Flypubアッセイは、アルコールの影響下で抑制された行動を測定します。それによりアルコール使用障害の機械研究を促進する。アルコールは、世界で最も容易に入手可能で広く乱用されている薬物の一つです。
しかし、アルコール使用障害の根底にある神経生物学的メカニズムは不完全に理解されている。フルーツフライ、ショウジョウバエメラノガスターは、幸福感、移動、阻害、および沈殿に対するエタノールの影響を研究するために広く使用されています。また、寛容さ、感作、エタノールシークなどの中毒に関連する行動の長期的かつ永続的な変化を研究するためにも使用されます。
ショウジョウバエや他の動物モデルの多くの研究は、エタノールの運動活性化効果に焦点を当てています。エタノールの明確な効果は行動阻害である。しかし、それは研究がかなり過小評価されています。
この重要な問題に対処するため、エタノールの影響下での抑制行動を測定するFlypubアッセイを開発しました。Flypubチャンバーを組み立てるには、丸いボトルを取り、カミソリの刃で25ミリリットルのマークの底部を切断します。熱いはんだ付け鉄を使用して50ミリリットルのマークに穴を作成します。
これは、ハエが導入されるアクセスポイントです。直径54ミリの丸いメッシュを75ミリリットルのマークに置き、熱い接着剤を使用して固定します。透明なプラスチックシートを開いた底端に直径70ミリメートルに置き、熱い接着剤を使用して固定します。
プラスチックラウンドがしっかりと底に取り付けられていることを確認するために、重量を使用して圧力ダウン。33のグループにオスのハエを収集します。それらを食品バイアルの側面に置きます。
少なくとも50%の相対湿度と12時間の光、12時間の暗いサイクルをエタノール暴露の前に2日間の25°Cインキュベーターに入れます。ビデオ録画用のライト、コンピュータ、カメラをオンにして、Flypubアッセイステーションを準備します。実験のセットのために6つのパブを準備します。
1から6までの数字でラベルを付けます。小さな漏斗を使ってハエをパブにそっと紹介します。テープを使用してパブを閉じます。
ハエを10分間順応させます。順応の間、カメラの焦点を調節し、順応の最後の5分を記録します。順応の間エタノール配達のための綿のパッドを準備する。
綿パッドを4つの等しい象限にカットし、コーナーをトリミングしてペトリ皿に収めます。ペトリ皿に綿パッドを加えます。綿パッドに95%エタノールを1ミリリットル加えます。
エタノール溶液はパッドの全領域に均等に分配されるようにしてください。ペトリ皿をラボワイプで素早くカバーします。各パブの下にペトリ皿を含むエタノールを慎重に置きます。
ステージ上のパブを整列します。記録を開始し、同時にタイマーを開始します。ハエが求愛や移動を停止するまで記録します。
ハエの90%以上が鎮静されたときにペトリ皿を含むエタノールを取り除きます。鎮静したハエをゆっくりとフードバイアルに戻します。インキュベーターに戻します。
前の手順を 24 時間ごとに 6 日間連続して繰り返します。メディア プレーヤーを使用してビデオを開きます。その後、10秒ごとに求愛活動に従事する男性の数をスコア。
得点する求愛活動には、一方的な翼延長、求愛チェーン、求愛サークル、腹部の曲げおよび取り付けが含まれます。表示されるフライ動作の代表的な記録です。男性が多くの活動を示さない順応中。
男性が散発的な求愛を示す最初の暴露の間に。そして、男性が活動の求愛を表示する6回目の暴露の間に。求愛を表示する男性の数を 10 秒のブロックで入力します。
求愛する男性の最大数を、代表的なデータポイントとして3つの連続した10秒のブロックに使用します。最も高い値を持つ10の連続したデータポイントの平均は、パブあたりの男性間求愛の割合を表します。野生型カントン-Sは、エタノール曝露を繰り返した際に、徐々に求愛を抑制する活動を増加させた。
エタノールの抑制効果に対する行動感作を表す。チラミンβ-ヒドロキシラーゼ、TβHを欠いているハエを試験することにより、感作におけるタコパミンの役割を調べ、オクトパミンに欠損した。カントン-Sと同様に、TベータH突然変異体は繰り返しエタノール暴露に対するエスカレート応答を示したが、減少したレベルであった。
TβHとカントン-Sを比較した際、TβH変異体の雄は、各暴露においてカントン-Sの男性よりも阻害されない求愛度が低いことを観察し、オクトパミンが感作にとって重要である可能性があることを示した。Flypubアッセイを使用してエタノールによって誘導される行動を設定、実施、分析することができます。留意点としては、パブの適切な組み立てが挙げられます。
2つ、一貫したエタノール送達、および3つの、正確で公平な行動スコア。フライパブアッセイには多くの利点があります。それは簡単で、セットアップに安価で、学ぶことが容易です。
また、複数のハエ群を同時にアッセイすることができ、この研究は遺伝的または実験的操作の効果を特定することを容易にする。Flypubアッセイは、小学生から高校、学部生、大学院生、ポストドキュメント、教員を含むすべてのレベルの実験者に非常に魅力的です。要約すると、Flypubアッセイは、アルコール使用障害に寄与する分子プレーヤー、細胞経路、脳回路、および危険因子を同定することを可能にする。
