MSCs+are+dynamic,+fate-restricted+participants+in+bone+maintenance+and+regeneration.">Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).</li><li>Nitzsche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+MSC+Adhesion+Cascade-Insights+into+Homing+and+Transendothelial+Migration.">Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration.</a> Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).</li><li>Adler, J., Pagakis, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+image+distortions+due+to+temperature-related+microscope+stage+drift.">Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift.</a> Journal of Microscopy. 210, 131-137 (2003).</li><li>Roberts, S. J., Ke, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anabolic+Strategies+to+Augment+Bone+Fracture+Healing.">Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing.</a> Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).</li></ol>

L.C O.とD.P.は、「骨修復におけるペリオスチール骨格幹細胞」(BAYM)と題する保留中の特許を開示しています。P0264US.P1)。残りの著者は、競合する利益を宣言しません。

骨治癒の間、骨胞細胞は傷害callus3内の新たに分化した軟骨細胞および骨芽細胞の主な供給源である。骨髄と同様に、骨形成/軟骨性SSCも骨膜4,5,6で同定されている。内因性P-SSC機能特性の評価は技術的に困難です。多くの場合、SSCの回遊性ダイナミクスはインビトロで評価され、対応するin vivoシステムの?...

骨折修復は、胚性骨格の発達やリモデリングとは異なる動的な多細胞プロセスです。この過程で、損傷した組織からの傷害シグナルの誘導は、骨格幹細胞/前駆細胞の迅速な導入、増殖、およびその後の分化が続き、骨折の全体的な安定性および固定化に重要である1。特に、骨折治癒の初期段階では軟質カルス形成が必要であり、これは主にペリオスチールの居住細胞2に起因する。骨が負傷すると、骨膜細胞のサブセットが急速に反応し、carus3内の新たに分化した軟骨中間体および骨芽細胞に寄与し、骨膜内に明確な骨格幹細胞/前駆細胞集団の存在を含む。したがって、骨膜内に存在する骨格幹細胞(SSC)の同定および機能的特徴付けは、変性骨疾患および骨欠損に対する有望な治療アプローチを構成する。
SSCは、骨髄を含む複数の組織の位置に存在すると考えられている。骨髄と同様に、骨形成/軟骨性SSCも骨膜4,5,6で同定されている。 これらの骨膜SSC(P-SSC)は胎児の骨の発達の間に初期間葉系の系統マーカー(すなわち、Prx1-Cre5、Ctsk-Cre7、およびAxin2-CreER8)で標識することができる4,7,8,9,10。これらの単一の遺伝的系統追跡モデルの重要な制限は、標識された細胞集団内に実質的な不均一性があることである。さらに、ラベル付きSSCと生体内の子孫を区別することはできません。この制限に対処するため、我々は最近、骨髄SSC(BM-SSC)11からP-SSCを明確に可視化するためにデュアルレポーターマウス(Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+)を開発しました。このモデルでは、P-SSCはMx1+αSMA+デュアルラベリングでマークされ、より分化されたMx1+細胞は骨髄、内層および骨層の表面、および皮質および骨柱骨11,12に存在すると判断されました。
複数のサイトカインおよび成長因子は骨のリフォームおよび修復を調節することが知られており、重要なセグメント欠陥における骨格修復の増強について試験された1,13。しかし、骨室の物理的障壁の破壊によって生じる傷害モデルの細胞複雑さのために、これらの分子が治癒中の内因性P-SSCの移動および活性化に及ぼす直接的な影響は不明である。SSCの機能的特性および回遊性の動態は、多くの場合、他の細胞集団における移行を誘導することが知られているサイトカインまたは成長因子と組み合わせて、トランスウェルまたはスクラッチアッセイを行うことによってインビトロで評価される。従って、これらのインビトロ実験の結果を、対応するin vivoシステムでの応用に対する解釈は困難である。現在、骨格幹細胞/前駆細胞の移動のインビボ評価は、通常、リアルタイムでは観察されません。むしろ、それは骨折後の固定された時点で測定される5、7、14、15、16。
この方法の制限は、移行が単一セル レベルで評価されないことです。むしろ、細胞集団の変化によって測定される。最近では、生きた動物の生体内顕微鏡検査や追加レポーターマウスの生成が進んでいるため、生体内での個々の細胞の追跡が可能になりました。生きた動物の生体内顕微鏡を用いて、Mx1/Tomato/αSMA-GFPマウスの24~48時間の損傷後のカルバリア縫合糸ニッチから骨損傷へのP-SSCの明確な移行を観察した。
CCL5/CCR5は最近、早期傷害反応の間にP-SSCの採用および活性化に影響を与える規制メカニズムとして同定された。興味深いことに、傷害に対する実質的なP-SSC移行の検出はリアルタイムでなかった。しかし、CCL5による損傷の治療は、リアルタイムでキャプチャできるP-SSCの堅牢で方向性的に異なる移行を生み出します。したがって、このプロトコルの目的は、CCL5での処理後にリアルタイムでP-SSCのin vivo移行を記録するための詳細な方法論を提供することにある。

<table><tbody><tr><td>&amp;frac12;&amp;rdquo; optical post</td><td>ThorLabs</td><td>TR2</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27G needle</td><td>BD PercisionGlide</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>29G insulin syringe</td><td>McKesson</td><td>102-SN05C905P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conicol tube</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>For mouse restraint</td></tr><tr><td>Adjustable angle plate</td><td>Renishaw</td><td>R-PCA-5023-50-20</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Alcohol wipes</td><td>Coviden</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>betadine surgical scrub</td><td>Henry Schen</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine SR-LAB</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>1mg/mL Sustained Release</td></tr><tr><td>Combo III</td><td>Obtained from staff veterinarian</td><td>N/A</td><td>37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-545-87</td><td>24 x 40 premium superslip</td></tr><tr><td>Fine tip forcepts</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>KetaVed</td><td>50989-161-06</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8MP with DM6000CFS</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>344500101</td><td></td></tr><tr><td>Medical tape</td><td>McKesson</td><td>100199</td><td>3&quot; x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)</td></tr><tr><td>Methocellulose</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19560</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection scissors</td><td>FST</td><td>1456-12</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>Anaheim automation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Nonabsorbable sutures</td><td>McKesson</td><td>S913BX</td><td>monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle</td></tr><tr><td>Opthalmic ointment</td><td>Rugby</td><td>0536-1086-91</td><td></td></tr><tr><td>RANTES</td><td>Biolegend</td><td>594202</td><td>10 &amp;micro;g/50 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Right-angle clamp for &amp;frac12;&amp;rdquo; post, 3/16&amp;rdquo; Hex</td><td>ThorLabs</td><td>RA90</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Spring-loaded 3/16&amp;rdquo; Hex-locking &amp;frac14;&amp;rdquo; thumbscrew</td><td>ThorLabs</td><td>TS25H</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Sterile cotton swabs</td><td>Henry Schen</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>Sterile DPBS (1x)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sterile drapes</td><td>McKessen</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>Surgical gloves</td><td>McKessen</td><td>3158VA</td><td></td></tr><tr><td>Triple antibiotic ointment</td><td>Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc.</td><td>51672-2120-2</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer blood collection set</td><td>BD</td><td>REF 367298</td><td>25G butterfly needle infusion set with 12&quot; tubing</td></tr></tbody></table>

real-time imaging of ccl5-induced migration of periosteal skeletal stem cells in mice

ペリオステル骨格幹細胞(P-SSC)は、生涯にわたる骨の維持と修復に不可欠であり、骨折治癒を強化するための治療法の開発に理想的な焦点となっています。 ペリオスチール細胞は、骨折治癒のために新しい軟骨細胞および骨芽細胞を供給するために傷害に急速に移行する。従来、細胞遊走を誘導するサイトカインの効能は、トランスウェルまたはスクラッチアッセイを行うことによってインビトロで行われてきただけであった。多光子励起を用いた生体内顕微鏡の進歩に伴い、CCL5として知られるCCR5リガンドによる1)P-SSCが回遊性遺伝子CCR5および2)治療を行い、CCL5に応答して骨折治癒とP-SSCの移行を改善することが最近発見された。これらの結果はリアルタイムでキャプチャされています。ここで説明するプロトコルは、CCL5による治療後の傷害に向けて、カルバリアル縫合糸骨格幹細胞(SSC)ニッチからのP-SSC移行を可視化するプロトコルである。このプロトコルは、マウス拘束とイメージングマウントの構築、マウスカルバリアの外科的準備、カルバリア欠損の誘導、およびタイムラプスイメージングの取得を詳述する。

骨格前駆物質は、回遊性または循環器の可能性を有することが提案されている20。最近、Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+(Mx1/Tomato/αSMA-GFP)レポーターマウスが生成され、P-SSCはMx1+α SMA+デュアルラベリング(図2A、B)でマークされています。Mx1+α ...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice at JoVE.com

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

このプロトコルは、生きた動物の生体内顕微鏡を用いてリアルタイムでCCL5媒介性骨格細胞移動の検出を記述する。

マウスにおけるペリオスチール骨格幹細胞のCCL5誘導性移行のリアルタイムイメージング

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

2.2K ビュー.  Baylor College of Medicine. このプロトコルは、生きた動物の生体内顕微鏡を用いてリアルタイムでCCL5媒介性骨格細胞移動の検出を記述する。

ビデオ: Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

発生生物学

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

神経科学

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

生体内でひと脂肪由来間葉系幹細胞が脂溶性膜の蛍光色素をラット膝関節変形性関節症モデルでの追跡

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

シーケンシャル<em&gt;インビボ</em&gt;骨折修復中に、骨形成幹細胞/前駆細胞のイメージング

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

医学

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

マウス骨髄単球の追跡<em&gt;インビボ</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

免疫・感染学

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル<em&gt;インビボ</emマウス骨髄内&gt;細胞トラッキング

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

末梢血幹細胞移動の解析のためのマウス精巣挙筋で微小循環の生体顕微鏡

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

生物学

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

コルチの器官に向かう細胞の移動を探るインビトロタイムラプスライブセルイメージング

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

マウスにおけるペリオスチール骨格幹細胞のCCL5誘導性移行のリアルタイムイメージング

要約

さらに動画を探す

この動画の章