人間の脳オルガノイドは、簡単に操作され、人間の設定と複数の細胞タイプの適切な相互作用を組み込むシステムで病気を研究するための重要なツールです。この技術は、脳の神経発達障害、毒性侮辱、および脳内の癌の成長と治療を含む脳の多数の疾患を研究するために適用することができます。このプロトコルの主な利点は、多種多様な神経細胞タイプを有する高度に再現性の高い脳オルガノイドを生成する能力である。
これは、ほとんどの研究所で実現できる非常に単純なワークフローを使用して行われます。これらは、特殊な成長因子や未定義の行列の影響を受けずに、一時的に適切な方法で生産され、非常にシンプルで費用対効果の高いシステムになります。まず、100マイクロリットルのマトリックスを5.9ミリリットルの氷冷ダルベックコの修正イーグルミディアムまたはF12メディアと15ミリリットルの円錐チューブに組み合わせます。
各ウェルを膜マトリックス1ミリリットルで6ウェルプレートにコーティングします。パラフィンフィルムでプレートを包み、摂氏4度で一晩保存します。翌日、各井戸から余分な培地を吸引し、F12でウェルをすすぎ、H9 hESCSを1ウェルあたりmTeSR1培地の合計容量2ミリで添加する。
細胞を週から週に培養します。mTeSR1培地を毎日2ミリリットル供給し、5%酸素と5%の二酸化炭素を含む37°Cの低酸素インキュベーターにプレートを入れる。ガラスツールを使用して、細胞を通路間の培養物から分離します。
メディアを毎日更新します。細胞は、オルガノイド産生のためにH9細胞を利用する4〜6日前に継がれるべきである。細胞を通過するには、まずDMEM F12培地でリンスし、余分な液体を吸引する。
リンスした後、プロテアーゼ溶液を加え、ウェル内にコロニーが浮かぶように細胞を40分間インキュベートします。次に、DMEM F12を使用して細胞を3回洗浄し、必要に応じて硝酸塩を使用して小さくします。その後、4つの6ウェルプレートに対しておよそ1対8の比率で細胞を分配し、プレートをインキュベーターに入れ、毎日給餌します。
4~6日後、細胞は約80%の合流度に達する。通常のインキュベーターに移行します。プロテアーゼストック溶液を、hESCSの6ウェルプレートごとに5ミリリットルのDMEMまたはF12培地に1ミリリットルのストック溶液を加えて、作業濃度に希釈します。
細胞培養培地を吸引し、その後、プロテアーゼ溶液でhESCSを覆う。プレートをインキュベーターに10〜15分間置くか、コロニーの端が切り上げ、マトリックスから分離し始めるまで、完全に切り上げる前にプレートを置きます。プレートを傾け、プロテアーゼ溶液を吸引し、各ウェルに対して2ミリリットルのDMEMまたはF12で細胞を3回静かに洗います。
コロニーがマトリックスに取り付けられていることを確認してください。したがって、ES細胞の断片が適切なサイズにあることが重要なので、適切な時間が不足していることを確認してください。彼らがあまりにも短い時間のためにそこにいる場合は、それらを洗い流し、それらを分解することは非常に困難な場合があります。
そして、彼らがあまりにも長い間そこにいる場合、彼らは実際に洗濯ステップ中に外れることができます。各井戸に新鮮なmTeSR培地の約1〜1.5ミリリットルを追加し、穏やかなピペットを使用して50ミリリットルの円錐管にプレートから細胞を洗い流します。彼らは元のサイズの約1/30に達するまで、プレート内のhESCSを吸引し、分配します。
現在、コロニークラスターは250〜350マイクロメートルの大きさの部分に似ています。bFGFを使用せずに30ミリリットルのmTeSR培地を含む単一の超低添付ファイルT75フラスコに細胞を移す。翌日、生きた細胞が隅に溜まるようにフラスコを傾けます。
フラスコの底部に付着した細胞が多数ある場合は、10ミリリットルのピペットを使用して新しいフラスコに細胞を移します。最初の数日間は死んだ細胞の人口が多いことを期待してください。細胞が沈着したら、培地と死細胞を吸引し、生細胞を含む約10ミリリットルの培地を残し、bFGFの1ミリリットル当たり30ナノグラムを添加した低bFGF培地を20ミリリットル添加する。
2 日後、セルを確認します。細胞のほとんどは、健康で明るく見える必要があります。.しかし、細胞の3分の1以上が暗く見える場合は、フラスコを傾け、20ミリリットルの低bFGF培地に置き換え、bFGFの1ミリリットル当たり20ナノグラムを補います。
3日目には、培地の半分を取り除き、1ミリリットルのbFGFを1ミリリットル当たり10ナノグラムで補ったhESC培地の15ミリリットルに置き換えます。5日目には、メディアの半分を15ミリリットルの神経誘導培地に置き換えます。その後、一日おきに、培地の半分を神経誘導培地に置き換えます。
培養で3週間後、必要に応じて1Xの最終濃度で培地に100Xペニシリンストレプトマイシンを加える。1 日おきにメディアの半分を更新します。このプロトコルでは、形成された脳オルガノイドは、これらのクラスターの中心に暗い死にゆく細胞なしで明るく、サイズが似ているように見えた。
細胞を徐々にbFGFから離離した。5日目、彼らは神経誘導メディアに入れられ、培養期間を通じてこのメディアにとどまりました。オルガノイドは時間の経過とともに大きくなり、暗くなりましたが、神経分化の開始を示し、胚性神経管の特徴を含む神経ロゼットのような構造が拡大しました。
細胞内の遺伝子発現をより詳しく調えるために、qPCR解析を行った。グルタミン酸トランスポーターVLGUT1は、2週間半で発現し、5週間で増加し、培養5ヶ月を通じて一貫した状態を保った。前脳マーカーFoxg1は、培養中の5週間まで低レベルで発現した。
深層マーカーTbr1は約5週間でピークに達し、その後減少した。一方、上層マーカーSatb2の発現に対し、腹側マーカーEng1、後脳脊髄マーカーHoxb4、ならびにオリゴデンドロビテマーカーOlig2はいずれも時間の経過とともに増加した。対照的に、幹細胞マーカーSox2は時間の経過とともに減少した。
グリアマーカーGFAPは5週間でピークに達し、その後比較的一定のままでした。初期段階のオルガノイドでES細胞を取り扱う際には、抗生物質なしで増殖し、スケジュールに従って餌を与えることを忘れないでください。この手順に従って、タンパク質発現および局在化のための遺伝子発現および免疫蛍光に対する定量的RT-PCRなどの技術を用いてオルガノイドを評価することができます。
この技術を用いて、低酸素室でモデル化されたヒト新生児低酸素傷害の側面を緩和する低分子の能力を研究することができた。これらのヒト脳オルガノイドがインビボマウス実験と同様に振る舞うことは重要である。
