このプロテオミクスワークフローは、内因性タンパク質とタンパク質の細胞内分解能との相互作用を公平に同定し、マッピングすることを可能にします。この手法は、用量感受性、低存在量、または複数の細胞内局在性を有するベイトタンパク質を調査する場合に特に有利である。この方法は、適切な親和性試薬があると仮定して、内因性タンパク質相互作用のマッピングに適用することができる。
これは、未知の機能を持つ何千ものタンパク質の多くにとって特に重要であり、その多くはヒト疾患と結びついています。この方法は、細胞内分画に適した任意の細胞株または組織に適合させることができる。適切な親和性試薬を有する任意のタンパク質を標的とすることができる。
アフィニティー精製実験の一般的な結果は、多くの場合、結果ではありません。本当に良い試薬、全体のQCデータを収集し、サンプルの取り扱いを制限することは、すべて本当に重要です。サンプルがあることを知っています。
まず、調製した細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤またはホスファターゼ阻害剤を用いたコールドバッファーAの1Xペレット体積で15分間解凍する。細胞ペレットを含むチューブを摂氏4度のヌテレーターに置き、30分間再懸濁するのを助けます。その後、チューブを遠心分離機に2,000 g、摂氏4度でペレットに10分間置きます。
上清をデカントし、5倍のパックされた細胞体積を20分間氷上のバッファーA.Incubateで再懸濁させる。次に、2,000回gと摂氏4度で再びペレットを10分間ペレット化する。バッファーをデカントし、プロテアーゼ阻害剤またはホスファターゼ阻害剤を用いた2Xのパックされた細胞容積バッファーAで再懸濁する。
緩い害虫A.遠心分離機で約7回、2,000倍gと摂氏4度で10分間、ライセートを捨てます。上清を慎重に新しいチューブに移し、液体窒素でフラッシュフリーズします。ライセートをマイナス80度で保存します。
プロテアーゼ阻害剤またはホスファターゼ阻害剤を用いて0.9Xペレット量のバッファーBでペレットを再懸濁し、摂氏4度で5分間ヌケーターに混ぜます。核をライスするには、価価害虫で20回ダウンスB.ヌケーターの核ライセートを4°Cで30分間混ぜて均質になるようにします。その後、核ライセートを摂氏4度で21,000倍gで30分間遠心分離する。
上清を取り除き、可溶性核タンパク質抽出物として保存します。可溶性核抽出物を透析するには、まず8キロダルトンの分子量カットオフで24ミリメートル幅の透析チューブの適切な長さを切断する。チューブの片側をクランプし、チューブに核内をロードします。
ライセートをロードした後、もう一方の端をクランプし、プロテアーゼ阻害剤とバッファーCを含むきれいなガラス容器に沈めます。摂氏4度で3時間透析する。その後、透析した核状抽出物をチューブに移し、遠心分離機を摂氏4度で21,000倍に30分間移動します。
ウェスタンブロットによる分画検証のために、核抽出物の3つの20マイクロリットルアリコートを新しいマイクロ遠心分離管に移す。先端で切断されたピペットチップを使用して、プロテインAセファローズの12.5マイクロリットルビーズボリュームとマイクロ遠心チューブ内のプロテインGセファローズ12.5マイクロリットルを組み合わせることで、複製ごとにタンパク質A/Gビーズ混合物を調製します。プロテインA/Gビーズ混合物を300マイクロリットルのIPバッファI.で2回洗浄し、ビーズを1、500倍のgを摂氏4度で1分間回転させ、バッファをデカントします。
次に、抗体タンパク質A/Gビーズを調製する。抗体をビーズに結合させるために、所望の抗体のIPバッファIおよび10マイクログラムの300マイクロリットルのチューブに加える。ビーズ抗体混合物を一晩摂氏4度でヌテレーターで揺らします。
現在、核ライセートの適切な量は、反復ごとに1ミリグラムのタンパク質入力のための低保持マイクロ遠心チューブにアリコートする。16,000回gで30分間にライセートを回転させ、上清を新しいチューブに移します。ベンゾナーゼを1マイクロリットル当たり250単位で1マイクロリットルで加え、核ライセートのミリグラム1ミリグラム、10~15分間、摂氏4度のヌケーターに岩石を加えます。
ライセートを事前にクリアするためのビーズを調製するには、各タンパク質AとプロテインGビーズの12.5マイクロリットルを1.5ミリリットルの低保持チューブに加えます。プロテアーゼ阻害剤を用いてIP洗浄緩衝液Iで2回洗浄する。バッファーをデカントし、ビーズに調製された核ライゼートの1ミリグラムを追加します。
摂氏4度で1時間、ヌテーターで揺れながらインキュベートします。1分間、1、500倍g、摂氏4度で予めクリアされたライセートを遠心分離する。次に、プロテアーゼ阻害剤で抗体プロテインAまたはGビーズをIPバッファーIで2回洗浄します。
1、500倍g、摂氏4度で1分間遠心した後、バッファーをデカントします。今、抗体タンパク質AまたはGビーズに予めクリアされた核ライゼートを移す。摂氏4度で4時間揺れながらインキュベートします。
インキュベーションに続いて、遠心分離機は1、500倍g、摂氏4度で1分間行う。上清を各複製の流れとしてラベル付けされた管に移します。プロテアーゼ阻害剤を用いて、抗体プロテインAまたはGビーズを1ミリリットルのIPバッファIIで4回洗浄します。
次に、プロテアーゼ阻害剤で1ミリリットルのIPバッファーIでビーズを2回洗浄します。最後の洗浄後にすべてのバッファーが取り除かれていることを確認します。20マイクロリットルの0.1モルグリシンをpH2.75でヌテーターで30分間インキュベートすることにより、ビーズから溶出したタンパク質を溶出させる。
その後、750倍gと摂氏4度で1分間回転し、上清からピペットを取り除きます。溶出バッファーをもう一度使用して、このインキュベーションを繰り返します。タンパク質ペレットを調製した後、30マイクロリットルのSDSアルキル化バッファーで再懸濁する。
95°Cの熱ブロックでサンプルを5分間インキュベートします。その後、室温で15分間冷却します。各サンプルに300ミリリットルのUA溶液と30マイクロリットルの100ミリモルTCEPを加えます。
30K遠心フィルターに溶液をロードします。遠心フィルターを室温で21,000回gで10分間回転させた後、フィルターに問題がある場合に流れを通し続ける。原稿に従ってフィルターを洗浄した後、0.1モルトリスpH 8.5に再懸濁したマイクロリットル1マイクログラムあたり1マイクログラムの3マイクロリットルを加える。
フィルターを0.1モルトリスpH 8.5で100マイクロリットルのマークまで充填します。ヌテットを揺らしながら摂氏37度で1時間消化させます。次に、マイクロリットルMSグレードのトリプシンあたり1マイクログラムの1マイクロリットルを追加します。
やさしく混ぜて、トリプシンがヌテーターで揺れながら摂氏37度で一晩サンプルとインキュベートできるようにします。午前中、21,000回gで複数回、20分間、フィルターからペプチドをクリーンな低保持マイクロ遠心チューブに溶出させた。C18スピンカラムを用いてペプチドを脱塩した後、凍結乾燥したペプチドを0.1%TFAの7マイクロリットルで5%アセトニトリルで再懸濁する。
サンプルを3分間超音波処理してペプチドが再懸濁されたことを確認し、14,000倍gで10分間スピンダウンします。分析のために、サンプルの15~30%を液体クロマトグラフィー質量分析システムに負荷を加えます。本研究では、ビーズのみのコントロールを利用したHeLa核抽出物の5ミリグラムから三重免疫沈降を分析した。
餌DYRK1Aは、実行されたIP-MS実験が信頼性の高い対照上の上位3つの濃縮タンパク質の中でランク付けされました。高信頼性インターアクターと95%以上の共精製タンパク質との間に明確な分離が示され、非特異的であると同定された。DYRK1A データセットの例では、IREF インタラクション パートナーは、制御に対する非常に低いエンリッチメントを表す 0.45 の低い FC-A 値を提示しました。
したがって、これらの以前に報告されたインタラクションの多くは、FC-Aしきい値3を下回ることによって、このデータセット内の偽陰性です。各IREF相互作用の計算された絶対コピー数は、IP-MSによる相互作用パートナーの検出レベルとの相関関係を示さなかった。FC-Aを3より大きく、聖人を0.9より大きく組み合わせることで、高信頼インターアクターのリストが6つのタンパク質に減少しました。
しかし、3つを超えるFC-Aカットオフを単独で適用すると、8つのタンパク質がネットワークに追加されました。このプロトコルの最も重要な部分は、免疫沈降のための抗体試薬の選択です。このワークフローを完了する前に、選択性のウェスタンブロットまたはクーマシーの検証をお勧めします。
タンパク質とタンパク質相互作用の裏付けとなる証拠は、同定されたインターアクターのco-IPウェスタンブロッティングから得ることができる。タンパク質化学架橋は、より複雑であるが、インターアクターの相互作用ドメインを明らかにすることができる。この方法を用いて、私の研究グループは、哺乳類の脳の発達に必要なタンパク質キナーゼであるDYRK1Aの新しい機能を発見し、アルツハイマー病の神経病理学と結びついています。
