生きたマウスにおける結腸のミニ内視鏡的評価は、同種の造血幹細胞移植時に急性グラフ対宿主病GvHDの腸管症状を調査するための重要な実験的支援を提供する。急性GvHD関連大腸炎の非侵襲的評価は、金標準組織病理学の働く代替として機能し、それによって繰り返し動物の犠牲をレンダリングして不必要な組織標本を得ることができる。手順を実証すると、私の研究室のポストドクターであるベラ・ブッチェレです。
受け手BALB/cマウスの全身照射の翌日、CD-45.1ライブ5B6 SJLドナーマウスを清潔な働く鞘の上の起こりやすい位置に置き、1つの13cmの湾曲した鋸歯状の先端を使用して1つのアキレス腱で毛皮を持ち上げます。硬化した8.5cmの細かいはさみをストレートチップで使用し、鉗子と1つのかかとの間の皮膚を切開し、切開を角質的に伸ばし、後肢からの皮膚および毛皮の除去を容易にする。後肢から皮膚を取り除いた場合は、各股関節、足首、膝関節を切り取ります。
すべての後肢の太ももとシャンクを氷の上にPVSで満たされた単一の92mmペトリ皿に保管し、各骨からできるだけ多くの筋肉を慎重に取り除き、洗浄された大腿骨と脛骨を湿った氷の上の無菌RPMI 1640培地の50mLチューブに移します。骨髄を分離するには、新鮮なRPMI 1640培地で満たされた新しい92-mLペトリ皿に一度に1つの骨を移し、メスを使用して各骨の端を切断します。次に、26ゲージの針を装備した1mLシリンジを使用して、1mLの新鮮な培地で骨を一度に5mLの培地を含む50mLの回収チューブに洗い流します。
すべての骨が洗い流されたら、崩れた骨髄片を数回上下にそっとピペットして単一細胞懸濁液を生成し、40マイクロメートルのメッシュスクリーンセルストレーナーを通して新しい50mLコレクションチューブに濾過します。ペレットは、遠心分離により細胞を5 mLの塩化アンモニウムカリウムライシスバッファーに再懸濁し、室温で3分間のインキュベーションを行った。インキュベーションの終わりに、PVSの10mLで反応を停止し、再度遠心分離した細胞を。
ペレットをカウント用の新鮮なPVSの2mLに再懸濁し、下流のフローサイトメトリック分析のために6倍の10を6倍の6倍の6番目のセルアリコートに置いた。次に、市販の細胞精製キットを使用して、骨髄単細胞懸濁液からCD90.2陽性T細胞を磁気的に枯渇させ、分離前後および分離後の下流流細胞量分析のためにT細胞枯渇溶出液の6番目の細胞アリコートに1回10回を確保した。次に、30ゲージの針を備えた1mLシリンジを使用して、100マイクロリットルのPVSで5倍のT細胞枯渇骨髄細胞を静脈内に5倍10回注入し、各照射されたレシピエント動物の静脈のレトロブルバー空間に静脈内に注入する。
翌日、ドナー動物から採取した脾臓を50mLのコレクションチューブの40マイクロメートルメッシュストレーナーに置き、注射器プランジャーを使用してストレーナーを通して脾臓組織をチューブに押し込みます。PVSでストレーナーとプランジャーを洗浄し、すべての脾細胞を収集し、遠心分離によって細胞をペレットにします。赤血球のリシスが実証された後、カウントのために白血球を再中断し、下流の細胞測定分析のために6回10を6回60回60回6番目の細胞アリコートに置いた。
全細胞細胞からCD3陽性T細胞を全分分離する場合は、製造者の指示に従って市販の細胞精製キットを使用し、細胞の純度および分離後の細胞量測定前後の下流フローサイトメトリック分析のために、陽性細胞分から6番目のCD3陽性T細胞アリコートから10回10回を確保した。次いで、PVSの100マイクロリットルの5回目のアロ反応性CD3陽性T細胞を静脈内に7回10回注入し、各レシピエントマウスのレトロブルバー空間に静脈内にGvHDを誘導する。遠位大腸部のミニ内視鏡検査によりGvHD関連病変をスコア化するには、片方の手で尾根のすぐ上にあるレシピエント動物の尾を持ち上げ、もう一方の手で肛門を介して内視鏡を直腸に慎重に挿入する。
気流が大腸腔を膨らませる間、ゆっくりと慎重に内視鏡を腹腔方向に前方に動かします。大腸腸損傷を避けるために、この位置を助けるためにライブビデオスクリーンを使用して、内腔の中央部に内視鏡を保ちます。ビデオストリームを記録し、炎症をスコア付け開始し、図示したようにパラメータを採点することによって結腸のGvHD関連の炎症を評価する。
スコアリングスポットが見つかったら、内視鏡を穏やかに、わずかに前後に動かして、異なるパラメータを評価します。パラメーターの半透明性と便の一貫性を評価するには、大腸壁に関連して広い距離に内視鏡を配置します。病変の粒度および血管を評価するために、内視鏡を大腸壁に近い位置に置き、内視鏡の先端を有する大腸壁に十分に加量の張力を慎重に適用する。
スコアリングプロセスが完了したら、記録を停止します。対照と比較して、実証された同種造形幹細胞移植は、レシピエント動物における臨床GvHDスコアを徐々に増加させる全身GvHD表現型の再現的に堅牢な誘導を生み出す。これらのミニ内視鏡的評価可能な基準は、遠位結腸における腸GvHD疾患関連病変の正確な説明、スコアリング、およびグレーディングのためのアロ応答駆動性大腸炎スコアリングパラメータのコンテキストで、以前に報告された同質性大腸炎から特異的に適応された。
実際、ミニエンドスコスベースの採点システムは、GvHDを本質的に欠いているコントロールマウスから腸炎症の重篤な徴候を有するドナーリンパ球受け取りマウスの容易な差別を可能にする。対照対照マウスの大腸組織は、多くの場合、軽度の組織病理学的炎症徴候に対して、小エンドスコピカルに検出可能な大腸炎の仮想欠如と一致して示さなかった。
さらに、小エンドスコス的に評価された大腸炎活性と全身GvHDスコアとの間の相関研究は、ミニ内視鏡的に3つ以下のいくつかのスコアを確実に決定し、組織病理学的グレーディングから得られた中級から高等級の腸GvHD関連大腸炎症スコアの欠如を確実に予測することを示している。また、内視鏡的に評価された腸GvHDの重症度は、全身GvHD疾患活性との相関を示す。大腸炎症のミニ内視鏡評価の結果を標準化し、時間の経過とともに異なるマウスおよび実験間で比較可能性を確保するために、定義された解剖学的部位をスコアリング用に選択する必要があります。
大腸炎症のスコアリングに加えて、ミニ内視鏡的セットアップ内の組み込みの作業チャネルは、標準的な組織病理学などの様々な下流解析に適用可能なビュー誘導組織生検の検索を可能にする。ミニ内視鏡検査の非侵襲的な性質のために、急性GvHD関連大腸炎は、事実上いつでも同じ動物内で繰り返し評価することができ、それによって腸GvHDに魅力的な洞察をもたらす。
