この方法は、幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズを定量化する方法を提供する。また、肝臓の成長と開発に対する遺伝的および薬理学的操作の影響の評価を可能にします。この技術は、肝臓だけでなく、腸や膵臓を視覚化し、測定するための迅速かつ正確な方法を提供します。
肝臓のサイズを定量化することに加えて、この解剖法は、その場でのハイブリダイゼーションまたは共焦点イメージングのために肝臓、腸、膵臓を調製するのに役立ちます。実験用幼虫のデスクラッキングを試みる前に、実験以外のサンプルの練習に十分な時間を費やし、有意な成功率を持っていることを確認してください。周囲の器官を乱さずに皮膚を除去するためには、ゼブラフィッシュの幼虫や鉗子の適切な向きと動きを視覚化することが重要です。
受精後3~7日で、幼虫を安楽死させた後、ガラスピペットとピペットポンプを使用して、2ミリリットルチューブに最大15匹の幼虫を採取します。幼虫を氷の上で冷たい1X PBSの1ミリリットルで2回洗います。ガラスピペットとピペットポンプを使用してできるだけ多くのPBSを取り出し、PBSに冷たい4%PFAの1ミリリットルを加えます。
少なくとも一晩は穏やかな揺れで摂氏4度でインキュベートします。ガラスピペットとピペットポンプを使用して、チューブからPFAを取り出し、冷たいPBSの1ミリリットルで3回リンスします。すすいの間に5分間ロックします。
9ウェルラウンドボトムガラス皿の1つの井戸にPBSでいくつかの幼虫をピペット。顕微鏡下で、細かい鉗子を使って肝臓を取り巻く皮膚を取り除き、片方の幼虫を背中に保持し、頭の両側をできるだけ穏やかにつかみます。その後、ちょうど心臓の上に皮膚をつかむために、他の手で非常に細かい鉗子を使用しています。
魚の左右の皿の底にある魚の尾に向かって斜めに皮膚を引き下げます。反対側についても繰り返します。皮膚のフラップをつかみ続け、肝臓の上または近くにあるすべての皮膚とメラノフォアが取り除かれるまで引き下げます。
黄身が受精後5〜6日間存在する場合は、魚を背中に細かい鉗子で保持し、非常に細かい鉗子を使って黄身を穏やかに突き出して、黄身を1枚で持ち上げます。3〜4匹のDPF幼虫の場合は、魚を背中に細かい鉗子で保持し、非常に細かい鉗子を使用して腹側から始まる黄身をなでます。黄身を粉々に削り取ります。
ガラスピペットとピペットポンプを使用して、解剖した幼虫を2ミリリットルチューブに新鮮で冷たいPBSに入れます。幼虫を取り付けるには、清潔でプラスチック製のペトリ皿の蓋に3%のメチルセルロースを数ミリリットル注ぎます。ガラスピペットとピペットポンプを使用してメチルセルロースに幼虫を加え、幼虫と共にPBSをできるだけ少なくします。
低倍率で解剖顕微鏡の下で、彼らは左に向かって彼らの右側に横たわっているように、魚の向きを微調整するために細かい鉗子を使用しています。撮影する魚がもう一方の目の上に直接片方の目と完全に整列していることを確認します。魚の尻尾が曲がっている場合は、魚が平らに横たわるように、鉗子で強引につまんで尾を取り除きます。
高倍率にズームインし、肝臓に焦点を当てます, 肝臓の輪郭がはっきりと見えるように.[イメージのキャプチャ]ボタンを押して、画像をスナップしてファイルを保存します。すべての魚に対して繰り返し、各画像の倍率が同じであることを確認します。
同じ倍率を使用してマイクロメーターの写真を撮ります。潜在的な調査者の偏見を避け、科学的な厳しさを促進するために、すべての肝臓の写真を盲目にするためにプログラムRを使用するには、ランダムにファイルの名前を変更し、元のファイル名と対応するブラインドファイル名のリストを含むランダム化ファイルを作成します。ランダム化されたファイルを順に開きます(ファイル 1 から始まります)。
フリーハンド選択ツールを選択し、各肝臓の概要.各肝臓の領域を測定するためにコントロールMを押します。皮膚が残っているために正確に測定できない肝臓については、黄身が焦点を合わせていないか、または無傷でない場合は、プレースホルダー測定を挿入します。
テキスト ファイルに測定値を保存します。ブラインドを解除してデータを分析するには、測定ファイルとランダム化ファイルをスプレッドシートプログラムで開きます。測定ファイルに新しい列を挿入し、ランダム化ファイルを使用して、ブラインドファイルの元のファイル名を追加します。
このファイルをブラインドなし測定ファイルとして保存します。データを元のファイル名で並べ替えます。写真が十分ではなかった肝臓の測定値を除外します。
必要に応じて、計測値を必要なスケール(平方ミリメートル)に変換します。画像処理ソフトウェアでスケール バーを開きます。[直線] ツールを使用して、スケール バーの 1 ミリメートルを計測します。
画像処理ソフトウェアは、肝臓と同じ単位で測定し、変換因子を与えます。ブラインドなし測定ファイルの測定値を変換するには、変換係数を使用します。平均と標準偏差を決定し、P値を計算します。
受精後6日間で、非トランスジェニックゼブラフィッシュの幼虫は、腸の上に生来の位置と肝臓の形を示した。トランスジェニックゼブラフィッシュは、彼らの非トランスジェニック兄弟と比較して大幅に肝臓のサイズを増加しています。.不十分な画像とマイクロメータの例を以下に示します。
肝臓を覆う皮膚を持つ幼虫、肝臓を覆い隠す幼虫、肝臓の一部がつままれた幼虫、肝臓が脱臼して落ちる幼虫、肝臓が欠けている幼虫、識別が困難な肝臓の輪郭を持つ幼虫、不適切な位置付けの幼虫。この手順を試みる場合, 肝臓への損傷を防ぐために小さく、制御された動きを使用することが重要です..また、明視野顕微鏡に加えて、この方法で解剖した幼虫を共焦点顕微鏡、蛍光レポータータンパク質や免疫蛍光染色の可視化、および現場でのハイブリダイゼーションにも使用できます。
ホルムアルデヒドまたはPFAは、刺激性および発がん性物質の疑いがある。手袋はPFAを扱うときに着用する必要があり、濃縮された溶液は化学発煙フードで扱われるべきです。
