35 S標識メチオニンとシステインを使用した放射性パルスチェイスは、依然として生細胞における時間とともにタンパク質生合成を調査する唯一の生化学的方法です。タンパク質の生合成は、翻訳、折りたたみ、組み立て、人身売買と劣化の両方をカバーしています。放射性パルス追跡と、ジスルフィド結合形成およびアセチル化などの共翻訳後タンパク質修飾の分析と組み合わせることで、タンパク質の信仰を時間とともに調査するための敏感で定量的なアッセイが得られます。
この手順では、良い焦点と実験的な処理が必要です。バッファー、放射性ワークスペース、明確なスケジュールなど、良い準備が不可欠です。このビデオは放射性脈拍追跡プロトコルの肩の上に明確な説明を提供する。
この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室のpHd候補であるHui Ying Yeohです。この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、トランスフェクト細胞および培養細胞をシードします。パルスチェイスの前に、顕微鏡を通して細胞を検査してください。
次に、2ミリリットルの洗浄バッファーで皿を洗います。そして、細胞に飢餓培地の2ミリリットルと15分間5%の二酸化炭素と摂氏37度で加湿インキュベーターに料理を置きます。パルスチェイスのセットアップが整っていることを確認してください。
水浴場のラックに皿を移し、摂氏37度に事前に温めます。食器が水と接触していることを確認しますが、浮かび上がらないようにしてください。次に、タイマーを開始します。
40秒で、飢餓培地を吸引する。マイクロピペットを使用して、600マイクロリットルのパルス溶液を引き出します。ちょうど1分で、皿の中央にパルス溶液を静かに加えます。
飢餓培地を取り除き、残りのディッシュのパルス溶液を1分間隔で追加するこのプロセスを繰り返します。ちょうど11分とすべての次の料理のために、パルスチェイススキームによると、ゼロ分チェイスサンプルを除いて、皿に直接チェイスメディアの2ミリリットルを追加します。チェイスメディアを吸引し、新鮮なチェイスメディアの2ミリリットルに置き換えます。
残りの皿すべてに対してこのプロセスを 1 分間隔で繰り返します。タイマーが正確に16分を読むとき、パルスメディアの上にゼロ分チェイスディッシュにチェイスメディアの2つのミリターを直接追加して、ラベリングを停止します。すぐに培地を吸引する。
冷却されたアルミニウム板に皿を移し、氷の冷たい停止バッファーの2つのミリターを追加します。他のすべての料理を摂氏37度のインキュベーターに移します。各チェイスディッシュをインキュベーターから各チェイス時間の終了の2分前にウォーターバスに戻します。
各皿の正確なチェイスタイムで、チェイスメディアを吸引し、冷却されたアルミニウム板に皿を移します。氷冷停止バッファーの 2 ミリリットルを追加します。.すべての皿を氷の上に置き、細胞をライスする時間があるまで緩衝液を停止します。
その後、停止溶液を吸引し、すべての皿を洗います。氷冷停止溶液の2ミリリットルと同時に3つ。停止溶液を完全に吸引し、一度に2つの皿に600マイクロリットルの溶解バッファーを加えます。
セルスクレーパーを使用して、皿の表面を十分に削り取りますが、そっとlysateを混ぜます。各皿から新鮮な1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにリセートを移します。遠心分離機は、15,000〜20,000Gで4°Cで10分間、核をペレットする。
サスペンション細胞のパルスチェイス用に1つの50ミリリットルチューブ内のタイムポイントあたり500万個の細胞を収集する。テキストの説明に従って、飢餓処理を実行します。水浴で15分間の飢餓手順の後、タイマーを開始します。
ちょうど1分で、細胞を含むチューブに直接希釈されていないラベルの275マイクロキュリーを追加し、混合するために渦巻きます。ちょうど11分で、ラベリングを停止するためにチェイスメディアの4ミリリットルを追加します。そしてすぐに9ミリリットルの氷冷停止溶液を含む氷上の15ミリリットルのチューブに1ミリリットルを移して、ラベリングを止めます。
連続するチェイスタイムポイントごとに9ミリリットルの停止溶液を含む氷上のチューブに1ミリリットルのチェイスを移すこのプロセスを繰り返します。免疫沈降後、最後の洗浄を完全に吸引する。20マイクロリットルのTEバッファーと渦でビーズを再懸濁します。
20マイクロリットルの2つのXサンプルバッファーを還元剤なしで追加します。サンプルを渦を出し、摂氏95度で5分間加熱します。再びサンプルを渦。
室温で12,000倍Gで1分間遠心分離機を用いた。500ミリモルDDTの1マイクロリットルを含む新鮮なマイクロ遠心チューブに、非減塩上清の19マイクロリットルを移します。必要に応じて、すべての液体が底部になるようにサンプルを素早く遠心分離します。
そして、摂氏95度で5分間加熱します。減らされたサンプルを冷やし、次に渦を冷まします。遠心分離機は、1分間室温で12,000倍Gで減少したサンプルと非還元サンプルの両方を1分間、1.1マイクロリットルの1モルNEMをすべてのサンプルに加えます。
本研究では、放射性パルスチェイスアプローチを用いて、タンパク質のフォールディングを分析し、無傷の細胞内で輸送する。付着パルスチェイスからのHIV 1 GP120の折りたたみと分泌をここに示す。非還元ゲルは、GP120の酸化フォールディングを示す。
パルス標識の直後に、ゲルの中で拡散バンドとして表示されます。追跡が進むにつれて、バンドはGP120でネイティブに折り畳まれたことを表すタイトなバンドに蓄積するまで、さらに拡散フォールディング中間体を通してゲルを下に移動します。これは、二硫化物結合の形成がタンパク質のコンパクト性を高め、完全に減少したタンパク質よりも速く移行する原因となると起こります。
還元ゲルでは、ジスルフィド結合とすべての分子が還元され、モビイルティに影響を与えない。したがって、移動性の違いは、分子質量の変化の結果に過ぎません。減少したシグナルペプチドの切断形態から還元シグナルペプチド切断形態への経時シフトは、GP120のトランスレーショナルシグナルペプチド切断を表す。
より多くのタンパク質がネイティブフォールドを達成し、そのシグナルペプチドを失うように、チェイス中に増加するシグナルペプチドの損失のために移動度が増加します。非還元および還元ゲルの両方で、GP120の分泌により、信号は約1時間以降に減少し始めます。メディアを分析することで監視できます。
この方法は、オルガノイド細胞モデルを含む任意の細胞株に適用可能である。しかし、成功は、目的のタンパク質の発現レベルに大きく依存します。この手順を開始する前に、料理に印を付け、実験を通してこの順序を維持してください。
飢餓培地を追加する前に、すべてが準備されていることを確認してください。これが実験の始まりです。そして、あなたのラボの時間はあなたの友人ですが、あなたが準備ができていないときにあなたの最大の敵になることができます。
ビルの追跡は、時間とともにタンパク質の完全な財産を調査するために限られたタンパク質分解と組み合わせることができます。また、選択された異なる冷凍庫の方法では、すすいまたは厳格化または電荷差の分析が可能になります。研究者と装置を保護するために、すべての地域の放射線安全規則に従わなければなりません。
そして、保護措置はプロトコルに従って取られるべきです。あなたのSTHページに使用されるアクリルアミドは神経毒性であることに注意してください。
