この技術は、より臨床的に関連する条件下での抗生物質感受性を測定することを可能にする。この技術はまた、凝集体で細菌を殺すことができる真の抗生物質濃度を決定することを可能にする。この手法は、GC凝集体を排除するために必要な濃度を決定するために適用することができる。
この方法は、凝集体を形成することができる細菌の抗菌感受性を測定するために適用することもできる。ライシスが完了したことを確認するために、ライシスのステップに注意してください。さもなければ、ATP測定アッセイは生存可能な細菌の数を過小評価する。
この方法を視覚化することで、他の研究者は一貫性を持ってこの実験に従い、複製することができます。37°Cと5%の二酸化炭素で16〜18時間のインキュベーションのために1%ケロッグを補充GCK寒天に、ナイセリア淋菌、またはGC株をストリーキングから始めます。翌朝、光顕微鏡を使用して、各プレートから暗いエッジを持つ暗い縁またはピリ陽性コロニーのないピリ陰性コロニーを慎重に選択し、選んだコロニーを新しいGCKプレートにストリークし、摂氏37度と5%の二酸化炭素で16〜18時間培養します。
翌朝、滅菌アプリケーターを使用して各プレートからGCコロニーを採取し、4.2%重炭酸ナトリウムと1%ケロッグ溶液を補充した暖かいスープで各綿棒を再中断します。650ナノメートル(OD650)で光学濃度を測定し、懸濁菌の濃度を決定し、GC濃度を1ミリリットル当たり8コロニー形成単位に約10倍に調整する。次に、96ウェルプレートの個々の井戸に99マイクロリットルのGC懸濁液を加え、細菌が摂氏37度と5%の二酸化炭素で6時間凝集できるようにします。
インキュベーションの最後に、各ウェルに連続希釈されたセフトリアキオンの1マイクロリットルを追加し、いくつかの井戸を未処理のままにしてコントロールとして機能し、プレートをさらに24時間インキュベーターに戻します。翌日、各井戸の懸濁液を1回144ワットで3回、超音波処理ごとに5秒間20キロヘルツを超音波処理し、各井戸に市販のATP使用率グロー試薬の100マイクロリットルを追加します。慎重に新しい96ウェル黒いマイクロプレートの個々の井戸に各井戸から混合物の150マイクロリットルを転送し、プレートリーダー上の560ナノメートルで各ウェルの吸光度を測定します。
次に、連続抗生物質処理後に得られた測定値と未処理のウェルからの測定値の比により生存率を算出する。ライブ/デッド GC 凝集体の視覚化のために、滅菌アプリケーターを使用して、一晩培養されたプレートから GC を収集し、1%ケロッグを補充した事前温められた GCP 培地で GC を再中断します。分光光度法でOD650を測定し、1ミリリットル当たり7コロニー形成単位に約10倍の濃度に調整します。
次に、GC懸濁液198マイクロリットルを8ウェルカバースリップボトムチャンバーに加え、チャンバー37°C、5%の二酸化炭素を6時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、凝集状態ごとに2マイクロリットルのセフトリアキコンで細菌を治療し、適切な実験インキュベーション期間のためにチャンバーをインキュベーターに戻します。インキュベーションの最後に、各ウェルに0.6マイクロリットルの生きた/死んだ染色液を加え、チャンバーをインキュベーターにさらに20分間戻します。
次に、共焦点顕微鏡を使用してZシリーズ画像を得る。GC 集計のサイズを測定するには、ImageJ で最初の画像を開き、フリーハンドラインを選択して、画像内の各集約の領域を丸めます。[分析と測定] をクリックします。
集計のサイズは、エリア列の下に示されます。各集合体の生染色から死死染色の蛍光強度比を定量化するには、分析をクリックして測定を設定し、ポップアップウィンドウで統合密度を確認します。[OK] をクリックし、[画像、色、チャンネル ツール] をクリックします。
死んだ細菌染色のための蛍光として色とチャネル1を選択します。各凝集の面積を丸くするフリーハンドラインを選択し、クリックして分析して測定し、統合密度列の各集合体の蛍光強度比を取得します。生きた細菌染色のための蛍光にチャネル2を選択し、ちょうど実証したように各集合体の蛍光強度を測定する。
次に生蛍光強度データを死発蛍光強度データで除算し、生蛍光強度比を得る。この代表的な実験では、非凝集したピリ陽性、凝集したピリ陽性または凝集および破壊されたピリ陽性細菌を、ATPレベルの測定前にセフトリアキシンの連続希釈で処理した。事前凝集GCは、セフトリアキコン以上の等濃度で処理した場合、非凝集または凝集破壊GCよりも有意に高い生存率を示した。
より大きな凝集体を形成するピリ陽性株は、突然変異株と比較してセフトリアキシン処理後に最も高いATPレベルを示した。試験された株に関係なく、抗生物質治療前の生きた/死んだ染色は、主に培養物の外側層に位置する死んだ細菌を明らかにし、ライブGCは主にセフトリアキソン処理された凝集体のコア内で同定された。予想通り、ピリ陽性菌が最大の凝集体を形成し、ピリ陰性培養が最も小さかった。
特に、ピリ陽性凝集体は抗生物質治療後もコア層で生きていたのに対し、小さくて緩い突然変異体凝集体のGCは死んでいた。GCの大きさと生存率に基づいて、相関グラフをプロットして、細菌の凝集サイズと抗生物質生存率との関係を調べることができる。超音波処理は、個々の細菌からのATPが密に結合された凝集体内で放出されることを確認するために重要です。
そうでない場合、測定値は一貫していません。細菌が凝集した後に細菌をプレート化し、抗生物質で処理され、生存可能な細菌と複製可能な細菌の両方を測定することが重要です。この技術は、抗生物質感受性に対する細菌凝集の影響を測定し、研究者が疾患を治療するためのより良い薬物を開発することを可能にする。
