ここでは、有機的に培養されたマウス海馬スライスにおけるニューロンおよび星状ATPレベルの変化の動的測定にATP感受性FRETセンサーATeam 1.03 YEMKを採用する方法を示します。この技術の主な利点は、制御された環境、高いセンサー発現レベルを持つ環境で生きている脳組織のエネルギー代謝を研究できることです。この技術は、例えば虚血性脳卒中のようなエネルギー欠乏によって引き起こされる病態機構、基礎疾患、または脳損傷に関する洞察を得るのを助けるかもしれない。
それは、原則として、脳組織だけでなく、他の器官でもATPレベルを研究するために使用することができる。この実験を成功させるためには、組織の培養に関わるすべてのステップを非常に慎重に行い、無菌性を維持することが不可欠です。また、細胞蛍光イメージングに関する知識も必要とされている。
最も洗練されたアプローチと可視化における組織の取り扱いは、適切な手順を理解するために不可欠です。イメージング実験についても同様です。この手順のデモンストレーションは、ポスドクのロドリゴ・レルチュンディと、研究室の修士課程の学生であるNa Huangです。
ACSFで満たされた氷冷ペトリ皿に、フィルター膜の上に脳を置きます。半球を分離し、45度の角度でパラサジタルカットを行います。スーパーグルーでビブラードーム組織の段階で1つの半球を固定し、すぐに5%の二酸化炭素と95%の酸素で泡立つ氷冷ACSFを含むビブラートメ浴に組織ブロックを移します。
ビブラートメ浴中の組織を揃えます。スライスするまで氷冷ACSFで2番目の半球を保ちます。ビブラートを調整して、250~400マイクロメートルでスライスをカットします。
スライスを切断した後、その典型的な形態学的外観に基づいて海馬の形成を識別し、海馬に隣接する大脳皮質の一部を維持し、皮下注射針を使用してそれを分離する。スライスをACSFのメッシュ上に置き、摂氏34度に温め、すべてのスライスが収集されるまで5%の二酸化炭素と95%の酸素で泡立てます。スライスを積層フローキャビネットに移し、滅菌条件下で継続します。
逆変、無菌、ガラスパスツールピペットで、ACSFから滅菌ハンクス塩溶液で満たされた事前に温めたペトリ皿の1つにスライスをそっと移します。ピペットを交換し、スライスを2番目の文化皿に移します。全体の 5 回のプロセスを繰り返します。
できるだけ少ないHBSSを次の培養プレートに移します。ピペットを使用して、培養インサートの上に一度に1つのスライスをそっと置きます。ピペットの乱気流を避け、スライスがパスツールピペットの先端まで下降するまで待ちます。
スライスごとにこのプロセスを繰り返します。膜に2つのスライスを置きます。慎重に細かい先端を使用して、挿入物の上部から余分なハンク溶液を除去します。
実験の日まで、培養物を加湿したインキュベーターの5%の二酸化炭素と摂氏37度に保ちます。2~3日ごとに培地を交換してください。組織に触れることなく、希釈したベクターの0.5マイクロリットルを各スライスの上部に直接塗布します。
最後に、スライスをインキュベーターに戻し、少なくともあと6日間そこに維持します。実験を開始する直前に、培養スライスを含むインサートを無菌フードに移し、1ミリリットルのorganotypicスライス培養培地、または最小限の必須培地を含む30ミリメートル皿に入れます。皿をステレオスコープの下に置き、スライスの表面に焦点を合わせます。
2本の無菌皮下皮注射針を使用して、選択したスライスの狭い端に、下の組織を損傷することなく上層で短いクロスカットを行います。挿入物から準備されたスライスを取り除くために、ピンセットで膜の端を保持し、無菌メスを使用して膜にまっすぐ平行にカットし、中央にスライスを持つ正方形または三角形を形成します。挿入物が追加のスライスをホストする場合は、元のプレートに戻してインキュベーターに移します。
媒体の表面張力は、膜の表面への漏れを防ぎます。実験的ACSFを準備し、少なくとも30分間カルボーゲン供給に接続された挿入チューブを通して95%の酸素および5%の二酸化炭素でそれをバブリングすることによって7.4のpHを得る。実験全体で生理しまいがちな状態に保ちます。
次に、モノクロームの蛍光光源をオンにします。実験室に、オルガノティピックスライス培養を移します。フレームを下にして、培養物に触れることなく、糸を上げて膜に触れた状態で、組織のスライス培養の上にグリッドを置きます。
チャンバーを顕微鏡ステージに置き、輸液システムに接続します。毎分1.5〜2.5ミリリットルの流量で蠕動ポンプのスイッチを入れます。灌流システムの漏れがないことを確認してください。
透過光を使用して、培養したスライスを焦点にし、実験を行う領域を特定します。イメージング実験を開始する前に、スライスが生理食前の状態に適応するまで少なくとも15分待ってから、カメラとイメージングソフトウェアのスイッチを入れます。435ナノメートルでドナー蛍光タンパク質を励起します。
露出時間を 40 ~ 90 ミリ秒に設定します。次に、二色性ミラーとフィルターをビームスプリッターユニットに挿入します。500ナノメートルの蛍光発光を発光画像スプリッタで分割し、バンドパスフィルタを482プラスマイナス16と542プラスマイナス13.5ナノメートルで使用して、ドナーとアクセプター蛍光をさらに分離します。
背景減算のために細胞蛍光を欠いていると思われる関心のある領域を選択する。画面の画像にラベル付き組織の単一の構造を丸で囲み、ROIを作成します。画像取得の頻度と全体の記録時間を設定します。
30分以上の実験では、光毒性を防ぐために0.2〜0.5ヘルツの取得頻度が推奨されます。続いて、記録を開始します。細胞内ATPの変化を誘導するために、灌流管を標準ACSFから代謝阻害剤を含む生理食物、例えば化学虚血溶液に切り替える。
あるいは、活性ニューロンからのカリウムイオンの放出を模倣するために、8ミリモルでカリウム濃度が上昇した生理食動物を使用する。録音の直後に、実験 ACSF をヒープバッファリング ACSF と交換します。次に、スライス培養を含む記録室を共焦点レーザースキャン顕微鏡に移す。
与えられた光学構成で可能な限り最高のZ解像度でZスタックイメージを取る。このプロトコルでは、トランスダクションの10日後に、ATeam 1.03 YEMKを発現するニューロンは、スライス表面下50マイクロメートルまでの深さで培養組織スライスの新皮質で高密度で発見された。海馬で同等の結果が得られた。
アストロサイトの場合、ATeam 1.03 YEMKはヒトグリア線維性酸性タンパク質プロモーターの制御下で発現し、選択された海馬ニューロンでATeam 1.03 YEMKを発現するorganotypicスライスは、ピラミッド型細胞のソマタを表す。1分間の細胞外グルコースがない場合にスライスをアジジドナトリウム5ミリモルに曝露した後、FRET対の発光強度に反対の変化が誘発された。ATeam FRET比の可逆的な減少も観察された。
ニューロンおよびアストロサイトのベースライン条件下での14種類の細胞における長期ATeam FRET比は、ATeamが信頼性が高く安定したセンサであることを示しています。化学虚血は、この実験の最後に両方の細胞タイプのATeam比の予想される強い低下をもたらしたことに注意してください。細胞外カリウム濃度が3分から8ミリモルに増加しても、ATeam 1.03 YEMKを発現するニューロンに検出可能な変化は生じなかった。
これに対し、アストロサイトはATeam FRET比の可逆的増加により細胞外カリウムの増加に反応し、細胞内ATPレベルの増加を示した。また、化学虚血により、ATeam比が即座に低下し、センサーがATPの変化を検出できることを実証しました。ここで説明するように FRET ベースの細胞イメージングを試みる場合、organotypic 培養で高品質のスライスを生成することが重要なステップであることを覚えておいてください。
また、グリアの傷跡やエキスパートレベルのイメージングを注意深く除去する必要があります。この手順に従って、細胞代謝産物に対する異なる他のFRETベースのナノセンサーを組み込んだ実験も行うことができるべきである。例えば、グルコースまたは乳酸塩用のもの。
最後に、動物の保護のための関連する行為は常に観察されなければならないことを強調する必要があります。これは、遺伝子組み換え生物の取り扱いを支配する有効な法律にも当てはまります。
