Name: induction of drug-induced, autoimmune hepatitis in balb/c mice for the study of its pathogenic mechanisms
Uploaded: 2020-05-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
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Njoku博士は、このモデルの策定につながった彼の指導と洞察に満ちた議論について、MD博士のNoel R. Rose博士に感謝したいと思います。

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著者らには開示するものは何もありません。

このプロトコルの強みは、その再現性にあります。したがって、提案された手順に従うことが重要です。免疫原の製剤は、いくつかの障壁となり得る;しかし、我々は我々の文書に記載されているエピトープを使用してモデルを再現したので、肝臓のS100画分を単離する必要性は取り除かれた。追加のエピトープまたはタンパク質が改変され、免疫化後に肝炎を誘発する可能性がある。ただし、信頼できる結果で使用したタンパク質について説明します。いくつかのタンパク質は、ハロゲン化麻酔薬曝露時にトリフルオロアセチル化されることが実証されている。エピトープ拡散に起因する可能性が最も高いが、これらのタンパク質のいくつかは、それらの天然の非トリフルオロアセチル化状態における自己抗体の標的でもある。一例として、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体(PDH-E2)のE2サブユニットは、TFA付加物中のTFA部分と構造的に類似したエピトープ(リポ酸補欠分子基)を運ぶ。ハロタン肝炎患者において産生された抗体は、TFAタンパク質およびPDH−E2に対して交差反応性であることが実証されている20,21。
私たちのDIHモデルでは、マウスの背中に沿ってCFAで乳化された2つの免疫が必要です。CFAによる足パッド注射は、マウスの痛みや苦痛と関連していることがわかっています。したがって、実験DIHモデルの開発には、いくつかの実験的試験が含まれていた。CFAを用いた1回の免疫を用いてモデルを評価し、我々の免疫原を用いた両方の注射において、不完全フロイントアジュバント(IFA)またはIFAを用いた2回目の免疫化では、肝炎症は発症しなかった。対照的に、CFAによる2回の免疫を用いてマウスを免疫原で免疫した場合、有意な肝炎症が存在した。自己免疫性肝炎の別のモデルの元の記述には、我々の研究と同様の研究が含まれ、有意な肝炎症を実証するためにCFAによる2回の免疫化が必要であった8。それでも、文献検索を使用してアジュバントを継続的に再評価し、CFAなしで炎症を最適化しようとしています。例として、B細胞応答を増強するであろう周知のアジュバントTiter Maxがある。しかし、抗体はDIHの構成要素であるが、我々と他の人々は、我々のモデル14においてT細胞応答に重要な役割を実証している。
信頼性の高いモデルの開発は、DIHの病因の調査を容易にする。我々は、肝臓組織学および免疫細胞が、このモデルの様々な段階で確実に評価できることを実証する。我々は、DIHの開発を研究するために利用できる抗原特異的T細胞、血清抗体および組織サイトカインの同定を実証する。我々は、炎症を起こした肝臓から細胞を単離する方法を実証し、ヘパリンの使用を提案する。しかし、我々はヘパリンなしでこの技術を行い、結果は区別がつかなかった。さらに、組織破壊の現在の方法もまた、肝臓から細胞を放出し得る。
最近では、次世代シーケンシングや定量PCRなどの最新のツールを活用し、再現性のある結果を達成しています。BALB/cをバックグラウンドで誘導したIL-4、IL-4受容体、IL-6、IL-6受容体IL-33、ST2遺伝子欠損マウスを用いたDIHに関する成果を発表し、BALB/cマウスをコントロールマウスとして利用できるようにしました。DIHのこのモデルの将来の応用には、DIHの病因の原因となるこれまで認識されていなかったメカニズムを明らかにするために、CRISPR技術の利用に加えて、マウスのノックインの開発が含まれる。

この方法の目的は、生体内で発症する薬物誘発性自己免疫性肝炎のマウスモデルを記述し、この疾患の分子的、免疫学的および遺伝的基盤を調査するためにどのように利用できるかを実証することである。私たちの研究の長期的な目的は、感受性のある患者のDIHを研究することによって、慢性肝臓の炎症および傷害の発症に関与するメカニズムを明らかにすることです。肝疾患および肝硬変は、25〜64歳の成人における6番目に多い死因を構成する。薬物誘発性自己免疫性肝炎(DIH)と呼ばれることもある特異なDILIは、米国における急性肝不全の3番目に一般的な原因である。DIHは、自己免疫性肝炎患者の約9〜12%で観察される最も一般的な肝薬剤誘発性過感作プロセスである1。DIH患者の圧倒的多数は女性2,3,4である。DIHの一種は、イソフルラン、セボフルラン、デスフルランまたはハロタンなどのハロゲン化揮発性麻酔薬の投与後に感受性の高い個体に発症する。これらの麻酔薬は、代謝の反応性産物とともに肝臓タンパク質に共有結合し、アレルギー応答または自己免疫応答を惹起することができる新規自己抗原を創り出す5。
麻酔薬およびあらゆる形態のDIHの発達に関与する病原性メカニズムの研究は、ヒト疾患の誘発を密接に模倣する動物モデルの欠如によって以前に妨げられてきた。我々は、患者における免疫媒介性DILIに似た特徴を有するDIHの実験的マウスモデルを開発した。肝炎は、酵素シトクロムP450 2E1(CYP2E1)5による麻酔薬の酸化的代謝に続いて形成されるトリフルオロアセチルクロリド(TFA)代謝産物によって共有結合的に修飾された2つの自己抗原のうちの1つによる免疫によって誘導される。1つの自己抗原は、いくつかのタンパク質6の混合物である肝細胞質S100肝臓画分であり、第2の自己抗原は、麻酔免疫媒介性DILI7を有する患者からの血清によって認識されるCYP2E1のエピトープである。実験的自己免疫性肝炎に比較的耐性のあるBALB/cマウスを用いることで、C57Bl/6Jマウスの自己免疫性肝炎のS100誘導免疫モデルと我々のモデルを区別した8.
その多様な臨床プレゼンテーションのために、DIHは患者で研究することは困難です。翻訳実験モデルは、インビボおよびインビトロで疾患の病因を評価する能力を提供する。現在のところ、動物を使用せずにインビボまたはインビトロの適応免疫応答または自然免疫応答を完全に調べるDIHを誘導するための他の代替方法はありません。さらに、S-100またはCYP2E1エピトープのトリフルオロアセチル化は刺激性免疫原を産生するようには見えず、TFA改変タンパク質による免疫化によってDIHを誘導しているため、これらの動物は、免疫化または他の処置の前にエーテル、ハロゲン化麻酔薬、バルビツール酸またはアルコールを投与されない。それでも、我々は、発見したCYP2E1エピトープ9 の結合嗜好を確認するためにコンピュータシミュレーションを利用してマウスの使用を減らし、雌のBALB/cマウスがより重篤なDIH10を発症することを実証することによって、女性の性別に関与するヒトDIHを反映した。
患者におけるDIHの多様な提示および臨床疾患の研究における課題にもかかわらず、反応性薬物代謝産物による天然タンパク質の翻訳後修飾は、ハロゲン化麻酔薬に続く病因DIHにおいて受け入れられている重要なメカニズムである11。研究者らはまた、CYP2E1がこのプロセスにおける主要な自己抗原であることを認める12,13。翻訳後修飾CYP2E1および他の肝臓タンパク質を認識するインターロイキン(IL)-4-アップレギュレートCD4+T細胞の役割は、好中球、好酸球および肥満細胞を肝臓に引き込むことによって麻酔DIHの受け入れられた開始剤であり14、このメカニズムはDIH15,16の多くの形態で確認されている。誘導されたFoxP3発現CD4+CD25+T細胞(Tregs)はDIHの重症度を低下させ、脾臓におけるこれらの細胞の相対的欠損はDIHを悪化させる10,7。したがって、DIHの理解における進歩の大部分は、in vivoマウスモデルを利用して、in vivoおよびin vitroの両方でDIHの遺伝的、代謝的および免疫学的メカニズムを評価することによって可能になった。
我々と他の研究者は、異なるマウスモデルを用いたDIHの開始におけるIL-4、好中球、好酸球の役割を明らかにしたので、この観察は、利用されたDIHモデルにかかわらず、肝炎および傷害はIL-4によって誘発されるという我々の主張を支持すると信じている。私たちのプロトコルの強みは、雄と雌の両方のマウスのin vivo方法論の利用、および組織学、CD4+ T細胞増殖アッセイ、サイトカインの繰り返しにあります。インビトロ研究の強みは、DIHを駆動する細胞相互作用を単離するための方法論を提供しながら、必要なマウスの数を減らすことです。これは、DIHの発生率、有病率、および重症度が女性でより高いため、結果の解釈における無意識の偏りの可能性を低減し、研究の翻訳の可能性を強化するため、雄および雌マウスの使用をお勧めします17。マウスは単一のベンダーから入手することをお勧めします。ただし、これが不可能な場合は、遺伝子組み換えマウスと同じベンダーから同腹仔対照または野生型マウスを入手してください。

<table><tbody><tr><td>0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>28997</td><td></td></tr><tr><td>AKP Substrate Kit</td><td>BioRad</td><td>172-1063</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c mice</td><td>Jackson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTrace&amp;trade; CFSE Cell Proliferation Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CFA H37Ra</td><td>Becton Dickinson (Difco Bacto)</td><td>231131</td><td></td></tr><tr><td>FcR Blocking reagent</td><td>Milteyi</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>General supplement</td><td>ThermoFisher</td><td>HPRG770</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG&amp;trade; cells cryopreserved</td><td>ThermoFisher</td><td>HPR GC10</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>NaHC03</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&amp;reg;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1644-1L</td><td></td></tr><tr><td>Pertussis Toxin</td><td>List Biologicals</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline pH 7.4</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free</td><td>ThermoFisher</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Hydroxide</td><td>JT Baker</td><td>3140-01</td><td></td></tr><tr><td>S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>177474</td><td></td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>66810</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&amp;trade; SDS Solution, 10%</td><td>ThermoFisher</td><td>24730020</td><td></td></tr><tr><td>Williams Media E, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

induction of drug-induced, autoimmune hepatitis in balb/c mice for the study of its pathogenic mechanisms

薬物誘発性自己免疫性肝炎(DIH)は、自己免疫性肝炎患者の約9〜12%で観察される最も一般的な肝性薬物誘発性過敏症プロセスである。DIH患者の圧倒的多数は女性です。有病率におけるこれらの性差の根底にあるメカニズムは、ヒトの疾患を模倣する動物モデルの不足のために不明である。それでも、根底にあるメカニズムは、ヒト白血球抗原ハプロタイプおよび性ホルモンと関連していると広く考えられている。対照的に、DIHマウスモデルを用いて、我々は、シトクロムP450 2E1のエピトープに対するIL-4開始CD4+ T細胞が、好中球、マクロファージおよび肥満細胞の雌BALB/cマウスの肝臓への流入を誘導することを明らかにした。このモデルを用いて、我々はまた、IL-33誘導性FoxP3+制御性T細胞が雌および雄マウスにおいてDIHに対する保護を付与することも示した。このDIHモデルは、DIHに関連する薬物代謝産物と共有結合で改変されたCYP2E1のエピトープでマウスを免疫することによって誘導される。このエピトープは、DIHを有する患者によって認識される。我々の方法は、DIHの病因を研究するために利用することができる堅牢で再現性のある肝炎および自己抗体を誘導する。インビボ研究は不適切に行われるとマウスに過度の痛みや苦痛を引き起こす可能性がありますが、インビボモデルの利点は、多数のマウスにおける疾患の病因を評価する能力です。さらに、改変された肝臓タンパク質の生物学的効果は、侵襲的手順を用いて研究することができる。実験計画にin vitro研究を追加することで、細胞レベルでの迅速な反復と機械解析が可能になります。したがって、我々は、我々のモデルプロトコルと、DIHのインビボおよびインビトロメカニズムを研究するためにそれをどのように利用することができるかを示す。

図1に示すDIHを誘導するために利用される免疫化スケジュールは、首の付け根(0日目)および尾の付け根(7日目)で必要とされる2つの免疫化を表す。図2は、麻酔薬のCYP2E1、JHDN5、CYP2E1エピトープおよびトリフルオロアセチル(TFA)代謝産物に応答してCFSEを使用して14日目に得られた代表的な増殖データを示す。図3は、14日目に得られた誘導CD4+CD25+FoxP3+Tregsのゲーティング戦略および代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図4は、代表的なヘマトキシリンおよびエオジン染色スライドを示し、6日目の21日目の肝炎の進化を実証する。図5は、これらの肝臓10における比較細胞含量に加えて、21日目に雄と比較した場合、雌BALB/cマウスにおいてより重篤な肝炎を示す代表的なヘマトキシリンおよびエオジン染色スライドを示す。図6は、マウスIgGとミトコンドリアとの共局在化の欠如を実証する代表的な共焦点顕微鏡スライドを示す。図7は、JHDN5 IgGとミトコンドリアとの共局在を実証する代表的な共焦点顕微鏡法を示す。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59174/59174fig1.jpg"> 図1:肝炎を誘導するためのマウスの免疫化。 DIHは、雌のBALB/cマウス(一例として)において、完全フロイントアジュバント(CFA)で乳化したTFA-JHDN5(100μg)を首の基部の皮下(s.c.)で免疫し、0日目に後肢に筋肉内(すなわち)に50ngの百日咳毒素を免疫することによって誘導することができる(ステップ1)。7日目に、BALB/cマウスを尾部のbaeでCFA(s.c.)に乳化したTFA-JHDN5(100μg)で免疫することができる。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/59174/59174fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59174/59174fig2.jpg"> 図2:フローサイトメトリーを用いた自己タンパク質全体、自己タンパク質のエピトープ、またはTFAハプテンに対するCD4+ T細胞免疫応答の決定。 初期免疫後14日目に単離した6~8週齢のBALB/cマウスの脾細胞の単一細胞懸濁液をCFSEで標識し、TFA-OVA、CYP2E1またはJHDN5(10μg/mL)で刺激し、5%CO2、95%空気中(加湿)、CD4-APCで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。抗原を含まないウェル(培地)をコントロールとして用いた。BALB/cマウスは、培地と比較した場合、JHDN5ではなくOVA-TFAおよびCYP2E1に応答して増殖を発症した。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/59174/59174fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59174/59174fig3.jpg"> 図3:2.3.7に記載の方法を用いてCD4+CD25+FoxP3+誘導Tregsを同定するためのゲーティング戦略。最初のゲートは生細胞を識別します。免疫細胞を検出するために、CD45+細胞を最初にゲーティングした。次に、CD4+ T細胞を同定してゲーティングし、続いてCD4+ T細胞集団内のCD25+FoxP3+細胞を同定した。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/59174/59174fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59174/59174fig4.jpg"> 図4:肝炎の肝臓組織の組織学的分析。 CFA免疫マウス(トップパネル)をビヒクルコントロールとして使用した。S100免疫マウス(中央パネル)は、同じスケジュールで以下の免疫化を評価した。21日目に、マウスを安楽死させ、肝臓をホルマリンで固定した。厚さ5μmの切片を作り、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)で染色した。CFA(上)およびS100(中央)免疫およびTFA−S100による免疫化に続く大量の炎症に続いて、最小限の肝炎症(青色細胞)が実証される。(H&E、倍率64X)。この図は、許可6 で使用されます。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/59174/59174fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59174/59174fig5.jpg"> 図5:雌のBALB/cマウスは、雄のBALB/cマウスと比較してより多くのDIHを発症する。 (A)雌マウス(n=8)は、TFA-S100/CFA免疫の3週間後に雄(n=7/群)よりも有意に重篤な肝炎を有していた。(b)雌および雄マウスからの代表的な肝臓切片(H&E、倍率64X)。(C) 肝CD4+、CD8+、NK+、およびNKT+細胞の数は、男性よりも女性の方が有意に高かった。SEM±平均 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.この図は、許可10 で使用されます。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/59174/59174fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59174/59174fig6.jpg"> 図6:マウスIgGはミトコンドリアと共局在化しない。 赤色蛍光(594)標識マイトトラッカーレッド(1:100)に加えて、緑色蛍光(488nm)標識マウスIgG(1:100)(緑色)で染色された終末分化肝細胞の共焦点画像。緑色蛍光(488nm)標識されたマウスIgGは、マイトトラッカーレッド(倍率63倍)と共局在化しません。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/59174/59174fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59174/59174fig7.jpg"> 図7:JHDN5 IgGはミトコンドリアと共局在化する。 赤色蛍光(594)-標識ミトトラッカーレッド(1:100)に加えて、緑色蛍光(488)-標識JHDN-5 IgG(1:100)で染色された終末分化肝前駆細胞の共焦点画像。緑色蛍光(488nm)標識JHDN-5 IgGは、水戸トラッカーレッドと共局在し、代表画像上の黄色の色相(倍率63倍)によって実証される。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/59174/59174fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

BALB/cマウスにおけるin vivo免疫型翻訳型肝炎モデルについて、本疾患に見られる性差を含む薬剤性自己免疫性肝炎の病態解明に利用することができる。このモデルが、in vivoおよびin vitro実験技術を使用して再現可能な分析をどのように実証するかを説明します。

BALB/cマウスにおける薬物誘発性自己免疫性肝炎の誘導による発症機序の研究

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

induction-drug-induced-autoimmune-hepatitis-balbc-mice-for-study-its

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

2.9K ビュー.  Johns Hopkins University. BALB/cマウスにおけるin vivo免疫型翻訳型肝炎モデルについて、本疾患に見られる性差を含む薬剤性自己免疫性肝炎の病態解明に利用することができる。このモデルが、in vivoおよびin vitro実験技術を使用して再現可能な分析をどのように実証するかを説明します。

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Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

実験的自己免疫性下垂体炎の誘導のためのマウス下垂体免疫原の調製

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

免疫・感染学

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

SJLマウスにおける実験的自己免疫性下垂体炎の誘導

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

The CYP2D6 Animal Model: How to Induce Autoimmune Hepatitis in Mice

Autoimmune hepatitis is a rare but life threatening autoimmune disease of the liver of unknown etiology1,2. In the past many attempts have been made to generate an animal model that reflects the characteristics of the human disease 3-5. However, in various models the induction of disease was rather complex and often hepatitis was only transient3-5. Therefore, we have developed a straightforward mouse model that uses the major human autoantigen in type 2 autoimmune hepatitis (AIH-2), namely hCYP2D6, as a trigger6. Type 1 liver-kidney microsomal antibodies (LKM-1) antibodies recognizing hCYP2D6 are the hallmark of AIH-27,8. Delivery of hCYP2D6 into wildtype FVB or C57BL/6 mice was by an Adenovirus construct (Ad-2D6) that ensures a direct delivery of the triggering antigen to the liver. Thus, the ensuing local inflammation generates a fertile field9 for the subsequent development of autoimmunity. A combination of intravenous and intraperitoneal injection of Ad-2D6 is the most effective route to induce a long-lasting autoimmune damage to the liver (section 1). Here we provide a detailed protocol on how autoimmune liver disease is induced in the CYP2D6 model and how the different aspects of liver damage can be assessed. First, the serum levels of markers indicating hepatocyte destruction, such as aminotransferases, as well as the titers of hCYP2D6 antibodies are determined by sampling blood retroorbitaly (section 2). Second, the hCYP2D6-specific T cell response is characterized by collecting lymphocytes from the spleen and the liver. In order to obtain pure liver lymphocytes, the livers are perfused by PBS via the portal vein (section 3), digested in collagen and purified over a Percoll gradient (section 4). The frequency of hCYP2D6-specific T cells is analyzed by stimulation with hCYP2D6 peptides and identification of IFN&gamma;-producing cells by flow cytometry (section 5). Third, cellular infiltration and fibrosis is determined by immunohistochemistry of liver sections (section 6). Such analysis regimen has to be conducted at several times after initiation of the disease in order to prove the chronic nature of the model. The magnitude of the immune response characterized by the frequency and activity of hCYP2D6-specific T and/or B cells and the degree of the liver damage and fibrosis have to be assessed for a subsequent evaluation of possible treatments to prevent, delay or abrogate the autodestructive process of the liver.

Infection of mice with an Adenovirus expressing the major human autoantigen cytochrome P450 2D6 (hCYP2D6) recognized by sera of patients suffering from type 2 autoimmune hepatitis results in a persistent form of autoimmune-mediated liver disease characterized by extensive hepatitis, fibrosis and generation of a CYP2D6-specific immune response.

CYP2D6の動物モデル：マウスにおける自己免疫性肝炎を誘導する方法

Autoimmune hepatitis is a rare but life threatening autoimmune disease of the liver of unknown etiology1,2. In the past many attempts have been made to ...

医学

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) resulting in cognitive and motor impairment. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model of MS, because it is also characterized by lesion formation in the CNS, motor impairment and is also driven by autoimmune and inflammatory reactions. One of the EAE models is induced with a peptide derived from the myelin oligodendrocyte protein (MOG)35-55 in mice. The EAE mice develop a progressive disease course. This course is divided into three phases: the preclinical phase (day 0 - 9), the disease onset (day 10 - 11) and the acute phase (day 12 - 14). MS and EAE are induced by autoreactive T cells that infiltrate the CNS. These T cells secrete chemokines and cytokines which lead to the recruitment of further immune cells. Therefore, the immune cell distribution in the spinal cord during the three disease phases was investigated. To highlight the time point of the disease at which the activation/proliferation/accumulation of T cells, B cells and monocytes starts, the immune cell distribution in lymph nodes, spleen and blood was also assessed. Furthermore, the levels of several cytokines (IL-1&#946;, IL-6, IL-23, TNF&#945;, IFN&#947;) in the three disease phases were determined, to gain insight into the inflammatory processes of the disease. In conclusion, the data provide an overview of the functional profile of immune cells during EAE pathology.

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

マウスからの初代肝細胞培養における炎症反応の誘導

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus SLE in C57BL/6 Mice

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

C57BL / 6マウスにおける全身性エリテマトーデス（SLE）のBM12誘導モデル

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible ...

Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model

In recent years, Hashimoto's thyroiditis (HT) has become the most common autoimmune thyroid disease. It is characterized by lymphocyte infiltration and the detection of specific serum autoantibodies. Although the potential mechanism is still not clear, the risk of Hashimoto's thyroiditis is related to genetic and environmental factors. At present, there are several types of models of autoimmune thyroiditis, including experimental autoimmune thyroiditis (EAT) and spontaneous autoimmune thyroiditis (SAT).
EAT in mice is a common model for HT, which is immunized with lipopolysaccharide (LPS) combined with thyroglobulin (Tg) or supplemented with complete Freund's adjuvant (CFA). The EAT mouse model is widely established in many types of mice. However, the disease progression is more likely associated with the Tg antibody response, which may vary in different experiments.
SAT is also widely used in the study of HT in the NOD.H-2h4 mouse. The NOD.H2h4 mouse is a new strain obtained from the cross of the nonobese diabetic (NOD) mouse with the B10.A(4R), which is significantly induced for HT with or without feeding iodine. During the induction, the NOD.H-2h4 mouse has a high level of TgAb accompanied by lymphocyte infiltration in the thyroid follicular tissue. However, for this type of mouse model, there are few studies to comprehensively evaluate the pathological process during the induction of iodine.
A SAT mouse model for HT research is established in this study, and the pathologic changing process is evaluated after a long period of iodine induction. Through this model, researchers can better understand the pathological development of HT and screen new treatment methods for HT.

Several types of animal models of Hashimoto's thyroiditis have been established, as has spontaneous autoimmune thyroiditis in the NOD mouse. H-2h4 mice are a simple and reliable model for HT induction. This article describes this approach and evaluates the pathological process for a better understanding of the SAT murine model.

マウス自然発症自己免疫性甲状腺炎モデルの作製

In recent years, Hashimoto's thyroiditis (HT) has become the most common autoimmune thyroid disease. It is characterized by lymphocyte infiltration and ...

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable health and financial burden on individuals and society. Therefore, it is critical to investigate the mechanisms underlying the pathogenesis and development of IBD. Here, a gut microbiota antigen-specific T cell transfer colitis model is described. CBir1 flagellin has been recognized as the immunodominant gut bacterial antigen in experimental colitis and patients with Crohn&#39;s disease. CBir1 TCR transgenic na&#970;ve CD4+ T cells, specific to CBir1 flagellin, can induce chronic colitis after adoptive transfer into immune-deficient Rag1-/- mice. The disease severity is assessed by histopathology. The CD4+ T cell phenotypes in colonic lamina propria are also determined. This model closely resembles the development of IBD, which provides an ideal murine model for investigating the mechanisms driving the pathogenesis of IBD and testing the potential drugs for treating IBD.

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

In this protocol, a gut microbiota antigen-specific T cell adoptive transfer colitis model is described. CD4+ T cells are isolated from CBir1 TCR transgenic mice. These are specific for an immunodominant gut microbiota antigen CBir1 flagellin, which is transferred into recipient Rag1-/- mice, leading to intestinal inflammation.

免疫不全マウスへのCBir1 TCRトランスジェニックCD4+ T細胞の養子移入による腸管炎症の誘導

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable ...

マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導と評価

Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple Sclerosis (MS) is a chronic autoimmune inflammatory disease affecting the central nervous system (CNS). It is characterized by different prevalence in the sexes, affecting more women than men, and different outcomes, showing more aggressive forms in men than in women. Furthermore, MS is highly heterogeneous in terms of clinical aspects, radiological, and pathological features. Thus, it is necessary to take advantage of experimental animal models that allow the investigation of as many aspects of the pathology as possible. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) represents one of the most used models of MS in mice, modeling different disease features, from the activation of the immune system to CNS damage. Here we describe a protocol for the induction of EAE in both male and female C57BL/6J mice using myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) immunization, which leads to the development of a chronic form of the disease. We also report the evaluation of the daily clinical score and motor performance of these mice for 28 days post immunization (28 dpi). Lastly, we illustrate some basic histological analysis at the CNS level, focusing on the spinal cord as the primary site of disease-induced damage.

著者スポットライト:雄マウスと雌マウスの両方に関連する汎用性の高い実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルの作成 

Experimental autoimmune encephalomyelitis is one of the most widely used murine models of multiple sclerosis. In the current protocol, C57BL/6J mice of both sexes are immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide, resulting mainly in ascending paresis of the tail and limbs. Here we discuss the protocol of EAE induction and evaluation.

BALB/cマウスにおける薬物誘発性自己免疫性肝炎の誘導による発症機序の研究

要約

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実験的自己免疫性下垂体炎の誘導のためのマウス下垂体免疫原の調製

SJLマウスにおける実験的自己免疫性下垂体炎の誘導

CYP2D6の動物モデル：マウスにおける自己免疫性肝炎を誘導する方法

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

マウスからの初代肝細胞培養における炎症反応の誘導

C57BL / 6マウスにおける全身性エリテマトーデス（SLE）のBM12誘導モデル

マウス自然発症自己免疫性甲状腺炎モデルの作製

免疫不全マウスへのCBir1 TCRトランスジェニックCD4⁺ T細胞の養子移入による腸管炎症の誘導

両性における多発性硬化症のモデル化:MOG_35-55誘発性実験的自己免疫性脳脊髄炎

BALB/cマウスにおける薬物誘発性自己免疫性肝炎の誘導による発症機序の研究

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