腸内のM細胞の希少性のために、腸内ホメオスタシスおよび免疫防御においてM細胞が果たす役割を完全に理解することは欠けている。ヒト腸幹細胞由来培養におけるM細胞の誘導分化により、M細胞の発達および機能の研究が可能となる。トランスウェル膜をコーティングするには、24ウェルプレートに所望の数のトランスウェルを配置し、2つのチャンバーシステムを作成します。
細胞外マトリックス、またはECMを冷たい無菌リン酸緩衝生理食塩水で25倍希釈する。次に、100マイクロリットルの冷たい希釈液を各上のチャンバーに膜に加えます。蓋で24ウェルプレートを覆い、プレートを37°Cの組織培養インキュベーターに2時間置き、膜上のECM固化を可能にします。
2時間後、インキュベーターからプレートを取り出し、組織培養フードに入れます。滅菌ピンセットを使用して、各トランスウェルを反転して残りの溶液を静かに除去します。細胞が採取されている間、蓋を開けた状態でボンネット内で膜を空気乾燥させます。
インキュベーターからイレラルエンタノイドのプレートを取り出し、真空吸引またはピペットを使用して各ウェルから培養培地をそっと取り除きます。ECMを分解するには、ECMに懸濁したイレラルエンテロイドを含む各ウェルに氷冷0.5ミリモルEDTAの500マイクロリットルを加えます。ピペットは、ECMを分解するために500マイクロリットルに設定されたP1000ピペッタで激しく上下し、溶液中にイレラルエンタイドを放出します。
15 ミリリットル円錐形チューブに各井戸からソリューションを収集します。.140Gの遠心分離機の細胞をペレットにし、摂氏4度で5分間ペレットします。ペレットは目に見えるはずですが、簡単に外れることができるので、真空吸引によって、またはピペットでゆっくりと上清を除去します。
タイトな接合結合を消化し、単一細胞にileal腸内腸を分解するには、採取した5つのウェルごとに500マイクロリットルの室温トリプシンでペレットを再懸濁する。P1000ピペッタを使用して、ピペットを上下にして塊を分解します。37°Cの水浴でチューブを5分以内にインキュベートします。
トリプシンを不活性化するためにトリプシンの500マイクロリットルあたり10%FPSで高度なDMEM F-12の1ミリリットルを追加します。ピペットは、円錐管の側面に対して少なくとも50回50回50回50回設定されたP1000で上下に、残りの塊をさらに単一細胞に分解する。40ミクロンの細胞ストレーナーを50ミリリットルの円錐チューブの上に置き、高度なDMEM F-12を1ミリリットル加え、10%FPSでセルストレーナーを湿潤させます。
15ミリリットルの円錐からストレーナーに単一細胞懸濁液をピペット。10%FPSで高度なDMEM F-12の1ミリリットルでストレーナーを洗います。50ミリリットル円錐チューブから細胞ストレーナーを通過した細胞を新しい15ミリリットル円錐形チューブに移します。
ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。新しい15ミリリットルチューブの細胞を室温で5分間400Gで遠心分離します。細胞ペレットが表示されている必要があります。
ピペットで上清を慎重に取り出し、ペレットが外れた場合に再び上清を保存します。MCMGFの細胞ペレットを10マイクロモルY27632で再懸濁します。ECMコード化された膜が目で評価されるように完全に乾燥していることを確認してください。
MCMGFプラスの200マイクロリットルで上部チャンバーを洗います。次に、各上部チャンバに200マイクロリットルのセル溶液を加えます。各下部チャンバに10マイクロモルY27632とMCMGFプラスの700マイクロリットルを追加します。
プレートを5%CO2の37°Cの組織培養インキュベーターに入れる。成長の1日後、上の部屋から培地を取り出し、複数の細胞層の成長を防ぐために200マイクロリットルの新鮮なMCMGFプラスに置き換えます。一度単層が約80%コンフルエント、通常は1〜3日の間に播種後、制御ウェルのための分化媒体、またはM細胞誘導ウェル用のM細胞培地で流域培地を置き換えます。
両方の条件の分化媒体で上の部屋のメディアを交換してください。QRTPCRによるM細胞分化を確認するには、まず上下のチャンバーから培地を取り出します。室温PPSの300マイクロリットルで上の部屋を2回静かに洗います。
各上部チャンバーに300マイクロリットルのTRIzolを加え、室温で5分間インキュベートします。一方、各ウェルのマイクロ遠心管を標識し、各チューブにTRIzolの700マイクロリットルを追加します。P1000で3回上下に軽くピペットして細胞ホモゲネートを収集し、内容物を対応するマイクロ遠心管に移します。
5秒間渦が混ざります。さらに 3 分間、室温でサンプルを保持し、標準 QRTPCR プロトコルを続行するか、サンプルをマイナス 80°C で保存します。免疫蛍光によるM細胞分化を検証するには、まず、上層チャンバから培地を取り出す。
300マイクロリットルの室温PBSで2回静かに洗います。室温4%PFAの100マイクロリットルを上の部屋に加えます。プレートをホイルで覆い、室温で25分間放置します。
PFAを取り外した後、室温PBSの300マイクロリットルで上の部屋を3回洗う。溶液を除去する前に、室温で暗い温度で30分間PBSに溶解した5%BSAの100マイクロリットルで単層をインキュベートし、単層をブロックします。1~100の希釈でPBS中の1%BSAでGP2一次抗体溶液を調製し、1ウェルあたり100マイクロリットルを添加する。
溶液を除去する前に、暗闇の中で室温で1時間染色する。室温PBSの300マイクロリットルで上の部屋を3回洗います。蛍光タグ付けヤギ抗マウスIgGファロイジンとDAPIの二次染色液を調製し、ウェルあたり100マイクロリットルを添加する。
暗闇の中で室温で30分間汚す。300マイクロリットルのPBSで井戸を3回洗います。次に、5マイクロリットルの取り付け液をガラススライドに置きます。
24ウェルプレートから井戸を取り出し、反転します。トランスウェルから膜を除去する間、膜は完全に平坦なままでなければならない。膜の隆起はガラスのスライドにしっかりしたシールを防ぎ、大きくイメージの質に影響を与える可能性があります。
成功を確実にするために、鋭いメスを使用してウェルから膜を慎重に切断します。細胞を上に向けた膜を、ガラススライド上の取り付け液の液滴の上に置きます。10マイクロリットルの取り付け溶液を膜の上部と中央に加え、カバースリップを上に置き、ガラススライドとカバースリップの間の膜を密封します。
暗闇の中で室温でスライドを24時間乾燥させます。M細胞は、免疫蛍光によってGP2の表面発現によって検出される。典型的には、コンフルエント単層において、RANKLおよびTNFアルファで処理されたサンプルにおいて、6日目から8日目のポストシードによって40倍の倍率で所定の顕微鏡場で1〜5個のM細胞が観察される。
未治療サンプルではGP2発現は見られない。ファロイジンプローブで重ね合わされたXZ平面の直交図は、各細胞を取り囲むアクチン構造と、M細胞の有端表面上のGP2発現を示す。このモデルは、ヒトの腸内に見られるM細胞の低周波を再現する。
このモデルで開発されたM細胞がIgAに結合できるかどうかを判断するために、ヒト血清IgAの重鎖を認識するフルーター共役二次抗体を用いて、M細胞上のIgAの存在を可視化する。IgAで1時間処理したM細胞は、IgAを有する有端表面に結合し、一方、IgAに対して二次抗体でしか処理されなかった対照ウェル内のM細胞は、検出可能なシグナルを有さない。また、IgAはM細胞の有端表面に特異的に結合し、GP2表面染色を欠いた細胞に結合することは見当たらない。
また、M細胞は、その頂端表面上に特徴的に短い緻密なアクチンを有する。単層が約80%コンフルエントであるときにRANKL TNFアルファ補分化培地に切り替えることは、良好なM細胞分化を達成するための鍵である。この技術により、研究者はM細胞の発達に関連する質問を探求し、M細胞を含む宿主病原体相互作用および薬物輸送研究を探求することを可能にする。
