Name: isometric contractility measurement of the mouse mesenteric artery using wire myography
Uploaded: 2018-08-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
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テクニカル サポート、博士魏斉彼 (東呉大学、中国・蘇州) と博士ヤン寧喬 (陝西師範大学、西安、中国) に感謝します。この作品は中国の国家自然科学基金 (グラント 31272311、81373295、81473420)、優先度学術プログラム開発の江蘇高等教育機関 (グラント号のプロジェクト資金によって支えられました。ysxk-2016)。

動物操作機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) モデル動物研究センターの南京大学によって承認されました。
1. ソリューションの準備
<ol><li>HEPES Tyrode ソリューション (H-T) 137.0 mM NaCl、KCl 2.7 mM、1.8 mM CaCl2、1 mM MgCl2∙6H2O、5.6 mM D-グルコースおよび 10 mM HEPES、使用準備 pH 7.3 7.4。</li>
	<li>カルシウムなし HEPES Tyrode ソリューションを準備 (Ca2 +-無料の H T) 140.6 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2∙6H2O、5.6 mM D-グルコース 10 mM HEPES、pH 7.3 7.4 を使用します。</li>
	<li>124 mM KCl (高 K+) 15.7 mM の NaCl、KCl、124.0 mM 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2∙6H2O, 5.6 mM D-グルコースと 10 mM HEPES、pH を使用してを使用して HEPES Tyrode ソリューション準備 7.3 7.4。</li>
</ol>2. 実験準備
<ol><li>予熱時間 T と 37 ° C の水浴を使用した高 K+ソリューション。</li>
	<li>第 1 報システム、データ集録ハードウェアとコンピューターを入れます。</li>
	<li>慎重に各 H T 溶液 5 mL ですべて第 1 報室を埋めます。</li>
	<li>20 ml の 4 ° C H T と Ca2 +の 2 つのペトリ皿を埋める-H T ソリューションをそれぞれ、無料、氷の上を格納します。</li>
	<li>H T 溶液 20 mL でコーティング 10 cm シャーレを入力し、部屋の温度でそれを維持します。</li>
</ol>3. マウスの腸間膜動脈解離
<ol><li>頚部転位によって 8-12 週齢の c57bl/6 j 女性または男性マウスを安楽死させます。上向きの腹部とマウスを突き止めます。</li>
	<li>70% エタノールで腹部を湿らせます。鼠径部から腹側正中線に沿ってはさみで皮膚を切って、両側の脚に下方の最初の切開開始から切開を加えます。両面に皮膚を引っ張ってください。腹膜を開く同じような切開を行います。</li>
	<li>食道、大腸、体内から血管を餌と消化管を完全に隔離する他の結合組織を切るはさみを使用しています。</li>
	<li>鉗子、血液を洗浄する冷 H T ステップ 2.4 に用意され、数回 H T ソリューションで組織を優しくすすぎを含む皿に分離セグメントを移動します。</li>
	<li>2.5、準備したコーティングのシャーレにセグメントを分離を転送し、室温で上腸間膜動脈解離を行います。</li>
	<li>胃、腸、回腸、盲腸、時計回りの方向を滑らかにし、胃と盲腸の左側と右側の側では、それぞれピンします。</li>
	<li>腸間膜血管ベッドをストレッチし、公開解剖した腸間膜動脈にピンと腸を修正します。 注: これらの条件の下で、動脈は静脈の上にです。</li>
	<li>実体顕微鏡の伝送光源をオンにし、顕微鏡下で動脈を切り裂きます。全体の組織がソリューションに没頭していることを確認します。</li>
	<li>動脈周囲の脂肪組織を鉗子でクランプし、解剖はさみですべての結合組織を遮断し、動脈を分離します。避けるために、動脈を負傷します。</li>
</ol>4. 動脈取付
<ol><li>転送し、冷たい Ca2 +に上腸間膜動脈樹を浸す-余分な動脈を鉗子でクランプによって H T ソリューション (2.4 の手順で準備) を無料します。</li>
	<li>腸間膜のアーケードの腸の壁に近位動脈の 1.4 mm 部分を切断し、この動脈セグメントの両方の側面を慎重に開く 2 つの鉗子を使用します。</li>
	<li>ステンレス鋼ワイヤの長さ 2.5 cm の 2 つのセグメントを準備し、同じ皿にそれらを置きます。</li>
	<li>優しく、鉗子を用いた動脈の片方の端をクランプし、慎重に別の鉗子の助けを借りて 1 つずつ動脈の内腔に 2 本のワイヤを挿入します。ワイヤーがまっすぐに保持されますおよび血管内皮細胞には触れないでを確認します。</li>
	<li>2 つの鉗子を使用すると、スレッドの容器の外 2 つのスチール ワイヤを同時にクランプし、慎重に H T ソリューション (ステップ 2.3) で以前満ちていた第 1 報区域にシャーレから船を転送します。</li>
	<li>顎を離れてのネジ取り付け用のスペースを作る。2 つの鉗子を使用して 2 つの挿入された線のいずれかの両方の側面をクランプし、顎の隙間 (図 1 a) に容器を置きます。</li>
	<li>マイクロメータ (図 1 b) に接続されている顎のネジに固定線の両側を折り返します。</li>
	<li>左側のネジを時計回りにねじることによって修正します。右手の鉗子を使用してワイヤーをまっすぐにし、右側のネジを時計回りに (図 1) をねじることによって修正します。船は常に顎ギャップ内のことを確認してくださいが、損傷を避けるために顎を触れないでください。</li>
	<li>マイクロメータ (図 1) を使用して 2 つの顎を閉じる。2 つの顎が十分に近い彼らに触れないでお互い、固定線の上部に固定されていない線であるが、ことを確認します。</li>
	<li>右手の鉗子を使用して、慎重に探触子を強制的に接続されている顎の角でフロントレンズアセンブリのワイヤーを折り、右側にネジ (図 1E) 周りを時計回りに包んでください。ネジを固定します。線の左側にこの手順を繰り返し、左側にあるネジ (図 1 f) を修正します。</li>
	<li>慎重にマイクロメータ (図 1) を回転させることにより少し離れての顎を移動します。船のストレッチを避けます。鉗子を使用すると、探触子側でワイヤーの水平方向の平面にマイクロメータ側でワイヤーを移動します。2 つの顎の間のギャップはちょうど 2 つのワイヤを適応できるように、慎重にマイクロメータを回転します。</li>
	<li>他のチャンバーに動脈をマウントする手順 4.2-4.11.すべての部屋を装置に接続、チャンバー カバー、100% 酸素供給・温度プローブを接続、37 ° C に加熱を開始グラフ作成ソフトウェアを開き、録音を開始する、グラフ ビューウィンドウの開始ボタンを押します。</li>
	<li>約 20 分を平衡します。</li>
</ol>5. 正規化
注: 実験条件を標準化するために、血管の生理学的応答性信頼性の高いを取得する、正規化手順は必要な15です。アクティブな力と容器の内部の円周の関係, によると線第 1 報システムはマウントされた容器5,8の内部の円周 (IC) を評価するために標準の正規化プログラム 9。簡潔に、マイクロメータの IC (μ m) の計算、読み取って、トランスデューサーと X の値として値を入力するには、Y の値として力、すなわち、壁張力 (mN/mm)、休憩を出力します。プログラムは (X, Y) の曲線を戻り、100 mmHg (IC100) の経壁圧に対応する IC を計算します。船が正規化された内部の円周 (IC の1) に設定されているアクティブな応答性が最大。
<ol><li>デバイス上の力をすべてのチャネル 0 に設定し、別の 1-2 分の平衡します。</li>
	<li>正規化の設定から選択、「DMT メニュー、および次ようパラメーターを設定。 接眼レンズ校正 (mm/div): 0.36;圧 (kPa) をターゲット: 13.3;IC1/IC100: 0.9。オンライン平均時間 (秒): 2;遅延時間 (秒): 60。DMT 正規化の設定ウィンドウを閉じるに[ok]ボタンをクリックします。</li>
	<li>対応するチャネルの DMT の正規化] ウィンドウを開くには、 DMT メニューから目的のチャンネルを選択します。ウィンドウに定数値を入力すると、次のように: 組織エンドポイント a1: 0.1;組織エンドポイント a2: 4;線径 (μ m): 40。ウィンドウには、1.40 mm として計算される容器の長さが表示されます。</li>
	<li>適切な組織の部屋のマイクロメータをお読みください。マイクロメータの読みのボックスに値を入力し、ポイントの追加] ボタンをクリックします。この値 (X0) X の初期値です。60 秒遅延時間後力とこのメーターの値に対応する効果的な圧力 (ERTP) がウィンドウに表示されます。同時に、マイクロメータを読むボックスがアクティブになります。</li>
	<li>反時計回りの方向でマイクロメータを回すことによって正規化されている容器をストレッチします。マイクロメータを読むボックスにマイクロメータ値を入力し、ポイントの追加] ボタンをクリックします。60 の遅延時間を待ち再度 s。</li>
	<li>ステップ 5.5 を繰り返し、続行船をストレッチし、「マイクロメータ X1」、その IC1容器を伸ばすために必要な計算されたマイクロ メーター設定である値が表示されるまで、マイクロメータの値を追加します。</li>
	<li>1の値を X にマイクロ メーターを設定します。 注: 正規化された張力は通常 1-2 mN です。</li>
</ol>6. 動脈収縮記録
注: H T とこのセクションで使用される高 K+ソリューションを含む、すべてのソリューションは、手順 2.1 で調製しました。
<ol><li>正規化の後、15 〜 20 分のために部屋に容器を平衡します。 注: これらはこの手順では、ソリューションを変更する必要はありません。</li>
	<li>高 K+ソリューションの容器に 2 回挑戦します。<ol>
<li>船に挑戦、3-4 回 H T 溶液 5 mL で洗浄後、10 分のための収縮を誘発する高 K+溶液 5 mL と H T ソリューションを交換してください。 注: 一般的な収縮は、最大の力 3 mN および 2.5 mN12の周り一定の持続力。初挑戦 2.5 mN 以下の最大の力を生成するとともに、持続的な力を減少または 2 番目の課題は初めての用量よりもはるかに低い力を生成します、船は破棄され、さらに調査のため使用されません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>収縮を誘発し高 K+溶液 5 mL の容器に挑戦します。5 分後に 1 μ M の neoliensinine の最終濃度で血管をリラックス室に neoliensinine 原液 (DMSO 10 mM)14 0.5 μ L を追加します。</li>
	<li>力が安定している場合 (これは通常、いくつかの分を) 濃度を増加する 2 μ m 追加 1 μ L に原液のたびに t を生成する 4、6、8、10 μ M の濃度を増加する商工会議所に別 0.5 μ neoliensinine 原液を追加彼の用量反応曲線。 注: 在庫と作業濃度は薬によって異なります。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bevan, J. A., Osher, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+method+for+recording+tension+changes+in+the+wall+of+small+blood+vessels+in+vitro.">A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro.</a> Agents and Actions. 2 (5), 257-260 (1972).</li><li>Mulvany, M. J., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+situ.">Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ.</a> Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).</li><li>Mulvany, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+hypertension:+analysis+of+worldwide+data.">Global burden of hypertension: analysis of worldwide data.</a> The Lancet. 365 (9455), 217-223 (2005).</li><li>Good, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+Ion+Buffers+for+Biological+Research.">Hydrogen Ion Buffers for Biological Research.</a> Biochemistry. 5 (2), 467-477 (1966).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

高血圧は、心血管などの重篤な合併症など腎臓疾患16広範な公衆衛生課題です。高血圧の病因を理解とより抗高血圧薬の探索は、この分野で緊急の課題になっています。血圧が生成され、循環の末梢血管抵抗によって維持されます。ポアズイユの法則によると比較的小さい動脈循環抵抗の大きい割合を生成し、血圧3,10の主要生産者として役立ちます。したがって、太い動脈ではなく、小さな抵抗血管の測定は血圧の研究に適しています。ワイヤー第 1 報技術は、小さな抵抗血管の生理機能や血管疾患の病因を研究する最高の様相の 1 つです。
小型船舶ワイヤー第 1 報システムは、他のレポートにも記載されているし、大動脈9などのラットの腸間膜動脈8とマウスの動脈の収縮を測定するために使用されました。遺伝子操作、様々 な疾患モデルや薬物のスクリーニング モデル、マウスを利用して多くの分野で広く使用されているモデル動物となっています。したがって、ここでは、我々 はこのマウスの腸間膜動脈の収縮の測定法の修正されたプロトコルを提供しました。このレポートでは、正常に基本的なバッファーおよび取り付け手順の変更とマウスの腸間膜動脈の収縮力を測定しました。Vasocontractility 測定前のヴィヴォに関する多くの研究は、生理的食塩水を模倣するのに NaHCO3、クレブス ソリューションなどを含む溶液を使用しました。しかし、そのようなバッファーは CaCO3の生産の結果、測定中の pH 値を調整する CO2を必要があります。バッファー システムとして H T ソリューションを選択し、それがうまく発見します。温度は、pK値 HEPES のほとんど影響があるので、溶液の pH 値は室温調整は便利なとは 37 ° C 17に変更。さらに、私たちを使用して Ca2 +-無料 H T ソリューションのときに Ca2 +によって血管の収縮を防ぐために血管内腔を通してワイヤーを誘導します。このプロトコルでもう一つの変更は、取付手順です。いくつかレポート8,9およびデバイスのマニュアル5は、あごに最初の線を修正した後第 2 線材を指導することをお勧めします。我々 は、このメソッドは、限られた室内スペースのためのトランスデューサーの損傷を減らすことができるので、容器をマウントする前に血管内腔を 2 本のワイヤが導かれている場合、それは良い作品を見つけます。
このメソッドの高再現性にもかかわらずいくつかの重要なステップにもっと注意を払う必要があります。鉗子、はさみによって引き起こされる血管への損傷を避けるために最も重要であります。血管解剖時にオペレーターは鉗子を使用して軽く、脂肪組織をストレッチすると、結合組織をカットするときに慎重にはさみを使用します。さらに、クランプ固定用容器慎重に行う必要があり、内皮損傷血管は異常な応答、例えばに上昇を与えるためにワイヤーを導くとき、血管内皮細胞への損傷を避ける必要があります。, , 破損した容器表示アセチルコリン刺激後明白な力緊張正常の血管弛緩作用を示しています。この現象の説明は、破損した血管内皮細胞は一酸化窒素を正しく作り出すことができないです。実験では収縮の内皮細胞関連事件、内皮の状態する必要があります力測定前にテストすることに注意してください。さらに、我々 も慎重に顎に容器をマウントする必要がありますハード力で適用されている場合、探触子が簡単に破損しているので。最後に、通常使いません一定の増分値、マイクロメータの正規化を実行するとき。インクリメントの値は当初 30 または 20 μ m と効果的な圧力の後で 10 μ m に達する 11 12 kPa。このメソッドは、正規化時間を減らすことができ、overstretching、血管損傷をそれにより減衰を防ぐことができます。
我々 の調査はマウスの腸間膜動脈に焦点を当てて、ただし、このメソッドは大動脈、気管支と他の腎を含む小型船舶、脳や肺動脈の使用もできます。以来、このシステムには、4 つのチャンネルが含まれています、同時に 4 つの並列サンプルの測定に便利です。さらに、全体の腸間膜血管床が少なくとも 4 つの動脈セグメントを提供できる、つまり異なる実験グループの設計は非常に簡単。私たちの経験によると、各動脈セグメントは少なくとも 4 時間を存続させ、少なくとも 6 繰り返し良いレスポンス高 K+ソリューションを維持します。このプロパティは、さまざまな候補薬のいくつかの追加の効果の測定のため非常に便利です。ただし、ワイヤー第 1 報システムの制限もあります。Ex vivo線第 1 報実験は等尺性の vasocontractility を測定することができるだけが、通常容器の複雑な分析のための他の測定と組み合わせることはする必要があります。
要約すると、第 1 報配線システムを使用してマウスの腸間膜動脈の異性体の収縮の測定法について述べる。このメソッドは、血管平滑筋と平滑筋の弛緩を画面に機能を評価するために使用することができます。

ここで使用される小型船舶の第 1 報システムだった測定の内部直径 100 から 400 μ m 分離小型船舶 (約 2 mm 長い) に至るまでの小さな抵抗血管の等尺性収縮直径 40 μ m 2 本のワイヤーによって挿入されたし、順番にマイクロメータ側と探触子側の顎にマウントされています。この第 1 報手法だった 1972年1で最初に提案したし、Mulvany と彼の同僚2,3,の4,5,6が主に開発しました。今、安定装置、簡単なパフォーマンス標準正規化手順7,8,9と成熟した技術です。我々 はマウスの腸間膜動脈で測定にいくつかの変更でこのメソッドが利用されています。
血管平滑筋は、ほとんどすべての血管の壁を行します。その基本的な機能は、様々 な刺激に対する応答の収縮力を生成します。通常血管平滑筋収縮は血圧調節に欠かせない、栄養補完10。様々 な病気、高血圧、心不全、虚血.などの血圧測定結果の異常な規制いくつかの研究では、異常な血圧が血管平滑筋機能不全収縮7,11,12,13に関連付けられて常にことを示唆しています。第 1 報の方法では、血管収縮薬、阻害薬など様々 な刺激によるマウス血管の等尺性収縮の調査をことができます。収縮の成功の測定は、血圧維持と血管平滑筋疾患の新規治療アプローチを模索する病態のメカニズムを理解するのに役立ちます。
多くの中国のハーブは、血管疾患の臨床治療のため広く使用されています。ただし、その有効成分は通常不明のままに。したがって、有効成分の分離・同定は、新規治療薬の開発のため非常に重要です。第 1 報マルチ ワイヤ技術では、ハーブの有効成分をスクリーニングするための単純なアプローチを提供しています。小型船舶の第 1 報システムを使用してマウスの腸間膜動脈の収縮を調査するいくつかの研究を報告し、抗高血圧活動12,13,14天然化合物を識別しました。ここでは、詳細な説明第 1 報の方法のためのプロトコルし、ロータス (ハス春まき) 種子の胚から分離した neoliensinine の弛緩効果を評価14。

<table><tbody><tr><td>Multi wire myograph system</td><td>DMT</td><td>610-M</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel wire</td><td>DMT</td><td>400447</td><td></td></tr><tr><td>Geuder dissection scissor</td><td>DMT</td><td>400431</td><td></td></tr><tr><td>Dumont forceps</td><td>DMT</td><td>300413</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab/8SP</td><td>ADInstruments</td><td>ML785</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>ADInstruments</td><td>LabChart 5</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&amp;middot;6H2O</td><td>SigmaAldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>SigmaAldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100511-0250</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SigmaAldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SigmaAldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr></tbody></table>

isometric contractility measurement of the mouse mesenteric artery using wire myography

ワイヤー第 1 報技術を使用して脱分極の応答、GPCR アゴニスト/阻害薬.での血管平滑筋の収縮性を評価するには血管平滑筋の生理学的機能、高血圧など血管系の疾患の病態解明と平滑筋弛緩薬の開発に関する多くの研究で広く使用されます。マウス疾患モデル、遺伝子組み換え系統の大きなプールで広く使用されているモデル動物であります。詳細にマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮を測定する方法を紹介します。マウス腸間膜動脈の 1.4 mm のセグメントは分離され、内腔を通して 2 つの鋼線を渡すことによって第 1 報室にマウントされています。平衡と正規化の手順の後、血管収縮アッセイの前に 2 回高 K+ソリューションによってし。医薬品開発におけるこのメソッドのアプリケーションの例としてマウスの腸間膜の新規天然物質の neoliensinine、中国のハーブ、ハスの実 (ハス春まき。) の胚から分離した弛緩効果を測定動脈。第 1 報室に取り付けられた容器セグメント高 K+溶液で刺激を受けました。力の張力が安定した持続的な段階に達したら、neoliensinine の累積線量は商工会議所に追加されました。それは高血圧に対する潜在的な活性をクマが示唆その neoliensinine 平滑筋収縮に対する用量依存性弛緩効果があったとわかりました。さらに、血管できます取り付け後、少なくとも 4 時間を生き残るため、何回も、我々 はお勧めの高 K+ソリューションによる収縮性が維持された、創薬スクリーニングの時間のかかるプロセスの線第 1 報システムを使用すること。

第 1 報配線システムを使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮を測定し、, ロータス (ハス春まき) 種子の胚から精製した neoliensinine の弛緩効果を評価14. マウスの腸間膜動脈の分離、結合組織の洗浄、1.4 mm のセグメントにカットします。Ca2 +鋼のワイヤー 2 本で挿入された動脈セグメント-シャーレ、H T ソリューションを無料し、し、セグメントの第 1 報室 (図 2 a) の 2 つの顎にマウントされていた。セグメントをマウントした後 2 本のワイヤは、平行する、すぐお互い (図 2 b) に触れていないが、調整されました。力測定前に血管は正規化され船を安定させるために高 K+ソリューションによる 2 回。正規化中に、船は、IC、100の値に到達するまで数回を伸ばされ、各ストレッチ サイクルは、60 に堅牢な収縮、急速な緩和と力のメンテナンスを含まれている s (図 3)。通常高 K+ソリューションによる血管平滑筋の収縮を示した 2 つのフェーズ、堅牢なフェーズと、持続的なフェーズ (図 3)。血管をすることができる場合にのみ実験さらに高 K+を使用-通常で再現可能な誘発収縮が表示されます。Neoliensinine の代表的な測定は、図 4で表されます。力緊張誘発高 K+持続的な段階に達して、我々 はチャンバー カバーの穴を通って neoliensinine (1、2、4、6、8、10 μ M) の累積線量を追加しました。用量の増加と共に、力は用量依存的に減少。結果は、その neoliensinine は可能性がある候補者の抗高血圧薬14として作用する血管平滑筋弛緩物質示されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58064/58064fig1.jpg"> 図 1: 取付動脈の模式図です。青い線を表す線を表し、動脈が赤の四角形を表す。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58064/58064fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58064/58064fig2.jpg"> 図 2: 第 1 報室内にマウントされているマウスの腸間膜動脈セグメント。(A)マウスの腸間膜動脈セグメントは 2 つの鋼線を使用して 2 つの顎にマウント。白いバー = 2 mm。 マウントされたマウスの腸間膜動脈セグメント パネル (A) の(B) A 顕微鏡像。黒いバー = 0.5 mm.<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58064/58064fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58064/58064fig3.jpg"> 図 3: 代表的な元トレース高 K+ソリューションによって正規化手順と増強を示します。第二高-K+刺激後正規の実験を実行ことができます。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58064/58064fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58064/58064fig4.jpg"> 図 4: 高で契約されているマウスの腸間膜動脈の代表的なトレース-K + ソリューション neoliensinine の累積線量を追加することにより、リラックスと。力が用量依存的に減少用量の増加と共に、<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58064/58064fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

線第 1 報技術を使用して、血管平滑筋機能や画面の新しい薬を調査します。今回はマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮を測定して血管平滑筋の弛緩を新しいスクリーニングのための詳しいプロトコル。

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

isometric-contractility-measurement-mouse-mesenteric-artery-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

14.6K ビュー.  Nanjing University. 線第 1 報技術を使用して、血管平滑筋機能や画面の新しい薬を調査します。今回はマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮を測定して血管平滑筋の弛緩を新しいスクリーニングのための詳しいプロトコル。

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Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

単離骨格筋のミオ - 機械的分析

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

医学

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

中大脳動脈閉塞のマウスモデル

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

マウスの永久中大脳動脈結紮の応用

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

自動ワイヤの筋運動記録法を用いた腸間膜動脈の収縮と弛緩の研究

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Epidural Intracranial Pressure Measurement in Rats Using a Fiber-optic Pressure Transducer

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and cardiac arrest. This elevation may result in further neurological injury, in the form of transtentorial herniation1,2,3,4, midbrain compression, neurological deficit or increased cerebral infarct2,4. Current therapies are often inadequate to control elevated ICP in the clinical setting5,6,7 . Thus there is a need for accurate methods of ICP measurement in animal models to further our understanding of the basic mechanisms and to develop new treatments for elevated ICP.
In both the clinical and experimental setting ICP cannot be estimated without direct measurement. Several methods of ICP catheter insertion currently exist. Of these the intraventricular catheter has become the clinical 'gold standard' of ICP measurement in humans8. This method involves the partial removal of skull and the instrumentation of the catheter through brain tissue. Consequently, intraventricular catheters have an infection rate of 6-11%9. For this reason, subdural and epidural cannulations have become the preferred methods in animal models of ischemic injury. 
Various ICP measurement techniques have been adapted for animal models, and of these, fluid-filled telemetry catheters10 and solid state catheters are the most frequently used11,12,13,14,15. The fluid-filled systems are prone to developing air bubbles in the line, resulting in false ICP readings. Solid state probes avoid this problem (Figure 1). An additional problem is fitting catheters under the skull or into the ventricles without causing any brain injury that might alter the experimental outcomes. Therefore, we have developed a method that places an ICP catheter contiguous with the epidural space, but avoids the need to insert it between skull and brain. 
An optic fibre pressure catheter (420LP, SAMBA Sensors, Sweden) was used to measure ICP at the epidural location because the location of the pressure sensor (at the very tip of the catheter) was found to produce a high fidelity ICP signal in this model. There are other manufacturers of similar optic fibre technologies13 that may be used with our methodology. Alternative solid state catheters, which have the pressure sensor located at the side of the catheter tip, would not be appropriate for this model as the signal would be dampened by the presence of the monitoring screw. 
Here, we present a relatively simple and accurate method to measure ICP. This method can be used across a wide range of ICP related animal models.

A novel technique to record the pressures within the skull is described. The minimally invasive method uses a fibre-optic pressure sensing system to accurately measure intracranial pressure (ICP) in anaesthetized rats without causing significant brain trauma. The technique may be used in a wide range of experimental models.

光ファイバ圧力トランスデューサを使用したラットの硬膜外頭蓋内圧測定

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and ...

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

圧力筋運動記録法を用いた抵抗腸間膜動脈における筋原性応答および血管作用を評価します

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

圧力筋運動記録法を用いたマウス抵抗動脈機能を評価

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

生物学

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

マウスの心臓変力作用の調​​査のために分離された乳頭筋の収縮の測定

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

血管周囲脂肪組織による変調に焦点を当てた孤立腸間膜動脈を用いた血管緊張応答性の評価

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Measurement of Endothelium-Dependent Vasorelaxation in the Mouse Thoracic Aorta Using Tensometric Small Volume Chamber Myography

Small volume chamber tensometric myography is a commonly used technique to evaluate the vascular contractility of small and large blood vessels in laboratory animals and small arteries isolated from human tissue. The technique allows researchers to maintain isolated blood vessels in a tightly controlled and standardized (near-physiological) setting, with the option of adjusting to various environmental factors, while challenging the isolated vessels with different pharmacological agents that can induce vasoconstriction or vasodilation. The myograph chamber also provides a platform to measure vascular reactivity in response to various hormones, inhibitors, and agonists that may impact the function of smooth muscle and endothelial layers separately or simultaneously. The blood vessel wall is a complex structure consisting of three different layers: the intima (endothelial layer), media (smooth muscle and elastin fibers), and adventitia (collagen and other connective tissue). To gain a clear understanding of the functional properties of each layer, it is critical to have access to an experimental platform and system that would allow for a combinational approach to study all three layers simultaneously. Such an approach demands access to a semi-physiological condition that would mimic the in vivo environment in an ex vivo setting. Small volume chamber tensometric myography has provided an ideal environment to evaluate the impact of environmental cues, experimental variables, or pharmacological agonists and antagonists on vascular properties. For many years, scientists have used the tensometric myograph technique to measure endothelial function and smooth muscle contractility in response to different agents. In this report, a small volume chamber tensometric myograph system is used to measure endothelial function in the isolated mouse aorta. This report focuses on how small volume chamber tensometric myography can be used to evaluate the functional integrity of the endothelium in small segments of a large artery such as the thoracic aorta.

The present protocol describes the concepts and technical application of the tensometric myograph technique using a multi-chamber myograph system in the experimental ex vivo assessment of mouse aortic endothelial function.

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

要約

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単離骨格筋のミオ - 機械的分析

中大脳動脈閉塞のマウスモデル

マウスの永久中大脳動脈結紮の応用

自動ワイヤの筋運動記録法を用いた腸間膜動脈の収縮と弛緩の研究

光ファイバ圧力トランスデューサを使用したラットの硬膜外頭蓋内圧測定

圧力筋運動記録法を用いた抵抗腸間膜動脈における筋原性応答および血管作用を評価します

圧力筋運動記録法を用いたマウス抵抗動脈機能を評価

マウスの心臓変力作用の調査のために分離された乳頭筋の収縮の測定

血管周囲脂肪組織による変調に焦点を当てた孤立腸間膜動脈を用いた血管緊張応答性の評価

テンソメトリック小容量チャンバーミオグラフィを用いたマウス胸部大動脈の内皮依存性血管弛緩の測定

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

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中大脳動脈閉塞のマウスモデル

マウスの永久中大脳動脈結紮の応用

自動ワイヤの筋運動記録法を用いた腸間膜動脈の収縮と弛緩の研究

光ファイバ圧力トランスデューサを使用したラットの硬膜外頭蓋内圧測定

圧力筋運動記録法を用いた抵抗腸間膜動脈における筋原性応答および血管作用を評価します

圧力筋運動記録法を用いたマウス抵抗動脈機能を評価

マウスの心臓変力作用の調​​査のために分離された乳頭筋の収縮の測定

血管周囲脂肪組織による変調に焦点を当てた孤立腸間膜動脈を用いた血管緊張応答性の評価

テンソメトリック小容量チャンバーミオグラフィを用いたマウス胸部大動脈の内皮依存性血管弛緩の測定

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