本研究で用いた線虫株は健康の国民の協会 - 研究基盤プログラムのオフィス (P40 OD010440) によってサポートされている線虫の遺伝学センターから得られました。この作品は、NIH によって支えられた: 1R03AG048578-01 6 月亮、淳亮と PSC に CUNY CCRG 1501-CUNY 66184 00 44、6 月梁に 67248 00 45。キャシーの野蛮人-ダンにありがとう親切に彼女の研究室スペースを共有します。クイーンズ大学中核施設ですべての蛍光画像を集めました。ウィリアム ・ j ・ ライスに原稿の彼のコメントありがちましょう。

1. ソリューション
<ol><li>
NGM プレート
	<ol>
<li>2 L の三角フラスコで塩化ナトリウム 3 g、寒天の 17 g、2.5 g ペプトン、dH2O. カバー アルミ箔でフラスコの口の 975 mL を追加します。オートクレーブ 50 分のフラスコは、20-30 分間それを冷やします。</li>
		<li>滅菌ソリューションを追加: 1 M CaCl2の 1 mL、1 mL のエタノールで 5 mg/mL コレステロール、1 M MgSO4の 1 mL、25 mL の 1 M KPO4 (pH 6.0) バッファー。それらを混ぜるための解決策を旋回します。</li>
		<li>液体ディスペンサーを使用して、60 mm ペトリ プレートに NGM ソリューションを調剤します。寒天プレート 2/3 完全な塗りつぶし。将来の使用のための 4 ° C で気密容器に保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 M KPO4バッファー (pH 6.0)
	<ol>
<li>KH2PO4 10.83 g と dH2O、K2HPO4 3.56 g を溶解し、100 mL に容量を調整します。オートクレーブ 15 分のためのソリューション。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
M9
	<ol>
<li>KH2PO4、 6 g の Na2HPO の 3 g を溶解4、および dH2O、塩化ナトリウム 5 g 1 M MgSO4、1 mL を加えるし、1 l 容量を調整</li>
	</ol>
</li>
	<li>
10 μ G/ml DAPI
	<ol>
<li>DH2O. 999 μ L に DAPI を 10 mg/mL の 1 μ L を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
アルコール 95% (v/v)
	<ol>
<li>100% アルコールの 95 mL を測定し、蒸留水 100 mL にボリュームを調整するを追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
アセトン 30% (v/v)
	<ol>
<li>DH2O にアセトン 30 mL を追加し、100 mL に容量を調整します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 熱応力
<ol><li>ターゲット遺伝子9,10の並進コンストラクト染色体外配列ラインを生成します。また、線虫研究の公共のリソースは、線虫の遺伝学センター (CGC) からまたは以前に発行された研究室からこのような行を取得します。</li>
	<li>染色ラインを 3,800 γ 放射線9にワームを公開することによってゲノムに統合します。各動物は、GFP やローラーなどのマーカー蛋白質を表現できるように安定的表現の行を選択します。</li>
	<li>放射線中に生成された突然変異を削除するには、少なくとも 2 行 outcross x。トランスジェニック行を使用して、ストレスの下で蛋白質発現パターンの変化を検出します。</li>
	<li>手順 1.1 NGM ワーム プレートを準備します。OP50 クローンを連勝し、一晩流体培養基 LB 液体中の細菌を培養します。みみずのための食糧源として細菌の芝生の成長に一晩で種子液体 OP50 NGM 板文化し、37 ° C の定温器の版を孵化させなさい。使用する前に、少なくとも 30 分間室温でプレートを冷やします。</li>
	<li>熱応力測定の前に、少なくとも 2 世代のための飢えのない 20 の ° C で形質転換線を成長します。</li>
	<li>新しいワーム プレートし約 3-5 時間のため卵を産む彼ら let 8-10 の若い大人妊娠 (子宮の卵でいっぱい) を選択し、板からすべての大人を削除します。</li>
	<li>ワームを同期させると、卵が孵化して 4 令幼虫 (L4) に約 48 時間の幼虫を成長をさせます。その外陰部の構造 (半月形の構造) L4 段階 (図 1の矢印)11を識別するを調べます。</li>
	<li>熱ストレスを達成するために 2-5 h の 35 ° C の定温器で L4 幼虫ワーム プレートを配置します。温度を正確に測定するインキュベーターで温度計を配置します。</li>
</ol>3. DAPI 染色
<ol><li>
エタノールの固定
	<ol>
<li>スライド ガラスの中央に M9 バッファーの 10 μ L を追加します。</li>
		<li>ステップ 2.8 から熱ショックによるワームを選ぶし、スライド ガラスに M9 バッファーに入れます。<ol>
<li>また、M9 とプレートを洗浄、1,000 × g室温で 1 分間の遠心分離機、上澄みを廃棄します。ワームをガラス スライドに追加します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>軟部組織を使用して、余分な液体を排出します。足元に解剖顕微鏡の下で。</li>
		<li>ワームに 95% アルコールの 10 μ L を追加し、乾燥する空気。解剖顕微鏡の下でプロセスを見るし、あまりにもドライを得る動物を聞かせていません。動物からエタノールが蒸発した直後には、次の手順に進みます。 注: エタノールは非常に迅速に蒸発します。</li>
		<li>手順 3.1.4 二度、そのワームを修正します。 メモ: それは暗くなり、歪んで見える動物の正常です。</li>
		<li>DAPI の 10 μ L を追加 (10 μ G/ml) ワーム。すぐに、coverslip でそれらをカバーし、透明なマニキュアのゲルを使用してスライドをシールします。</li>
		<li>蛍光顕微鏡で約 10 分後に、動物を表示します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
アセトン固定 (別の方法)
	<ol>
<li>M9 とステップ 2.8 から熱ショックによるプレートを洗浄、1,000 × g室温で 1 分間の遠心分離機、上澄みを廃棄します。DH2O の ml の 1 ペレット、ペレットを収集し、上澄みを廃棄します。</li>
		<li>部屋の温度で 1 分間 1,000 x gで 15 分遠心分離機の 30% アセトンの 400 μ L を追加し、上澄みを廃棄します。2 動物を洗う 500 μ L の dH2O を使用して x。上清を捨てます。</li>
		<li>DAPI を 200 μ l 添加 (10 μ G/ml) または 4 x 15 分間管内全体ヴォルムスのボリュームの量。</li>
		<li>1 分の 1,000 × gで遠心分離し、上澄みを廃棄します。ペレット 2 dH2O を 500 μ L の x スライド ガラスにワームを配置、coverslips とそれらをカバー、透明なマニキュアのゲルを使用してスライドをシール、蛍光顕微鏡下で動物を観察します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 顕微鏡イメージング
<ol><li>UV 光源と蛍光顕微鏡を入れます。顕微鏡に接続するコンピューターをオンに。</li>
	<li>蛍光顕微鏡のスライドをロードします。低消費電力対物レンズ (10 X) を使用してワームを見つけ、400 X、倍率を増やす、供試体に焦点を当てます。</li>
	<li>顕微鏡に付属するソフトウェアを開きます。メニューの「取得」をクリック「カメラ」をクリックし、顕微鏡に接続されているカメラを選択これにより、ソフトウェアと通信する選択したカメラです。 注: 別の顕微鏡の操作で異なる場合があります。</li>
	<li>同じ「取得」の下で「多次元取得」をクリックしてします。新しい「多次元買収」ナビゲーション ウィンドウをが開きます。「マルチ チャンネル」ボタンをクリックして、すべての使用可能なチャンネルが表示されます。</li>
	<li>青、緑、および試料を観察する DIC (微分干渉コントラスト) を選択します。「多次元獲得」ナビゲーション ウィンドウ"青 DAPI"、「グリーン GFP」、と「グレー DIC」、;「ノマルスキー」チャンネルに残しておく「赤ローダミン"や"白い明るいフィールド"、などの他のチャネルを右クリックして終了います。</li>
	<li>
まず、各チャンネル用の露光時間を測定します。
	<ol>
<li>それを選択し、「測定」の自動露光時間と DAPI チャネルの下でライブ画像を撮影するためにクリックする"青 DAPI"チャネルを左クリックします。ライブ イメージで新しいウィンドウが表示されます。</li>
		<li>ライブ イメージ ウィンドウの左側にある、必要に応じてイメージを作るために必要な場合手動で露光時間を調整します。</li>
		<li>最後に、 "[ok] をクリックして"ライブ画像ウィンドウで。これは DAPI チャネルの下で露出時間を設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>他のチャンネル、「緑色 GFP」、「グレー-DIC」、「ノマルスキー"、これらのチャネルのための露光時間を設定するのステップ 4.6 を繰り返します。</li>
	<li>「多次元取得」のナビゲーション ウィンドウで自動的セットとして特定の露光時間の順序 (上記参照) で 3 つの異なるチャネルの下で 3 つ画像を収集する「スタート」をクリックします。</li>
	<li>ファイルを保存すると、メイン メニューに移動、「として保存」し、「ファイル」をクリックします。ファイル名とフォルダー名を入力します。今後の参考のため詳細な画像情報を保存する既定のファイル形式としてファイルを保存します。</li>
	<li>
他の形式でファイルをエクスポート: する
	<ol>
<li>「ファイル」に移動し、「エクスポート」をクリックします。これは、エクスポートの設定ウィンドウを開くでしょう。</li>
		<li>ファイル名とフォルダーを設定します。データを整理するより「プロジェクト フォルダーを作成する」をチェックします。ソフトウェアはまた 4 の他のオプションを指定できます:「マージの生成画像」、「チャンネルの画像に色を使用」「使用チャネル名」と「結合イメージのみ」.</li>
		<li>"TIF"、"BMP"、「PSD」、または「JPG」、他の種類など、ドロップ ダウン メニューから、目的のファイルの種類を選択します。エクスポートする「スタート」をクリックします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO+transcription+factor+activation+by+oxidative+stress+mediated+by+the+small+GTPase+Ral+and+JNK.">FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK.</a> The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).</li><li>Oh, S. 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著者申告するものがあります。

この記事は核に細胞質からタンパク質細胞内の変更を検証する高速かつ効率的な方法を提示しました。蛋白質の表現は、(図 3) を汚す DAPI によって核構造を検証した中、GFP 融合によって示されました。ほとんど線虫タンパク質細胞内局在化は GFP、ラズ、mCherry などのマーカー蛋白質とそれらをタグ付けによって特徴付けられる染色線虫蛋白質は挑戦的な18,19,20,21. この記事でgfpタグのターゲット遺伝子exl 1にタンパク質局在を示すために使用されました。核局在化を確認するために使用された DAPI 染色します。2 つの代替方法が提示された DAPI 染色。両方は効率的にまともな作業時間枠内 (1 h 未満) でワームの強い核を示した。エタノールの固定は、小さなサンプル コレクション (収集未満 50 ワーム) 品質観測などに適しています。ワームが完全に乾燥するを防ぐの重要です。ワームから 95% のアルコールが蒸発する、すぐに次のステップに進みます。アセトンの固定は、大規模サンプル コレクション (50 以上の動物を収集) 定量分析などに適しています。ただし、サンプルを洗濯の複数のステップのため、いくつかの標本は失われます。したがって、慎重に上澄みを除去し、可能な限りとして多くのワームを保持することを強くお勧めします。4 ° C で 1 週間のアセトンの固定から生じるスライドを保存ことができます密封されて、一度
このプロトコルは細胞内局在の変化を追跡する興味の他の蛋白質を調整できます。ここで提示する熱ストレス、に加えて他のストレスの試金評価できる、酸化ストレス、重金属ストレス、食事制限など。タンパク質細胞内局在変化は興味の蛋白質の遺伝の背景の変更によっても検査できます。例えば、新規遺伝的相互作用を識別することができるように形質転換線を異なる突然変異体の背景に交差することができます。RNA 干渉 (RNAi) は、特定の遺伝子をノックダウンし、結果のタンパク質細胞内局在変化の調査にも適用でした。これらのアプリケーションは、小説規制コンポーネントを識別するために高金利です。未知の蛋白質の様々 な実験条件を試される、試験試薬濃度などのストレス時間とワームの特定の発達段階。本研究では、5 h と異なる熱応力の温度に 30 分間から、期間が異なるを試みた。3 h 35 ° C で熱ショックは明らかにタンパク質核移行を示します。
DAPI 染色の追加アプリケーションは、減数分裂と有糸分裂のプロセスの検討みみずの生殖細胞22,23,24,25では、特に、核の数、遺伝的変異の背景20,26,27。

蛋白質の細胞レベル下のローカリゼーションの変更は、熱ストレス、飢餓、酸化ストレス、アポトーシス、タンパク質リン酸化、その他などの内部または外部のシグナルに応答の一般的なメカニズムです。たとえば、熱応力は、FOXO メンバー DAF 16 核移行1,2, と入札が3,4の信号受信の死亡時にミトコンドリアに移行 pro アポトーシス bcl-2 蛋白を誘導します。これらの変更を検出する様々 なテクニックがあります。西部にしみが付くことおよび生化学的細胞レベル下の構造 (例えばミトコンドリアや核) を分離することの組み合わせは、目標3を達成できるも。ただし、興味の蛋白質に対して抗体が必要です。したがって、確立された抗体の成功の鍵となります。代替的アプローチは、緑色蛍光タンパク質 (GFP)、赤の蛍光タンパク質 (RFP)、黄色い蛍光蛋白質 (YFP) を mCherry など様々 なマーカーとさまざまな細胞内構造や細胞内小器官をラベルし、一方のタンパク質をラベル他のマーカーに興味。その後、ターゲット5,6をローカライズする共焦点顕微鏡で観察します。放射性同位元素は、標的タンパク質をラベル付けおよび、その内局7を検出するための代替選択肢です。ただし、このメソッドには、適切な訓練と放射性廃棄物の処理が必要です。特定の抗体の欠如は、適切なマーカーの不在や共焦点顕微鏡などの機器の scarceness などの状況下で代替的アプローチを考慮する必要があります。タンパク質の核移行を識別するためにだけマーカーを持つ標的タンパク質をラベルし、化学試薬 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) のみ通常蛍光顕微鏡が必要ですので核を染色する魅力的です。
反応線虫抗体とは卵の殻や動物を取り巻く膠原線維のキューティクルの低透磁率のために挑戦。一方、線虫のタンパク質は、脊椎動物の嗅覚から著しく発散なので、いくつかの民間企業は特定の製品で線虫を提供します。自分自身の線虫抗体を生成する小さな研究室は困難です。コミュニティの研究者は、頻繁ローカリゼーションまたは遺伝子発現を示すマーカーとして付けられた蛋白質を使用します。この資料では、例として EXL 1::GFP を使用して熱応力8の下で蛋白質の核移行を追跡します。動物のゲノムに統合された並進exl 1::gfp安定、 gfp融合遺伝子を表現する使用されます。研究を示したexl 1腸、体壁筋および他の細胞内構造8で表されます。このプロトコルは、(L4) 4 幼虫にワームを同期すると、熱応力実験、および行為 DAPI 染色、エタノール固定、アセトンの固定、および通常蛍光顕微鏡イメージングを実行する方法を示します。

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td>both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well</td></tr><tr><td>OP50</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Kim Wipe</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td>soft tissue</td></tr><tr><td>Zeiss&amp;nbsp; AX10</td><td>Zeiss</td><td></td><td>fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Axiovision Rel 4.8</td><td>Zeiss</td><td></td><td>microscope software</td></tr><tr><td>AxioCam MR Rev3</td><td>Zeiss</td><td></td><td>digital camera</td></tr><tr><td>Incubator&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transparent nail polish gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm petri dishes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-20 &amp;micro;L pipettor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20-200 &amp;micro;L pipettor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200-1000 &amp;micro;L pipettor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-200 &amp;micro;L pipet tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200-1000 &amp;micro;L pipet tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platinum wire worm pick</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detecting protein subcellular localization by green fluorescence protein tagging and 4',6-diamidino-2-phenylindole staining in caenorhabditis elegans

このプロトコル、緑色蛍光タンパク質 (GFP) 融合タンパク質と 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) タンパク質細胞内局在変化の追跡に使用される汚損特に、熱下核転座応力状態です。タンパク質には、それに対応する外部および内部信号が反応します。共通のメカニズムは、その内局を変更することです。この記事では、抗体や放射化ラベリング、共焦点顕微鏡を必要としない蛋白質のローカリゼーションを追跡するプロトコルについて説明します。この記事で、GFP タグの哺乳類の CLIC4 を含む塩化物の細胞内チャネル蛋白質 (クリックス) 家族の線虫メンバーのターゲット蛋白質 EXL 1 されます。(プロモーターによる遺伝子の塩基配列と) 統合された並進exl 1::gfpトランスジェニック ラインによって作成された変換と γ 放射線と遺伝子とgfpを安定して表現。最近の研究では、熱応力、ない酸化ストレス、EXL 1::GFP が核で蓄積を示した。核構造と、DAPI GFP 信号を重複信号は、ストレスの下で EXL 1 細胞内局在変化を確認します。このプロトコルは、DAPI 染色 2 つの異なる固定方法を提示: エタノールの固定とアセトンの固定。この記事で紹介した DAPI 染色プロトコル、高速かつ効率的であり、GFP シグナルと蛋白質の細胞内局在変化の両方を保持します。このメソッドはのみ、ノマルスキー、FITC フィルター DAPI フィルターと蛍光顕微鏡を必要があります。小さな実験室設定、学部学生の研究、高校生研究およびバイオ テクノロジー教室に適しています。

塩化物チャネルの細胞内蛋白質 (CLIC) は、種12間で高度に保存されている多機能タンパク質です。多くの研究は示します、クリックス細胞ストレス、オートファジー、アポトーシス、発癌、血管新生、および哺乳類系13,14,15,16 マクロファージ生得の免疫反応を調節します。 ,17。線虫の 2 つの CLIC の同族体がある: exl 1とexc-4。私たちの最近の研究は示したexl 1動物のストレス管理8を調節します。動物のゲノムに並進exl 1::gfp構築を統合し、(図 2 aおよび2 b) マーカーとしてに、GFP 遺伝子exl 1を安定して表現形質転換線を作成します。熱ストレス下で強力な GFP 信号 (図 2 C ・E) 核構造と重なるので、腸地域の核に EXL 1::GFP が蓄積されます。細胞内の局在を確認するには、DAPI 染色を用いてアプローチとして核を染色します。DAPI 染色ショー明確な核 (図 3 b) の動物の体内でのエタノールの固定を使用してください。アセトンの固定も同様の結果 (図 3E) を実現します。GFP および DAPI シグナルと重なった EXL 1::GFP は確かに腸地域 (図 3, F) の核蓄積を確認します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57914/57914fig1.jpg"> 図 1: 第 4 幼虫 (L4) の画像倍率の異なる力の下でc. の elegansをステージします。(A) 63 (C) 、 (B) 115 X、X 400 X 倍率。矢印をポイント L4 ワーム; の外陰部半月形の構造に注意してください。スケール バーすべての画像で 100 μ m を =。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57914/57914fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57914/57914fig2.jpg"> 図 2: 熱応力、EXL 1::GFP 腸の核蓄積されます。(A)熱ショック前に腸地域の Normaski 画像。(B)強い GFP シグナルは、ヒート ショックの前に、の instestinal 地域で観察されました。(C)熱衝撃 (腸地域の核にポイント矢印) 後腸地域の Normaski 画像。(D)熱ショック後に強力な GFP 信号が蓄積されます。(E)には、GFP と Normaski のイメージが重なっています。すべての写真は、400 倍の倍率で撮影されます。スケール バーすべてのイメージの 50 μ m を =。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57914/57914fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57914/57914fig3.jpg"> 図 3: EXL 1::GFP 核移行を確認した DAPI 染色。(A ~ C)DAPI 染色のためのエタノールの固定を使用してください。(D-F)DAPI 染色のアセトン固定を使用します。AとDは、緑の色は腸地域の GFP 信号を示しています。BとEは、青の色は DAPI 染色で核を示しています。CとFは、Normaski、DAPI、GFP の重複する画像を表示します。スケール バーすべてのイメージの 50 μ m を =。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57914/57914fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補足図:アセトン固定試料を保持し、アセトン固定後 60 日 GFP および DAPI の信号は、まだ観測可能なオブジェクト。(A)グリーンは、GFP。(B)青は、DAPI 信号です。(C)には、GFP、DAPI、DIC のイメージが重なっています。すべての画像は、下 400 X 倍率が取得されます。スケールバー = 50 μ m。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57914/supplemental_figure.pdf">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

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Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質 (GFP) の融合タンパク質マーカーとして、4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) による熱ストレス蛋白質の核移行を追跡する方法を示しますを汚します。プロトコルを汚す DAPI は速く、GFP とタンパク質の細胞内局在化信号を保持されます。

緑色蛍光タンパク質タグと 4', 6-Diamidino-2-phenylindole線虫の染色によるタンパク質細胞内局在を検出

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

detecting-protein-subcellular-localization-green-fluorescence-protein

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

9.5K ビュー.  Borough of Manhattan Community College/CUNY. このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質 (GFP) の融合タンパク質マーカーとして、4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) による熱ストレス蛋白質の核移行を追跡する方法を示しますを汚します。プロトコルを汚す DAPI は速く、GFP とタンパク質の細胞内局在化信号を保持されます。

ビデオ: Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended intracellular endotubes that build and stabilize the lumen with a membrane and submembraneous cytoskeleton of apical character. The excretory cell expands its length approximately 2,000 times to generate these canals, making this model unique for the in vivo assessment of de novo polarized membrane biogenesis, intracellular lumen morphogenesis and unicellular tubulogenesis. The protocol presented here shows how to combine standard labeling, gain- and loss-of-function genetic or RNA interference (RNAi)-, and microscopic approaches to use this model to visually dissect and functionally analyze these processes on a molecular level. As an example of a labeling approach, the protocol outlines the generation of transgenic animals with fluorescent fusion proteins for live analysis of tubulogenesis. As an example of a genetic approach, it highlights key points of a visual RNAi-based interaction screen designed to modify a gain-of-function cystic canal phenotype. The specific methods described are how to: label and visualize the canals by expressing fluorescent proteins; construct a targeted RNAi library and strategize RNAi screening for the molecular analysis of canal morphogenesis; visually assess modifications of canal phenotypes; score them by dissecting fluorescence microscopy; characterize subcellular canal components at higher resolution by confocal microscopy; and quantify visual parameters. The approach is useful for the investigator who is interested in taking advantage of the C. elegans excretory canal for identifying and characterizing genes involved in the phylogenetically conserved processes of intracellular lumen and unicellular tube morphogenesis.

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans excretory canal is a unique single-cell model for the visual in vivo analysis of de novo polarized membrane biogenesis. This protocol describes a combination of standard genetic/RNAi and imaging approaches, adaptable for the identification and characterization of molecules directing unicellular tubulogenesis, and apical membrane and lumen biogenesis.

細胞内の内腔の形態形成と単一細胞におけるIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫排泄管: GFP 融合、RNAi 操作画面やイメージングによるラベリング

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

発生生物学

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

線虫ニューロンの細胞内輸送を分析するための固定化

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. Whole mount preparations preserve the structure of meiotic nuclei, and importantly, each gonad arm contains all stages of meiosis, organized in a temporal-spatial progression that makes it easy to identify nuclei at different stages. Adult hermaphrodites have two gonad arms, each organized as a closed tube with proliferating germline stem cells at the distal closed end and cellularized oocytes at the proximal open end, which join in the center at the uterus. Dissection releases one or both gonad arms from the body cavity, allowing the entirety of meiosis to be visualized. Here, a common protocol for immunofluorescence against a protein of interest is presented, followed by DAPI staining to mark all chromosomes. Young adults are immobilized in levamisole and quickly dissected using two syringe needles. After germline extrusion, the sample is fixed before undergoing a freeze crack in liquid nitrogen, which helps permeabilize the cuticle and other tissues. The sample can then be dehydrated in ethanol, rehydrated, and incubated with primary and secondary antibodies. DAPI is added to the sample in the mounting medium, which allows reliable visualization of DNA and makes it easy to find animals to image under a fluorescent microscope. This technique is readily adopted by those familiar with handling C. elegans after a few hours spent practicing the dissection method itself. This protocol has been taught to high-schoolers and undergraduates working in a research lab and incorporated into a course-based undergraduate research experience at a liberal arts college.

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

This is a commonly used method for C. elegans gonad dissection followed by freeze crack, which produces germline samples for immunofluorescence via antibody staining, or for simple DAPI staining to visualize DNA. This protocol has been successful for undergraduates in a research lab and in a course-based undergraduate research experience.

C.エレガンス 免疫蛍光およびDAPI染色のための生殖腺解離および凍結亀裂

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. ...

遺伝学

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

神経科学

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

回虫カエモルハブ炎エレガンスからの特定ニューロン集団の分離

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

生物学

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)による カエノラブディティスエレガンス 腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

免疫・感染学

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

筋肉の細胞内コンパートメントを評価するための方法<em&gt; C。エレガンス</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

カエモルハブ炎エレガンスにおける細胞構造と器官形態学の研究に関する定量的アプローチ

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

緑色蛍光タンパク質タグと 4', 6-Diamidino-2-phenylindole線虫の染色によるタンパク質細胞内局在を検出

要約

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細胞内の内腔の形態形成と単一細胞におけるIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫排泄管: GFP 融合、RNAi 操作画面やイメージングによるラベリング

線虫ニューロンの細胞内輸送を分析するための固定化

C.エレガンス免疫蛍光およびDAPI染色のための生殖腺解離および凍結亀裂

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

回虫カエモルハブ炎エレガンスからの特定ニューロン集団の分離

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)によるカエノラブディティスエレガンス腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化

筋肉の細胞内コンパートメントを評価するための方法

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

カエモルハブ炎エレガンスにおける細胞構造と器官形態学の研究に関する定量的アプローチ

緑色蛍光タンパク質タグと 4', 6-Diamidino-2-phenylindole線虫の染色によるタンパク質細胞内局在を検出

要約

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細胞内の内腔の形態形成と単一細胞におけるIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫排泄管: GFP 融合、RNAi 操作画面やイメージングによるラベリング

線虫ニューロンの細胞内輸送を分析するための固定化

C.エレガンス 免疫蛍光およびDAPI染色のための生殖腺解離および凍結亀裂

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

回虫カエモルハブ炎エレガンスからの特定ニューロン集団の分離

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)による カエノラブディティスエレガンス 腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化

筋肉の細胞内コンパートメントを評価するための方法

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

カエモルハブ炎エレガンスにおける細胞構造と器官形態学の研究に関する定量的アプローチ

C.エレガンス免疫蛍光およびDAPI染色のための生殖腺解離および凍結亀裂

RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)によるカエノラブディティスエレガンス腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化