Name: toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology
Uploaded: 2018-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
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著者は、彼らの助けと動物の世話の援助のケリー ロバロ、ヘイデンは True、Wupu Osimanjiang、スバーシュ Dhunghana ブッシュマン ラボのメンバーのためのワイオミングの大学のジェンキンス顕微鏡施設明見中学校みたいと思います。このパブリケーションによってできた制度開発賞 (アイデア) から国立科学研究所の一般医療補助金 # 2P20GM103432 [健康の国民の協会の。

アダルト スプレイグ ラットは、このプロジェクトで使用されていた、すべてのプロシージャは、ワイオミングの大学機関動物のケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 手術と生体内神経固定
注: すべての材料とこのプロトコルで使用される機器のベンダー情報は、材料のテーブルに表示されます。
メモ: In vivo神経固定組織を保持し、死の時間と神経のコレクション間で生じる構造劣化を軽減する使用されます。ティッシュの固定生体内では、灌流がこれへの前駆体では多くの場合組織の神経系組織の準備のための標準的な方法です。配置とその場で固定のため許可されて末梢神経のサイズ。コレクションと組織の劣化の可能性があるため安楽死した後ティッシュの固定はお勧めしません。
<ol><li>2-3% イソフルランと誘導の商工会議所に置くことで全身麻酔のラットを準備し、解剖マットの上にうつ伏せに麻酔下のラットを配置、イソフルラン麻酔の鼻の円錐形からの 1-2% で維持します。麻酔の十分な深さを確保するため後部のフィートのペダルの撤退のために動物をテストし、目の眼に触れることによって目で眼瞼反射の有無を確認します。 注: ケタミンの腹腔内投与はイソフルラン吸入方法が一般的に使用されます。</li>
	<li>坐骨神経、hind limb(s) の毛を剃るし、70% エタノールで剃られた区域をきれいします。メスやハサミで大転子まで膝から後肢に沿って皮膚の 2 ~ 3 cm 切開を行う場所切開の適切な場所を確保するため生殖不能のメスを用いた大腿骨の触診。大腿骨は、ちょうど坐骨神経の最もアクセスしやすいセグメントに近位に位置しています。にもかかわらず、生存非手術、生殖不能の技術を維持します。</li>
	<li>皮膚切開後、大腿二頭筋の筋と大殿筋の間飛行機を見つけると顕微解剖はさみを使って別の基になる筋膜と下線坐骨神経の 2-3 cm を公開します。坐骨神経の明確なセクションを公開するのにには、(図 1 a) の 2 つの筋肉の間のギャップを広げる収縮筋を使用します。微細鉗子とアイリスのはさみ、慎重に個別の神経周囲の結合組織、神経を切ったり圧縮が大きな世話からです。</li>
	<li>十分なトランプの固定 (4% のホルムアルデヒド、1.16 g NaH2PO4· の 1 × PBS (リン酸緩衝生理食塩水) で 1% グルタルアルデヒドを追加します。100 mL あたり H2O) に空洞の露出した神経神経をカバーし、10 分間座ってみましょう。必要に応じて、後肢の下場所ガーゼ脚より多く定着剤は、キャビティに追加できますように角度を改善するかどうか。10 分後、定着剤を削除し、この手順を 2 回繰り返します。</li>
	<li>解剖顕微鏡を用いたストレッチや坐骨神経をつまむことを確かめる細かい解剖はさみを使って両側から神経をカットし、すぐに 1 週間、変更のための 4 ° C でトランプの定着剤を含む 15 mL チューブで神経節を入れて、定着剤ごとの 48 時間。</li>
	<li>放置しないでください動物手術の任意の部分の間に。神経を除去した後麻酔中頚部転位によって動物を安楽死します。</li>
</ol>2 四酸化オスミウム処理と樹脂埋め込み
<ol><li>固定の記事、慎重に残りの脂肪や結合組織を神経から削除、鋭いメスを使用して神経をセグメント長さ (神経セグメントを分離し、異なるチューブでラベル付けすることができます): 約 5 mm にカットします。トランプの固定液で希釈した新鮮な 2% オスミウム四酸化を準備し、ガラス管に維持します。この短時間のプラスチック チューブにすることができます 2 時間 2% オスミウム四酸化で神経セグメントを浸します。 注: いくつかのプラスチック製のチューブは、四酸化オスミウム、プラスチック チューブの四酸化オスミウムの長期保存はお勧めできませんので、ソリューションの黒ずみの原因と反応します。</li>
	<li>培地を埋め込み、エポキシを使用して、最終的な埋め込み式を準備します。<ol>
<li>性ソリューション (ドデセニルこはく酸; A の混合物) 中の埋め込みエポキシを混合し、NMA ソリューション (methylnadic 無水; 混合物 B) 媒体を埋め込みエポキシをミックスします。A と B、マグネチックスターラーで攪拌して、少なくとも 20 分をミックス、両方の混合物をしましょう。</li>
		<li>使用直前に A と B の混合物を混ぜるし、DPM 30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) 混合物の総量の 1.5 〜 2.0% の割合アクセラレータを追加します。DPM 30 ソリューションを正確に色は濃く、脆性になるからブロックを防ぐために測定べきであることに注意してください。すべての樹脂化学物質、有毒である;皮膚への接触や吸入を防ぐために余分な世話をします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 mL チューブを使用して、PBS で神経セグメントを洗うし、異なるアセトン/蒸留水の通路で神経セグメントを配置することによって脱水処理を開始: 30%、60%、90%、濃度、各 10 分間、3 回 10 分ずつの 100% アセトンで。 アセトンの代わりに、エタノールを使用ことができます注意してください。</li>
	<li>樹脂浸透のため 1 部最終埋め込み混合物の混合物で神経セグメントおよび最終埋め込み混合物の 2 つの部分の混合物および 30 分の 1 の部分 100% アセトンの 30 分の 1 の部分 100% アセトンを配置します。、と最後に決勝で神経セグメント場所埋め込み混合物 30 分間。</li>
	<li>シリコーンゴム金型を埋め込み入れて神経セグメント (我々 は深さ 7 mm x 幅 71 mm × 106 mm を使用している; 深さ 3 mm x 幅 6 mm × 長さ 11 mm のブロック)。優しく全体神経セグメントをカバーし、空気の泡を避けるようにして、神経の上に樹脂を追加します。一晩 60 ° C で重合する樹脂と神経セグメントを含む金型をまま。</li>
</ol>3. ウルトラミクロトームによる区分
<ol><li>ガラスのナイフ メーカー (図 1 b) を使用してガラスのナイフの準備およびボート (図 1)、蒸留水に浮かぶ神経節を収集するために使用されているガラスのナイフ。</li>
	<li>ウルトラミクロトーム ホルダーに台形の面を上向きに樹脂が埋め込まれた神経ブロックを配置します。ウルトラミクロトーム スコープを使用すると、任意の余分な樹脂を周囲の神経組織をトリミングし、直面する台形形状のブロックを作ると、かみそりの刃のような単一研がれた刃を使用して、できるだけ神経の表面が縦に近い。四酸化オスミウムによるその暗い染色によって認識されている神経セグメントの縦の表面は浸透しません。 注: 余分な樹脂のトリミングは断面翼性能と後続の手順で切削向上させる樹脂部を減らします。</li>
	<li>ウルトラミクロトームを使用して、明白なガラスのナイフを使用して神経組織の一様断面の表面を公開するための十分な複数の断面を作る。これが終わったら、そのボートは室温で蒸留水を満たしたガラス ナイフに切り替える、薄い部分をカットする 1-2 μ m ウルトラミクロトームを調整します。</li>
	<li>ナイフ グラスボートからフローティング薄片を転送すると、金属製の輪 (図 1) を使用してスライド ガラスに脱イオン水のドロップ。炎の上のセクションを過熱しないように、数秒間数回を渡すことによってセクションを含むスライドを乾燥させます。トルイジンとすぐに乾燥したセクションを青い汚すまたは染色前に数日間常温で保存します。 注: セクションも乾燥できる 60 ° C で 15 分間暖かいプレートを使用します。遅い乾燥プロセスは、滑らかなセクションになります。</li>
</ol>4. トルイジン青染色
<ol><li>100 mL の脱イオン水にホウ酸ナトリウム 2 g を溶解してトルイジン ブルーの 1% 溶液を準備し、トルイジン ブルーの 1 g を加えて溶けるまでかき混ぜます。ろ紙を使用してソリューションをフィルター (細孔サイズ: 11 μ m) 2 週間室温で不透明なボトルのソリューションを維持し、。</li>
	<li>プラスチック ピペットまたはマイクロ pipettor を使用して、神経節の上にトルイジン ブルー溶液の一滴を追加し、20-30 秒のまま。</li>
	<li>脱イオン水の瓶にスライドがなだらかで余分なすべてのトルイジン ブルー ソリューションを洗い流すし、セクションが明確になるまでに 3-4 回を繰り返します。60 ° c または一晩室温でスライド、少なくとも 15 分を乾燥し、正規取付媒体を用いた coverslip でセクションをカバーします。常温で保存またはすぐにマウントされたスライドを確認します。</li>
	<li>光学顕微鏡下で調べます。詳細な画像 g 比を計算するために使用には 100 倍油浸漬レンズをお勧めします。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+between+angiogenesis+and+neural+development:+What+small+animal+models+can+tell+us.">Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us.</a> Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).</li><li>Grinsell, D., Keating, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+reconstruction+after+injury:+A+review+of+clinical+and+experimental+therapies.">Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies.</a> BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).</li><li>Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. 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M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+glue+as+a+stabilization+strategy+in+peripheral+nerve+repair+when+using+porous+nerve+guidance+conduits.">Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).</li></ol>

著者は、利害の対立があるないことを宣言します。

末梢神経損傷と再生の形態学的構造の検査、頻繁に研究13の。このプロトコルでは樹脂製ブロックに埋め込まれ、トルイジン ブルーで染色のラット坐骨神経組織を用いた組織学的データ数量の高品質の画像を取得する手順をについて説明します。この手法は、神経再生を軸索の数、髄鞘形成、浸潤線維組織の存在や健康神経の程度を測定することによって示すことができる神経の形態のイメージを提供します。画像表示区分と無傷の神経の処理、サンプル、同じ手順、材料、傷ついた神経に適用され、神経再生管や組織移植、提供組織の確定は十分な20、 21.
プロトコルのすべてのステップが不可欠な中、これらの手順の一部は質の悪いセクションまたは画像につながる可能性が高い。不十分な組織脱水は神経セクション (図 5 b) の穴につながる可能性があります。1 つの可能な説明は、水と樹脂の不混和現象と組織に余分な水分が組織を浸潤から樹脂を防ぐことができます。したがって、十分な時間と絶対アセトンの使用を許可する適切な脱水ステップを確保するため不可欠です。我々 はこのプロトコルでアセトンを使用するが、エタノールも使えます。多くの樹脂、しかしは、エタノールと反応組織は、エタノールの脱水と樹脂埋め込みの遷移として酸化プロピレンと扱われなければなりません。
セクションのため、ガラスのナイフからスライド ガラスに神経節を転送するべき細心 (図 5)。1-2 μ m のセクションは非常に壊れやすい、セクションの不適切な転送を破るセクションがします。セクションはセクションの中央部分に針で拾ったが、セクションは折り重なる自体になりやすいです、スライドへの転送時に展開することは困難があります。スライド ガラス、針、ループを含むセクションの転送のためのさまざまなツールを使用できます、それぞれ最高の転送結果が得られませんを決定する特定のユーザーをテストします。我々 の目的は、大きく全体のセクションを包含できるループを使って顕微鏡スライド (図 1) にガラスのナイフから転送された場合、セクションの折りたたみ削減できます。
一般に、神経の適切な処理は神経セクション (図 5 a) で発生するひび割れを引き起こす可能性があるため、神経の圧縮に不可欠です。神経組織の圧迫は、動物、固定、脱水、および樹脂を埋め込むことで露出の過程で神経セグメントの転送中に発生します。神経組織の圧迫を避けるためには、神経セグメント微細鉗子で転送する必要があります、ピックアップをセグメントの一端理想的に維層だけで全体の神経には影響はありませんので。亀裂と神経節 (ナイフをマーク) の存在が鈍いまたは使い古されたガラスのナイフのためもあります。最適な断面を保証、新鮮なガラスのナイフを作るとすべての 25-30 カット、コンジットを固めていた神経を切断少ないガラス ナイフを変更することをお勧めします。
樹脂は、比較的高価なことができますが不十分であるときに縦の神経節は必須であり、ウルトラミクロトームとガラスのナイフ メーカーなど高価なツールを必要とすることができます。これらの制限にもかかわらずトルイジン ブルー染色樹脂の周辺神経セクションは末梢神経形態4、5の断面の可視化のためのゴールド スタンダードにみなされます。縦断はまた軸索の継続性やランヴィエの絞などの末梢神経の重要な機能を明らかにすることができますが免疫組織化学で役に立ちます。このような場合は、差動同じ神経の 2 つのセクションを処理する一般的な方法は、トルイジンの青断面、縦断的免疫組織化学の他。末梢神経の外傷や傷害の増加が認と神経形態学的構造を評価するための良い方法のニーズのためこのメソッドは、神経の損傷と再生の組織学的データを得るために必要不可欠なツールとして適用する続行できます。

全身運動や感覚軸索1ターゲット組織を支配する末梢神経を拡張します。医学的障害によって引き起こされる末梢神経障害と外傷は主要な公衆衛生問題し大きな経済的影響2,の3を持っています。末梢神経損傷の結果を評価し、神経再生の理解の進歩にもかかわらず従来の神経組織や染色技術など、定性的・定量的評価神経の健康に不可欠なツール動物モデルやひと摘出組織のターミナルの結果測定。これはしばしば機能的な神経再生が発生しなかったかなぜ形態が明らかにできる末梢神経機能の電気生理学的測定とペアリングされています。
トルイジン ブルー染色樹脂埋め込まれている末梢神経の半薄いセクションの有髄神経線維、高品質を提供することをイメージングのための特殊なメソッドし、神経構造4,5,6 の詳細な画像をクリア.トルイジン ブルーは 18567でウィリアム ・ ヘンリー ・ パーキンが発見した、好酸性のメタクロマジー汚れをいくつかの医療応用8で使用されています。樹脂包埋神経セグメントから得られるトルイジン ブルー染色末梢神経節神経構造の明確な可視化が可能です。ミエリン鞘構造の可視化は、四酸化オスミウム ポスト固定4,9を使用して拡張できます。四酸化オスミウムは有毒酸化および脂質定着性エージェントの脂質の二重結合と対話する全く定義された脂質が豊富な髄鞘10の結果します。ただし、四酸化オスミウムは毒性、高価、長い神経セグメント, 培養を必要とし、常にされていません。
末梢神経形態の可視化のための処理と染色方法が開発されています。パラフィン、極低温断面とエポキシ樹脂埋め込み神経断面トルイジン ブルーで染色に続くまたはフェニレンジアミン ソリューションは、末梢神経再生11,12 の形態学的変化を定量化に使用されています.これらのメソッドは各軸索、ミエリン厚、軸索の直径、および有髄繊維径 (g 比) 11,13,14,15 軸索直径の数に自分の長所と収量の重要なデータがあります。.
このプロトコルでは樹脂埋め込む型の主な違いは、神経の組織学的品質を維持しながら樹脂の硬度による 1-2 μ m 厚の断面を得ることが容易です。埋め込み、パラフィンから 4-5 μ m 厚の切片ではなく、これらの薄いセクションを提供できない g 比などの軸索の髄鞘のより正確な定量化を可能にする、高解像度の末梢神経節厚いセクション16から得られます。極低温断面は 1-2 μ m のセクションを取得する使用できますが、多数の大規模な亀裂なしセクションを得ることは困難である私たちの経験をされています。このようなひびの入ったセクションは、髄鞘形成の側面と軸索の数の不正確なカウント可能性があります。
銀染色法18マッソンのヒアリン染色4は、トルイジン ブルー染色17、に加えて神経軸索を表示する使用できます。ただし、対し、トルイジン ブルー染色ミエリン鞘の明確なイメージを示し、簡単にすることができますヘマトキシリンとエオシンまたはマッソンのヒアリン示したかすかなミエリン鞘と認識できない構造ステンド グラス樹脂埋め込みラット正中神経断面を使用定量化された4になります。いくつかの制限にもかかわらずトルイジン ブルー染色樹脂の周辺神経、神経形態の高解像度の画像が必要な場合に使用できる貴重な手法です。
樹脂を埋め込むための主な欠点は、それは時間がかかり、パラフィンおよび凍結する埋め込まれたセクションの技術と比較されたときの抗原検索の難しさのため同じ組織の免疫染色を許可しません。したがって、トルイジン ブルー染色樹脂埋め込みを介して処理される免疫染色の同じ組織を活用することは一般的にはありません。免疫染色が必要な場合、ここで使用樹脂埋め込みのセクション、グリコール メタクリル酸樹脂を埋め込みの使用は、免疫染色組織切片上で実行するが、これは比較的高価な19。これは、固定後に直接別セグメント、樹脂を埋め込むためのいくつかおよび免疫染色の他に末梢神経を切断することによって多少軽減できます。
最も病理組織学的分析で、分けることができます 5 つの段階、固定、脱水を含む、埋め込み、断面、および20を染色、トルイジン ブルー染色樹脂のプロセスは末梢神経を埋め込まれています。トルイジン ブルーを取得する高品質の画像と埋め込みラット坐骨神経染色樹脂を使用してプロトコルおよび実用的な指針を提供するためにここを目指します。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffer Saline</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Tetraborate Decahydrate</td><td>Acros Organics</td><td>205950010</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Embedding Medium Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>To adjust Trump&#039;s fixative pH</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Chemical</td><td>170942</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Slides, Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545102</td><td></td></tr><tr><td>Pelco Embedding Cast</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9671811</td><td></td></tr><tr><td>Glass Knife Maker</td><td>RMC Products</td><td>GKM-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>RMC Products</td><td>MT-XL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Tube</td><td>Falcon</td><td>ISO 9001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>4 mL Glass Vial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>For trimming resin block</td></tr><tr><td>Perfect Loop</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70944</td><td>For picking up thin resin sections</td></tr><tr><td>Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>100 Watt Oven</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>6350115</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filter Paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr><tr><td>3 mL plastic pipette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z331740</td><td></td></tr><tr><td>Micro-surgical Kit</td><td>World precision instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus fluorescence microscope</td><td></td><td></td><td>Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80</td></tr></tbody></table>

toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology

全身の運動や知覚神経軸索と標的組織を支配する末梢神経を拡張します。広範な分布のため末梢神経は、頻繁に外傷や疾患のため破損しています。メソッドと戦略は、動物モデル、機能と再生、末梢神経損傷を評価するために開発されていると末梢神経の形態学的分析重要なターミナルの結果測定になりました。樹脂埋め込み神経セクションからトルイジン ブルー クロス神経の染色切片は末梢神経、神経軸索の形態数と性の可視化を有効にすることの定性的および定量的な評価のための再現可能な方法髄鞘形成。この手法は、他の多くの組織学的方法と同様できます学び、標準的な文書によるプロトコルの使い方をマスターすることは困難。この文書の目的は、トルイジン ブルー坐骨神経ラットから収穫を使用して、メソッドのビデオ撮影と末梢神経の染色の文書によるプロトコルを強調するためにためです。末梢神経生体内固定と組織と四酸化オスミウム 2%、後固定のコレクションを述べるこのプロトコルでは、エポキシ樹脂とウルトラミクロトーム区分 1-2 μ m の厚さに神経の神経の埋め込み。神経節は、スライド ガラスに転送し、トルイジン青、その後彼らは、量的そして質的評価で染色します。これらの問題を軽減するための手順だけでなく、最も一般的な問題の例を示します。

ガレージには、末梢神経とトルイジン ブルー染色のセクションでは、正確な組織学的データの数量が埋め込まれています。(図 2) には、プロシージャの概要を示します。坐骨神経セクションは、樹脂中に埋め込まれているし、最適解像度 (図 3) とトルイジン ブルー明瞭な画像で染色します。神経の損傷を引き起こす可能性が多くの変化神経の形態学的構造、たとえば、神経線維、軸索直径および髄鞘の太さの変化。このメソッドは、総繊維径 (g 比; 軸索直径の比率などいくつかのパラメーターの測定を容易に自然な形態で神経構造を維持することができます。図 4)。さまざまな要因は亀裂 (図 5 a) の存在をはじめ、神経の不適切な取り扱いのセクションよりも少ない最適な末梢神経節につながることができます。穴はまたセクション (図 5 b) が不足して脱水症が原因で発生します。手順で別の可能性のあるエラーは、スライド ガラス上にセクション トランスファーのため接種ループの使用によって改善することができます (図 5) のセクションの折り畳み式です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig1.jpg"> 図 1: 手術とセクショニングします。(A)ラット坐骨神経生体内で固定中。(B)ガラス ナイフ メーカー (C)ガラス ナイフ ボートで。(D)転送に使用される金属のループには、スライド ガラス上の脱イオン水のドロップにガラスのナイフから薄い部分が浮かんでいた。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58031/58031fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig2.jpg"> 図 2: このプロトコルで使用されるメソッドの概略図。(A)ラットを麻酔すると、大人のスプレイグ ドーリーに続いて生体内神経固定(B)と神経コレクション(C)。次の手順は、後固定 2% 四酸化オスミウム(D)と(E)を埋め込み樹脂です。セクションは、 (F)をトリミングし、切片(G) 、ウルトラミクロトームを使用して埋め込まれた神経を樹脂します。最後に、スライド ガラス上のセクションはトルイジンと汚れる神経青(H)であります。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58031/58031fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig3.jpg"> 図 3: ラット坐骨神経の横断とトルイジン ブルー染色します。クリア画像の最適な解像度の異なる倍率 (10 X、20 X、40 X、60 X) の下のセクションを示しています。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58031/58031fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig4.jpg"> 図 4: ラット坐骨神経の横断とトルイジン ブルー染色します。この高解像度画像 (100 X) は、総繊維径 (g 比) に軸索の直径の比を測定する使用できます。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58031/58031fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig5.jpg"> 図 5: ラット坐骨神経の横断面とトルイジン異なる倍率でブルー染色します。このプロトコルのパフォーマンス中に発生する可能性のある問題のいくつかを示します。(A)および(B)。亀裂や穴それぞれセクションの不適切な処理と、組織が不足して脱水によって引き起こされる神経セクション内の存在。(C)します。 スライドにガラスのナイフからセクションを転送中に起こる可能性がありますのセクションの折りたたみ。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58031/58031fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

ここで紹介を取得し、青いトルイジン 1-2 μ m のセクションを染色によって末梢神経の微細構造を可視化するためのプロトコル

トルイジン ブルー染色樹脂埋め込まれたセクションの末梢神経形態の評価

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

toluidine-blue-staining-resin-embedded-sections-for-evaluation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.8K ビュー.  University of Wyoming. ここで紹介を取得し、青いトルイジン 1-2 μ m のセクションを染色によって末梢神経の微細構造を可視化するためのプロトコル

ビデオ: Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

親油性色素を組み合わせることで、その場でハイブリダイゼーション、免疫組織化学、および組織学

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

神経科学

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

スキンと四肢骨の神経支配マウス感覚神経線維の組織の調製と免疫染色

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

ローカライズされた病理組織学的分析のための人工網膜を移植処理アイズのための技術

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

医学

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

末梢神経損傷後の機能回復を評価する嗅神経鞘細胞の移植

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

子宮内開発のマウスの脳および脊髄の伝達の後の微細構造神経可塑性パラメーターの評価

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

発生生物学

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

リゾレシチンの焦点注入による実験的脱髄およびマウス脊髄の再ミエリン化

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

の毛包披針形語尾に神経末端標識リビングの光監視<em&gt; ex vivoで</em&gt;マウスの耳皮膚

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to degeneration and injury of small-diameter sensory neurons, referred to as small fiber neuropathy. Present animal models of small fiber neuropathy affect both large- and small-diameter sensory fibers and thus create a neuropathology too complex to properly assess the effects of injured small-diameter sensory fibers. Therefore, it is necessary to develop an experimental model of pure small fiber neuropathy to adequately examine these issues. This protocol describes an experimental model of small fiber neuropathy specifically affecting small-diameter sensory nerves with resiniferatoxin (RTX), an ultrapotent agonist of transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1), through a single dose of intraperitoneal injection, referred to as RTX neuropathy. This RTX neuropathy showed pathological manifestations and behavioral abnormalities that mimic the clinical characteristics of patients with small fiber neuropathy, including intraepidermal nerve fiber (IENF) degeneration, specifically injury in small-diameter neurons, and induction of thermal hypoalgesia and mechanical allodynia. This protocol tested three doses of RTX (200, 50, and 10 &#181;g/kg, respectively) and concluded that a critical dose of RTX (50 &#181;g/kg) is required for the development of typical small fiber neuropathy manifestations, and prepared a modified immunostaining procedure to investigate IENF degeneration and neuronal soma injury. The modified procedure is fast, systematic, and economic. Behavioral evaluation of neuropathic pain is critical to reveal the function of small-diameter sensory nerves. The evaluation of mechanical thresholds in experimental rodents is particularly challenging and this protocol describes a customized metal mesh that is suitable for this type of assessment in rodents. In summary, RTX neuropathy is a new and easily established experimental model to evaluate the molecular significance and intervention underlying neuropathic pain for the development of therapeutic agents.

This study establishes an experimental model of pure small fiber neuropathy with resiniferatoxin (RTX). A unique dose of RTX (50 &#181;g/kg) is optimal for developing a small fiber neuropathy model that mimics patient characteristics and could help investigate the nociceptive molecular significance underlying neuropathic pain.

一過性受容体電位バニロイド型 1 Ultrapotent アゴニストと純粋な小さな繊維の神経疾患のマウスモデルを確立します。

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

トルイジンブルー染色樹脂埋め込まれたセクションの末梢神経形態の評価

要約

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親油性色素を組み合わせることで、その場でハイブリダイゼーション、免疫組織化学、および組織学

スキンと四肢骨の神経支配マウス感覚神経線維の組織の調製と免疫染色

ローカライズされた病理組織学的分析のための人工網膜を移植処理アイズのための技術

末梢神経損傷後の機能回復を評価する嗅神経鞘細胞の移植

子宮内開発のマウスの脳および脊髄の伝達の後の微細構造神経可塑性パラメーターの評価

皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で

リゾレシチンの焦点注入による実験的脱髄およびマウス脊髄の再ミエリン化

の毛包披針形語尾に神経末端標識リビングの光監視

一過性受容体電位バニロイド型 1 Ultrapotent アゴニストと純粋な小さな繊維の神経疾患のマウスモデルを確立します。

切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

トルイジン ブルー染色樹脂埋め込まれたセクションの末梢神経形態の評価

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親油性色素を組み合わせることで、その場でハイブリダイゼーション、免疫組織化学、および組織学

スキンと四肢骨の神経支配マウス感覚神経線維の組織の調製と免疫染色

ローカライズされた病理組織学的分析のための人工網膜を移植処理アイズのための技術

末梢神経損傷後の機能回復を評価する嗅神経鞘細胞の移植

子宮内開発のマウスの脳および脊髄の伝達の後の微細構造神経可塑性パラメーターの評価

皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で

リゾレシチンの焦点注入による実験的脱髄およびマウス脊髄の再ミエリン化

の毛包披針形語尾に神経末端標識リビングの光監視

一過性受容体電位バニロイド型 1 Ultrapotent アゴニストと純粋な小さな繊維の神経疾患のマウスモデルを確立します。

切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

トルイジンブルー染色樹脂埋め込まれたセクションの末梢神経形態の評価