このプロトコルにより、単一分子レベルおよび他の酵素系におけるフラップエンドヌクレアーゼ1による相互作用ダイナミクスとホリデイ接合の分解能を監視することができます。まあ、いくつかは分子集団全体を平均するか、基礎となる個々の機械化ステップを確保し、あります。単一分子法は、個々の分子のリアルタイム挙動をモニタリングすることにより、これらの詳細を提供する。
単一分子法は、ピコおよびナノモル範囲における生体分子相互作用を高い特異性で効率的に検出することができる。これは、診断、ゲノムシーケンシング、センシングにおける多くの実用的なソリューションに便利です。光学的および強制測定の単一分子法は物理学、化学、生物学に広く適用され、他の方法ではアクセスできない高貴な観察を提供することが証明されている。
初めてのユーザーへの私のアドバイスは、このプロトコルでレイアウトされた詳細な手順に密接に従う必要があります。このプロトコルの実践的な手順を視覚的に示すと、この手法の実装が成功します。単一の流路の流れセルを準備するには、中心が37ミリメートル離れていて、スライドの端から6.5ミリメートルの50×20ミリメートルの石英スライドの中央部に2つの1.22ミリメートルの直径の穴を掘削することから始めます。
電子カッターを使用して、41を2.25ミリメートルのチャネルを2倍粘着シートの50ミリメートルに切り、保護カバーのプラスチック側を剥がします。ピースの端を石英スライドの端に合わせ、ポリテトラフルオロエチレンピンセットを使用して、閉じ込められた気泡を静かに取り除きます。粘着片の紙側を剥がし、カバースリップの機能面に取り付けます。
次に、内径1.22ミリメートルのポリエチレンチューブを入口の11センチメートルの長さに、チューブの1つを25センチメートルに切ります。次に、フローセルの入口と出口チューブとして、以前に掘削された穴にチューブを挿入します。そして、入口および出口管の石英カバースリップインターフェイスの端を密封するために5分のエポキシ接着剤を使用する。
細胞が乾燥したら、1ミリメートルシリンジを使用して、PBS中の0.03ミリグラムのフィルター0.03ミリグラムを細胞に洗浄し、バッファーだけで満たされた第2シリンジを使用して、増殖の終わりに余分なアビジンを洗い流します。単色FRET実験を行う場合は、まず1滴の浸漬油を全100倍の内部反射蛍光目標に適用し、光電子のオンチップ乗算を適切なゲインに設定して、バックグラウンドへの信号を最適化し、飽和を防ぎます。慎重にフローセルをサンプルホルダーに置き、コース調整を使用して、オイルがカバースリップに触れるまで徐々に目標を上げます。
532ナノメートルのレーザーをオンにし、目的の微調整モードに切り替えます。カメラポートに放出を向けてモニター上の画像を観察し、カバースリップの機能面が焦点に合わせ、モニターで観察できるまで、目的の高さを調整します。カバースリップの機能面からの背景が蛍光標識されたHJで流れる前に、いくつかのスポットを超えていないことを確認してください。システムが0.5ミリリットルのチューブに酸素清掃システムとイメージングバッファの120マイクロリットルに関心のある希釈された基質の0.2〜0.5マイクロリットルで準備が整うと、スポイトポンプに遅い電池の出口を接続します。
入口チューブを1.5ミリリットルチューブに挿入し、1分あたり30〜50マイクロリットルでシリンジポンプを開始し、チューブから溶液を引き出します。緑色のレーザーで表面を短時間画像化し、均質に分散した十分な間隔の基板の100~300個の粒子でセルの良好な被覆を確認します。フローセル表面が十分に覆われている場合は、1分間に30〜50マイクロリットルのイメージングバッファの別の120マイクロリットルを洗い流し、非結合のHJを洗い流し、フローセルを5分間座らせ、酸素スカベリングシステムが溶存酸素を枯渇させます。
露出時間を約 60 ミリ秒に設定します。サイクル時間は、データ転送の速度に基づいてソフトウェアによって自動的に設定されます。必要なサイクル数またはフレーム数を約 400 に指定します。
ドナーおよびアクセプター蛍光色素からの放出は、画像スプリッタデバイスによってカラーチャネルに分割される。表面上の適切な領域を選択し、画像に焦点を合わせて記録し、16ビットのTIFF形式で映画を保存するために目的の高さを調整します。次に、新しいエリアに移動します。
1分間の流量30マイクロリットル、一度に1つの濃度でGEN1の示された濃度を補うイメージングバッファの120マイクロリットルでセルを洗い流します。HJ切断実験の解像度では、流量を毎分110マイクロリットルに調整し、酵素がフローセルに入る5~10秒前に記録を開始します。酵素がフローセルに入射する前に5~10秒開始すると、イベント数が最大になります。
すべての濃度をテストしたら、固定蛍光ビーズスライドを使用して、画像分割装置内のドナー粒子とアクセプター粒子を互いにマッピングします。変換マトリックスを生成するために適切なソフトウェアパッケージをインストールした後、記録されたビーズスライドムービーを開き、ドナーとアクセクサチャネル内の個々のビーズの位置を選択します。固定ビード スライドからマトリックスが生成されたら、[TFORM を読み込む] をクリックし、変換マトリックス ファイルを選択します。
チャネル フィルタのドロップダウン メニューで、[D&A]オプションをクリックして、ドナーとアクセプタの両方でラベル付けされたパーティクルを選択します。次に、マニュアルで指示に従って plotTimetraceCW と入力し、各分子の時間トレースを生成します。ALEX FRET実験を行うために、緑色と赤のレーザーで直接励起して、ドナーとアクセプターの放出の連続したフレームで構成される映画を記録します。
取得したALEXムービーを開き、ドナー励起、ドナー励起によるアクセクサ放出、および直接励起チャネルによるアクセクサ放出によるドナー放出のそれぞれについて、約300に適切な検出閾値を設定します。適切なチャネルフィルタを適用して、ドナーとアクセクサの両方であったパーティクルを選択し、3 つのチャネルのそれぞれで 200 ~ 300 個のパーティクルをリンクします。plotHistALEX MATLAB コードを使用して、ヒストグラムの関数に異なるピークに適合する ALEX ヒストグラムを生成し、適切なグラフ作成と解析プログラムを使用して、各母集団の曲線下の面積の割合を決定します。
次に、plotTimetraceALEX MATLABコードを使用して、FRETおよび直接励起によるアクセプター放射における直接励起によるドナー放出を示す各分子の時間トレースを生成する。隣接ラベルX-0のこの代表的な交振FRETヒストグラムは、より豊富で少ない異性体の交換に対応する2つのピークを示す。異性体のドウェル時間ヒストグラムから得られる異性化率は、以前に報告されたものと一致する。
ALEXによって獲得された異なるGEN1濃度で隣接するラベルX-0接合の単一分子FRETヒストグラムは、低FRETピークからあまり豊富でない異性体の寄与を差し引いた後、結合したHJ集団に対応する遊離高FRET異性体に対応する1つのピークおよび1つのピークを明らかにする。飽和GEN1濃度では、X-0のFRETヒストグラムは、モデルによって予測されるように、HJのいずれかの異性体に結合するGEN1に対応する単一の低FRETピークのみを有する。Gen1モノマーとHJへの結合に続くダイマー形成は、溶液中の二量体状に存在する原核生物レゾールバセと比較して真核生物HJレゾワドGEN1のユニークな特徴である。
GEN1モノマーがHJに結合して歪曲するというさらなる証拠は、低GEN1濃度でのマグネシウムの存在下で安定な低FRET状態の無切断粒子の微量のかなりの数の観察である。中間体の出現なしに起こる解決されたX-0の痕跡の安定した低FRET状態の後のドナーおよびアクセクサの同時出発は、GEN1 HJ複合体の寿命内で完全な解決が起こることを示す。機能化ガラス表面からの背景は、いくつかのスポットを超えてはならないと、均一に分布粒子は、良好な結果を得るために不可欠であることに注意してください。
シリアル化画像を準備する間は、常に個人用保護具とヒュームフードを使用してください。レーザーを使用する場合は、波長に固有の保護メガネを着用してください。クライオap、核磁気共鳴などの他の方法は、原子レベルの構造詳細を提供することができる。
この情報は、単一分子FRET実験の設計と解釈に不可欠です。単一分子FRETは、DNA複製の分野で新たな見解を開き、ヘリカーゼおよびヌクレアーゼの作用メカニズムを深く理解する。
