非ヒト霊長類の光遺伝学的ウイルスベクターの対流強化送達(CED)により、研究者は神経活動を大規模に操作して複雑な神経計算および行動を理解できるようになる。CEDを使用すると、従来の方法と比較して短時間でわずかな注射で霊長類脳の大きな領域にわたって高い光遺伝学的発現を達成することができます。磁気共鳴またはMR適合チャンバー移植は、非ヒト霊長類手術において標準的な練習を使用して行われ、この手順は、このビデオで簡単に概説されるテキストプロトコルで詳細に説明される。
テキストプロトコルに記載されているように動物の沈殿、位置決め、および初期切開に続いて、トレフィンを使用して注射のための事前計画された軌道をカバーする円形頭蓋切開術を作成する。計画された頭蓋骨の中心に十分に深い頭蓋骨の内側にインデントを作成し、トレフィンの調整可能なセンタリングポイントを使用してトレフィンを固定します。中央ができたら、トレフィンを頭蓋骨に下げ、骨キャップを鉗子で取り外すまで下圧を加えながら、トレフィンを時計回りに反時計回りに回転させます。
テキストプロトコルに詳述されているように硬膜を持ち上げた後、頭蓋切除術の中心から端まで硬膜を切断し、細かい眼科はさみで端に沿って続けます。チャンバーフランジの曲率が頭蓋骨の曲率とよく一致するように注入中にカニューレサポートを提供するために、頭蓋骨の上に頭蓋骨の上に頭蓋骨に対流を強化した配信MR互換チャンバーをマウントします。プラスチック製のネジと歯科用アクリルまたはいくつかのチタンねじを使用して、インプラントを頭蓋骨に固定します。
MR互換チャンバーを移植し、チャンバーにカニューレ注入グリッドを挿入した後すぐに、MR解剖画像を介して注入位置を視覚化するための0.9%の生理学でグリッドを埋める。また、脳の水分を維持するために、濡れた滅菌吸収性ゲルフォームでチャンバーキャビティを満たします。輸送およびMR注入の間にシリンダーの無菌性を維持するために無菌の抗菌性の切開のドレープで皮およびシリンダーを覆う。
ビタミンEカプセルを入れ、正の識別のために注射グリッドの上部をマークします。動物が挿管されたままの間、麻酔回路から気管チューブを取り外し、ポータブルMR互換イソフルランマシンに再び取り付けます。MRIスキャナーに動物を輸送します。
T1 画像を取得して、射出グリッドの上部と皮質表面からの距離を計算します。ビタミンEカプセルは、T1画像ではっきりと見える、注射グリッドの上部のマーカーとして使用する必要があります。T2画像を取得し、輸液の対象部位に基づいて各部位の最適なカニューレガイドを決定します。
カニューレグリッドは、T2画像で最もよく見える生理生理が満たされています。MRイメージングソフトウェアを使用して、コロナと矢状の平面をスクロールして、注入のターゲット位置を見つけます。ウイルスベクターを室温で数時間解凍した後、ピペットまたは渦混合によりMR造影剤ガドテリドールとウイルスベクターを混合する。
混合ウイルスを0.2ミリリットル高圧IVチューブにロードします。高圧IVチューブを使用して、長い延長線をMR互換の3ミリリットルシリンジと生理食塩水と素数に接続します。長い延長チューブのもう一方の端を、ウイルスに搭載された0.2ミリリットルのIVチューブに接続します。
次に、還流抵抗力のあるカニューレをクランプスタイルのカテーテルコネクタを使用して、このアセンブリの遠位端に1ミリリットルの階段状の先端を取り付けます。最後に、MR互換ポンプにシリンジをセットします。得られたベースライン解剖学的MR画像を用いて、カニューレ注入グリッドの位置と、標的注入部位に到達するために必要な挿入深度を選択する。
滅菌テープを使用してカニューレの挿入深さをマークします。1分間に1マイクロリットルの速度で注入を開始し、カニューレ先端からの流体の放出を観察することによって、注入ライン内の流体の流れを視覚的に検証する。注入ラインの流れを維持しながら注入グリッドを通してカニューレを手動で挿入すると、注入ライン内の流れが挿入中にカニューレを詰まらせるのを防ぎます。
今、ウイルスベクター注入のオンライン監視のための高速フラッシュT1加重画像を取得します。MRスキャナで検出するのに十分なウイルスが注入されるようにベクターの約10マイクロリットルを注入した後、観察されたウイルスの広がりに明らかなように正しいカニューレ配置を検証するMR画像を取得する。挿入されたカニューレの深さが間違っている場合は、それに応じて深さを調整するか、ゆっくりとカニューレを取り外して挿入を再試行してください。
オンラインMR画像のガイダンスを介して注入を監視します。注入速度を数分ごとに毎分1マイクロリットルずつ毎分5マイクロリットルに増やします。注入速度をゆっくりと上げ、高い注入速度が組織損傷を引き起こす可能性があるため、1分間に5マイクロリットルを超えないようにすることが重要です。
約40マイクロリットルのウイルスベクターを注入した後、1分間のステップで1マイクロリットルの注入速度を低減し始める。約50マイクロリットルを注入した後、注入を停止します。カニューレを10分間所定の位置に置いておきます。
ゆっくりと脳からカニューレを削除し、次の場所に移動します。動物輸送前の注射の終わりに無菌ドレープでシリンダーを覆い、その後、手術室に戻って動物を輸送します。連続コロナセクションの組織学的分析は、輸液部位の周りの大規模な光遺伝学的発現を明らかにする。
ここに示されているのが、同じMRコロナスライスに対する注入後の造影剤のベースラインコロナMR画像と広がりである。コロナ組織部はほぼ同じから示される。ペルオキシダーゼ染色は、黄色蛍光タンパク質またはEYFPレポーターの発現を反映する。
表面エピフルーレセンスと組織学的染色で測定されたEYFP発現の領域間で良好なアライメントが観察される。これらには、MR画像から推定されるベクトル拡散の領域が含まれる。白い点は注射部位を示し、黒い領域全体が頭蓋骨切り出しによって露出した領域を表す。
ここに示されているのは、体性感覚皮質におけるYFP発現の内側側側面を示す抗GFP抗体で染色されたコロナ切片の低倍率画像である。黒い矢印はカニューレトラックの位置を示します。隣接する組織は、YFP陽性細胞の層分布を示すために、より大きな倍率で示される。
YFP陽性細胞の人口密度の高い領域は、主に2〜3、5〜6の層に位置しています。さらに拡大すると、2 ~ 3、レイヤ 5、およびレイヤ 6 の典型的なピラミッド型セルが明らかになります。カニューレは、流れが止まった後10分間、そのままにしておいていることが重要です。
これにより、ウイルスが周囲の標的となる神経組織に浸透することが保証されます。CEDは、哺乳類の大きな脳領域全体で均一に高い発現レベルを達成するための効率的なアプローチです。これは、神経回路と接続性に関する理解を広げる可能性を秘めています。
CEDによるウイルス伝達後、その後の光遺伝学的刺激実験を電気記録および行動エッセイと組み合わせ、脳内の複雑な回路ダイナミクスを明らかにすることができる。この技術は、2018年にYazdan-Shahmoradらの研究グループによって採用されており、光遺伝学的神経変調が感覚運動皮質のネットワーク全体の接続性変化を誘導するために使用されました。
