Name: mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue
Uploaded: 2018-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
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HAC リタ アレン財団 (http://www.ritaallenfoundation.org) のミルトン E. カッセル学者でもあった。この作業によって賄われていた補助金拍する国立研究所の一般的な医療科学 R01 GM081686、R01 AR070245、国立の研究所一般医療科学 R01 GM0866465、イーライ ・ エディス広い再生医療センター ・幹細胞研究 (からローズの丘と Hal Gaba 賞)、WEL および HAC にジョンソン総合がんセンターからアイリス カントール女性の健康センター/カリフォルニア大学ロサンゼルス校 CTSI NIH グラント UL1TR000124、白血病リンパ腫協会の影響賞を受賞します。この出版物で報告された研究は、賞を受賞番号 P50CA092131 の下で健康の国民の協会の国立癌研究所によって支えられました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。HAC は、Eli およびエディス広い再生医療センター ・幹細胞研究、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の分子生物学研究所と UCLA バイオインフォマティクス部門間プログラムのメンバーです。

記載されているすべての実験は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校で動物ケア委員会によって承認されました。
1. 冷凍マウス皮膚のスライドを生成します。
<ol><li>機関のポリシーに従ってマウスを安楽死させます。 注: 防護服の制度のポリシーに従ってください。動物を含むすべてのプロトコルは、機関動物ケア委員会によって承認される必要があります。</li>
	<li>動物の毛トリマーとマウスの髪を削除します。</li>
	<li>はさみを使用して皮膚の切開を行います。鉗子を使用すると、マウスから皮膚を持ち上げます。皮膚セクションを切り取るはさみを使用しています。</li>
	<li>凍結試薬をコンパウンドで、cryomold を埋める (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>皮膚針鼻セクションを使用して塗りつぶされた cryomolds に鉗子を配置します。組織スライスは真皮、皮下・筋 (図 2) に表皮から皮膚の断面図を生成することは、肌を合わせます。 注意: 可能であれば、マウント実験と同じスライド上に切断し、一緒に処理できるので、同じ cryomold で一緒にマウスを制御します。泡を作成しないように注意してください。</li>
	<li>氷バケットにドライアイスのブロックの平らな面に cryomold を配置し、凍結させます。スキンの向きを観察し続けます。必要に応じて調整します。 注: は、ドライアイスを取り扱う際に低温手袋を着用します。</li>
	<li>ストレージの-80 ° C のフリーザーに cryomolds を転送します。サンプルは、冷凍庫で約 3ヶ月酵素活性の重要な損失なしで維持できます。凍結切片の乾燥をさせてください。</li>
	<li>-20 ° c、7-10 μ m の最高の皮膚形態21の厚いセクションを作成するスライス組織クライオスタットを用いた。</li>
</ol>2. 染色スライドの準備
<ol><li>テストするスライドのセットを確立します。NAD は源泉徴収されるコントロール スライドを含めるし、別のコントロールをスライド基板、乳酸、源泉徴収されます。以前調査した凍結するティッシュのブロックからの肯定的な制御スライドが含まれます。</li>
	<li>簡単にスライドを固定 5 分 4% ホルマリンで皮膚セクションを含む 4% ホルマリンをスライド、またはピペット 1 mL、4% ホルマリン入り容器にスライドを浸すことによって複数のスライドを処理するとき。 注: 固定、皮膚がスライドから次の手順と保存皮膚の形態の中にむいていないを確認します。 注意: ホルマリンは発がん性物質と危険だもの手袋を着用する、それはあなたの肌に触れるし、化学の発煙のフードでこの手順を実行させてはいけない。</li>
	<li>少なくとも 1 mL リン酸洗浄スライドによって緩衝される塩、pH 7.4、スライドごとピペッティングまたは浸漬で。</li>
</ol>3. 染色液の準備
<ol><li>乳酸脱水素酵素活性染色用渦一緒に試薬 (50 mM Tris pH 7.4 では、750 μ M NADP、80 μ M フェナジン methosulfate (PMS)、600 μ M nitrotetrazolium ブルーの塩化物および 30 mM 乳酸) 染色の量に応じて適切なサイズのチューブで必要なソリューションです。 注: 1 mL は完全に 1 つのスライドをカバーするのに十分です。</li>
	<li>NAD を除くすべての試薬がある、2 番目のソリューションを準備します。すべての試薬は乳酸以外存在第 3 ソリューションを準備します。</li>
</ol>4. 染色液でスライドを孵化させなさい。
<ol><li>優しくピペット染色液またはその全体のセクションをカバー スライド上に制御ソリューション (1 mL は、1 つのスライド十分です)。複数のスライドを一緒に処理されている場合は、同時に染色液にすべてのスライドをディップ (コンテナーが完全にティッシュ セクションをカバーする十分なソリューションを確認してください)。</li>
	<li>暗闇の中で 37 ° C で加湿環境でスライドを孵化させなさい。染色液は、スライド上にある場合、は、蒸発を防ぐために加湿環境にスライドを配置します。</li>
</ol>5. モニター スライド
<ol><li>目視による青クリアから染色液の変換を監視します。サンプルが青の所望のレベルに達したら、染色液を除去することによって反作用を停止します。 注: 皮膚、10 分は十分です。時にオルガンと酵素の活性が異なります。</li>
	<li>ピペッティングでリン酸緩衝生理食塩水でスライドをリンス (1 mL はスライドごとに十分な) または浸漬します。 注: 互いに比較されるサンプルは、時間の同じ量の染色液で維持する必要があります。</li>
</ol>6. 対比染色とマウント
<ol><li>スライド、スライドが青の適切なレベルに達したときに対比染色をピペットで移しなさい。 注: 赤または緑の核を有効に Counterstains は沈殿ホルマザン結晶によって作成された青と良好なコントラストを提供します。</li>
	<li>水または水溶液中22をマウントをマウントします。メディアをマウントのひとつ 〜 3 滴 (40-50 μ L) でカバー スリップのサイズによっては十分です。</li>
</ol>7. スライドの画像し、定量化
<ol><li>画像は、光学顕微鏡下でスライドします。10 X、20 X、40 倍の倍率でのすべての否定的なコントロールとコントロールのサンプル実験の写真を取る。</li>
	<li>画像解析ソフトウェアでさまざまな地域の青い汚れの強度を決定します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells,+with+special+reference+to+proteolysis.">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li><li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tetrazolium-formazan+system:+Design+and+histochemistry.">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+total+lactate+dehydrogenase+activity.">Measurement of total lactate dehydrogenase activity.</a> Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).</li><li>Nelson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+imaging+of+patients+with+prostate+cancer+using+hyperpolarized+[1-(1)(3)C]pyruvate.">Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate.</a> Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).</li><li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+dehydrogenase+activity+drives+hair+follicle+stem+cell+activation.">Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation.</a> Nat Cell Biol. , (2017).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+tissues.">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Espada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+permanent+mounting+for+immunofluorescence+microscopy.">Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy.</a> Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+A+photochemically+stable+electron+mediator+between+NADH+and+various+electron+acceptors.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li></ol>

著者は開示する競合する興味を持ってないです。

ここで説明する方法は、乳酸脱水素酵素や他の代謝酵素生成 NADH または NADPH 依存性の異なる種類の細胞、組織内または時間の経過とともに組織のさまざまな部分の活動を監視する使用できます。乳酸脱水素酵素は幹細胞と腫瘍の生物学を理解するための重要な酵素を個々 の細胞における乳酸脱水素酵素の活動を監視する機能はこの酵素の機能に重要な洞察を提供する可能性が高い。
<p cla...

酵素が高または低活性を持つ、組織内の場所を理解する理解の開発および生理学のため不可欠です。謄本又はタンパク質レベルは、酵素活性の代理として使われます。このような研究は有益であることができます中、に、酵素の活動、翻訳後修飾、タンパク質複合体や酵素の細胞内局在性の存在などを決定するための重要なことができる情報は提供しません。酵素活性は直接計測するときにしばしばもはや組織内の高または低の活動と混合物または細胞の空間的分布内で個々 のセルについての情報が含まれて均質化タンパク質溶解液で監視されます。
ここで組織サンプル中の酵素活性の分布をマッピングするための詳しいプロトコルいたします。方法論は、テトラゾリウム塩を凍結するティッシュ1酸化酵素、還元酵素、脱水素酵素の活性のローカライズに使用できることを示す以前の研究に基づいています。これらのメソッドは、テトラゾリウム塩2,3に陽子が転送されるときに水不溶性ホルマザンが形成されます。グルコース-6-リン酸脱水素酵素は、NADPH と、陽子を生成し、テトラゾリウム アクティビティが検出されました。グルコース-6-リン酸脱水素酵素は、欧州ヒラメ肝4肺5の 2 型肺胞細胞と5腎臓のネフロンに監視されています。テトラゾリウム塩は、凍結するティッシュ6の細胞の活動を監視する使用されています。同様のアプローチは、隣接するスライド7で同じ組織の複数の脱水素酵素の活動を監視する最近使用されました。
乳酸脱水素酵素活性 (図 1) の空間分布を監視するテトラゾリウム塩を利用する方法をご紹介します。乳酸脱水素酵素、乳酸を解糖系と逆の反応で生成されたピルビン酸に変換できます。乳酸脱水素酵素活性はその結果ピルビン酸の乳酸とその分泌対トリカルボン酸入学の決定が重要であります。血液中の乳酸濃度は、それことを知らせた病気やけがが損傷した細胞、酵素がリリースされているので癌8,9,10, を含む病気の範囲の診断に使われます。
4 つの乳酸脱水素酵素の遺伝子がある: 発現、LDHB、LDHC、LDHD11。発現と LDHB は、早期発現遺伝子12の重複から生じていると考えられています。LDH は 4 量体として活躍、発現と LDHB は、homotetramers と heterotetramers の相互を形成できます。発現は、乳酸、高い親和性を持っていると優先的に乳酸をピルビン酸13に変換する LDHB が報告される間、ピルビン酸、高い親和性を有するとされています。発現プロモーターには、HIF1α、cMYC FOXM1 のトランスクリプション要因11結合部位が含まれています。さらに、ように多く他解糖系酵素14,15LDH が翻訳後修飾によって変更できます。線維芽細胞増殖因子受容体 1 は Y10、4 量体形成を促進する、または NADH 基板結合16を促進する Y83 発現に対することができます。発現にアセチル化17することができます。これらの理由から LDH タンパク質レベルだけでなく、同様の酵素の活性を監視する必要の LDH 活性を完全に理解します。
ここでは提示方式に加え乳酸脱水素酵素の活動を監視する他のアプローチは使用されました。乳酸脱水素酵素活性は、均質化蛋白ライセートの吸収スペクトルの測定監視できます。NADH の生成、乳酸、ピルビン酸に変換されます測定可能 340 吸光度に基づいて nm, ピルビン酸は乳酸18に変換されます NADH の消失を監視できます。乳酸脱水素酵素活性は、磁気共鳴画像 (MRI) に監視されています。13C ピルビン酸を投与することができの比としてピルビン酸から乳酸の変換を監視できる [1-13] 乳酸/[1-13C] ピルビン酸。比率を上昇 [1-13C] 乳酸/[1-13] ピルビン酸は、癌組織19で観察されています。MRI ベースのアプローチは、通常の乳酸脱水素酵素活性と疾患組織に関する情報を提供できますが、方法論は特定の細胞の活動レベルを決定するために必要な解像度を持っていません。ここで提供されている方法論は、組織の地域とも単一細胞における乳酸脱水素酵素活動の情報を提供できます。
その場で活性測定法を使用して、乳酸脱水素酵素の活性が高い20マウス皮膚の毛包幹細胞のことがわかった。また培養胚性幹細胞の乳酸脱水素酵素の活動を監視し、活動は幹細胞に送り装置の層よりも高いメソッドを使いました。最後に、新鮮なマウス大動脈における乳酸脱水素酵素の活動を監視し、平滑筋細胞内染色を観察しました。我々 はここで冷凍マウス皮膚における乳酸脱水素酵素の活動を監視するための詳しいプロトコルについて説明します。

<table><tbody><tr><td>Surgical instruments</td><td></td><td></td><td>For collecting skin from euthanized mice</td></tr><tr><td>Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9511236</td><td>For freezing mouse skin</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9638938</td><td>For mounting cryomolds</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-106</td><td></td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polysine Adhesion Slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-78</td><td></td></tr><tr><td>4% formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-684</td><td>Dilluted in water</td></tr><tr><td>phosphate buffered saline, pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-684</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>Phenazine methosulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Nitrotetrazolium blue chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Lithium L-lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2250</td><td>Substrate</td></tr><tr><td>37&amp;deg;C incubator (or tissue culture incubator)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Braziliant! Counter stain</td><td>Anatech</td><td>861</td><td>Counter stain</td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-5000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips for slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue

空間と時間における酵素活性のマッピングは、正常組織と病気での細胞行動の分子基盤を理解することにとって重要です。その場で代謝活性アッセイは、組織内の代謝活動の空間分布に関する情報を提供できます。ここで組織サンプルに直接酵素乳酸脱水素酵素の活動を監視するための詳しいプロトコルいたします。乳酸脱水素酵素は消費グルコースが好気性または嫌気性解糖系によるエネルギーに変換するかどうかの決定が重要です。液乳酸および NAD は、凍結するティッシュ セクションを提供しています。高乳酸脱水素酵素活性と細胞はニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NAD) NADH と検出することができるプロトンの減少に基づいて提供される同時変換中、提供乳酸をピルビン酸に変換されます。nitrotetrazolium 青青い沈殿物として可視化した塩。マウス皮膚における乳酸脱水素酵素の活動を監視するための詳しいプロトコルについて述べる。このプロトコルを適用すると、乳酸脱水素酵素活性が皮膚内で静止の毛包幹細胞で高いことがわかった。マウス胚性線維芽細胞より培養胚性幹細胞の高い染色プロトコルを培養マウス胚性幹細胞に適用することを明らかにしました。新鮮単離マウス大動脈の解析では、大動脈に垂直平滑筋細胞における染色を明らかにしました。提供手法を使用して、新鮮なまたは冷凍の組織で陽子を生成する酵素の活性を空間的にマッピングすることができます。

我々 は以前マウス皮膚20の活性測定法の場での結果を報告しました。図 3のように、上記の手順で説明したときの毛包の基部に毛包幹細胞の乳酸脱水素酵素活性の高いレベルが続いていたを見ました。これらの調査結果は、毛包幹細胞を皮膚の並べ替えと並べ替えられた細胞の活性測定法と幹細胞コンパートメント高乳?...

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Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

マッピング代謝: 監視組織で直接乳酸脱水素酵素活性

Nicotinatmide アデニン酸 (NAD(P)H) + H + 組織サンプルで直接生成酵素の酵素活性の分布をマッピングするためのプロトコルについて述べます。

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

mapping-metabolism-monitoring-lactate-dehydrogenase-activity-directly

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K ビュー.  UCLA. Nicotinatmide アデニン酸 (NAD(P)H) + H + 組織サンプルで直接生成酵素の酵素活性の分布をマッピングするためのプロトコルについて述べます。

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Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert NADH and FADH into ATP. Since mitochondria are also the primary site for oxygen use and nutrient oxidation to carbon dioxide and water, how efficiently they use oxygen and produce ATP directly relates to the efficiency of nutrient metabolism, nutrient requirements of the animal, and health of the animal. The purpose of this method is to examine mitochondrial respiration, which can be used to examine the effects of different drugs, diets and environmental effects on mitochondrial metabolism. Results include oxygen consumption measured as proton dependent respiration (State 3) and proton leak dependent respiration (State 4). The ratio of State 3 / State 4 respiration is defined as respiratory control ratio (RCR) and can represent mitochondrial energetic efficiency. Mitochondrial proton leak is a process that allows dissipation of mitochondrial membrane potential (MMP) by uncoupling oxidative phosphorylation from ADP decreasing the efficiency of ATP synthesis. Oxygen and TRMP+ sensitive electrodes with mitochondrial substrates and electron transport chain inhibitors are used to measure State 3 and State 4 respiration, mitochondrial membrane PMF (or the potential to produce ATP) and proton leak. Limitations to this method are that liver tissue must be as fresh as possible and all biopsies and assays must be performed in less than 10 h. This limits the number of samples that can be collected and processed by a single person in a day to approximately 5. However, only 1 g of liver tissue is needed, so in large animals, such as dairy cattle, the amount of sample needed is small relative to liver size and there is little recovery time needed.

Here, we share methods for measuring mitochondrial oxygen consumption, a defining concept of nutritional energetics, and proton leak, the primary cause of inefficiency in mitochondrial generation of ATP. These results can account for 30% of the energy lost in nutrient utilization to help evaluate mitochondrial function.

ホルスタイン種乳牛におけるミトコンドリア呼吸を推定する肝ミトコンドリアの酸素消費量とプロトン リーク動態測定

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

生化学

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and progression. Complexity within the tumor microenvironment, including tumor secretome, low-grade inflammation, hypoxia, and redox imbalance, fosters heterotypic interaction and allows the transformation of inactive resident fibroblasts to become active CAFs. CAFs are metabolically distinguished from normal fibroblasts (NFs) as they are more glycolytically active, produce higher levels of reactive oxygen species (ROS), and overexpress lactate exporter MCT-4, leading to the opening of the mitochondrial permeability transition pore (MPTP). Here a method has been described to analyze the mitochondrial health of activated CAFs isolated from the multicellular 3D tumor spheroids comprising of human lung adenocarcinoma cells (A549), human monocytes (THP-1), and human lung fibroblast cells (MRC5). Tumor spheroids were disintegrated at different time intervals and through magnetic-activated cell sorting, CAFs were isolated. The mitochondrial membrane potential of CAFs was assessed using JC-1 dye, ROS production by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) staining, and enzyme activity in the isolated CAFs. Analyzing the mitochondrial health of isolated CAFs provides a better understanding of the reverse Warburg effect and can also be applied to study the consequences of CAF mitochondrial changes, such as metabolic fluxes and the corresponding regulatory mechanisms on lung cancer heterogeneity. Thus, the present study advocates an understanding of tumor-stroma interactions on mitochondrial health. It would provide a platform to check mitochondrial-specific drug candidates for their efficacies against CAFs as potential therapeutics in the tumor microenvironment, thereby preventing CAF involvement in lung cancer progression.

Multicellular 3D tumor spheroids were prepared with lung adenocarcinoma cells, fibroblasts, and monocytes, followed by the isolation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) from these spheroids. Isolated CAFs were compared with normal fibroblasts to assess mitochondrial health by studying the mitochondrial transmembrane potential, reactive oxygen species, and enzymatic activities.

3D多細胞肺腫瘍スフェロイドから分離された癌関連線維芽細胞におけるミトコンドリアの健康評価

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

がん研究

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells are enzymes and their activity is heavily regulated at many levels, including the transcriptional, mRNA stability, translational, post-translational and functional level. This complex regulation means that conventional quantitative or imaging assays, such as quantitative mRNA experiments, Western Blots and immunohistochemistry, yield incomplete information regarding the ultimate activity of enzymes, their function and/or their subcellular localization. Quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry (i.e., metabolic mapping) show in-depth information on in situ enzymatic activity and its kinetics, function and subcellular localization in an almost true-to-nature situation.
We describe a protocol to detect the activity of dehydrogenases, which are enzymes that perform redox reactions to reduce cofactors such as NAD(P)+ and FAD. Cells and tissue sections are incubated in a medium that is specific for the enzymatic activity of one dehydrogenase. Subsequently, the dehydrogenase that is the subject of investigation performs its enzymatic activity in its subcellular site. In a chemical reaction with the reaction medium, this ultimately generates blue-colored formazan at the site of the dehydrogenase&#39;s activity. The formazan&#39;s absorbance is therefore a direct measure of the dehydrogenase&#39;s activity and can be quantified using monochromatic light microscopy and image analysis. The quantitative aspect of this protocol enables researchers to draw statistical conclusions from these assays.
Besides observational studies, this technique can be used for inhibition studies of specific enzymes. In this context, studies benefit from the true-to-nature advantages of metabolic mapping, giving in situ results that may be physiologically more relevant than in vitro enzyme inhibition studies. In all, metabolic mapping is an indispensable technique to study metabolism at the cellular or tissue level. The technique is easy to adopt, provides in-depth, comprehensive and integrated metabolic information and enables rapid quantitative analysis.

Here, we present a protocol that can be used to microscopically visualize and quantify activity of dehydrogenases in cells and tissues and its kinetics, function and subcellular localization.

代謝のマッピング: 定量的酵素組織化学および組織化学細胞や組織における脱水素酵素の活性を決定するには

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

免疫・感染学

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

カルシウムイメージング、細胞傷害測定、およびアデノウイルス感染の目的のための膵臓腺房細胞の調製

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

生物学

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

外酸生産の測定と解析は、解糖速度を決定するために

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

教育実習でラクターゼ酵素活性の測定

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

隔離の乳酸脱水素酵素試金-哺乳類細胞における一括 Autophagic 隔離活動を決定するシンプルで信頼性の高い方法

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Evaluating Cytotoxicity and Membrane Integrity in Lung Slices via Lactate Dehydrogenase Assay

Source: Neuhaus, V., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57042">Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the lactate dehydrogenase, LDH assay to measure the cytotoxic effect of a test substance and its effect on the membrane integrity in human precision-cut lung slices. The assay provides a quantitative measure of cell death or damage in the sample.

乳酸デヒドロゲナーゼアッセイによる肺切片の細胞毒性と膜完全性の評価

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines
1. General Preparation of Human PCLS ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫診断

特殊なアッセイ

Quantifying Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Source: Luhr, M. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57971">The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates an assay for assessing bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells. It utilizes electroporation to release cytosolic proteins, including lactate dehydrogenase (LDH). The sequestered LDH and total cellular LDH fractions are determined to assess LDH sequestration, providing insights into the overall bulk sequestration activity.

哺乳類細胞におけるバルクオートファジー隔離活性の定量化

1. Cell Seeding and Treatment

	Culture adherent cells in 75 cm2&#160;tissue culture flasks in a humidified incubator with 5% CO2&#160;at 37 &#176;C, ...

細胞免疫診断

Colorimetric Assay for Quantification of Lactate in Test Samples

Source: Yanase, S., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57807">Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video describes a colorimetric assay for lactate measurement in cell lysates by using the lactate dehydrogenase enzyme. This enzyme converts lactate into pyruvate, along with the conversion of NAD to NADH that reacts with tetrazolium dyes and gives a colored product that can be measured spectrophotometrically to quantitate the lactate.

試験サンプル中の乳酸の定量のための比色アッセイ

Source: Yanase, S., et al. Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. ...

マッピング代謝: 監視組織で直接乳酸脱水素酵素活性

要約

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ホルスタイン種乳牛におけるミトコンドリア呼吸を推定する肝ミトコンドリアの酸素消費量とプロトンリーク動態測定

3D多細胞肺腫瘍スフェロイドから分離された癌関連線維芽細胞におけるミトコンドリアの健康評価

代謝のマッピング: 定量的酵素組織化学および組織化学細胞や組織における脱水素酵素の活性を決定するには

カルシウムイメージング、細胞傷害測定、およびアデノウイルス感染の目的のための膵臓腺房細胞の調製

外酸生産の測定と解析は、解糖速度を決定するために

教育実習でラクターゼ酵素活性の測定

隔離の乳酸脱水素酵素試金-哺乳類細胞における一括 Autophagic 隔離活動を決定するシンプルで信頼性の高い方法

乳酸デヒドロゲナーゼアッセイによる肺切片の細胞毒性と膜完全性の評価

哺乳類細胞におけるバルクオートファジー隔離活性の定量化

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