Name: evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay
Uploaded: 2018-06-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
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我々 は感謝ローラ Denti、ヴァレンティーナなガール フレンドとの UCL 眼科研究所で生物資源部スタッフは、テクニカル サポートのマウス飼育とカミーユ Charoy ヘルプします。この作品は、c. Ruhrberg、j. t. ブラッシュ (FS/13/59/30649) に英国心臓財団博士課程学生の身分 (氏/N011511/1) 医学研究評議会の助成金によって支えられました。

すべての動物の仕事は英国ホーム オフィスと機関の動物福祉・倫理的なレビューの体 (AWERB) のガイドラインに従って実施されました。
1. マウス作製
注: は、生後 6 ヶ月にまで少なくとも 8 週齢、成体マウスの実験を実行します。技術の再現性と一貫性のあるタイミングの異なる動物間この手順の各ステップを示すために実験的セッションごとに 2 の最小値と最大 6 匹のマウスを使用します。遺伝子組み換えマウスで透過性を誘発する物質の突然変異の効果の評価、理想的には、2 の変異マウスと実験あたり 2 濾胞を使用します。
<ol><li>24 時間刺激的な血管血管前の適切な吸入麻酔薬イソフルランなどを用いたマウスを麻酔します。立ち直り反射が失われ、マウスが外部刺激に応答するまで、麻酔導入の 3% イソフルランを使用します。麻酔維持のため 1.5% イソフルランを使用 (マウスが一定の呼吸数であることを確認)。麻酔下で慎重に、電気シェーバー、皮膚への傷害を避けることを各マウスの両翼を剃る。 注: 動物にストレスの原因を避けるために、皮膚損傷の結果可能性がありますシェービング中の動きを最小限に抑えるため、麻酔が使用されます。</li>
	<li>坊主のマウスをその家のケージに戻ります。雄マウスの各男性に個々 のケージにしないように麻酔回復後配置の戦いと、そのため、皮膚を損傷します。雌マウスのグループの彼らの家のケージに戻します。 注: 場合ケージの雄マウスの間に戦闘の現象は、施術前に区切ります個々 のケージに癒すために皮膚損傷の可能性を許可する実験の前に 3 日間。</li>
	<li>までは (通常数秒) 内で意識を回復し、(通常は 1 分) 内のケージの周りを移動、マウスを監視します。</li>
</ol>2. 静脈内注射・ エヴァンスの青い色素
<ol><li>流キャビネットでヒスタミン阻害剤ピリラミン マレイン酸 (4 μ g/μ L で 0.9% 生理食塩水) ・ エバンス ブルー色素 (1% 0.9% 生理食塩水の w/v) 個別に滅菌ソリューションを準備します。22 μ m フィルターを通して解決策を渡すことによって殺菌しなさい。</li>
	<li>30 G の針で 10 μ L ピリラミン マレイン酸ソリューション/グラムの体重 (図 1 a) それぞれのマウス腹腔内注入するのに滅菌 1 mL 注射器を使用します。注入、最初、首筋、マウスを行い、地面に向かって頭を監督し、腹部が上向きに指示される、それを傾けます。膀胱にぶつからないように正中線から腹部のより低い象限儀で注入します。 注: 8 週と生後 6 ヶ月の間のマウスの重量通常範囲は 15 と 30 g. ピリラミン マレイン酸が放出を阻害するテストするエージェントとは関係なく血管漏れを促進するそれ以外の場合、内因性のヒスタミンの。</li>
	<li>血管拡張を促進するために 10 分の 37 ° C の熱チャンバー内でマウスを配置します。また、熱ランプの使用はローカル倫理的なガイドラインによって許可されている場合は、血管拡張を促進するために、しっぽに焦点を当てた適切な熱ランプを使用します。</li>
	<li>マウス落に一度に 1 つのマウスを移動して 70% エタノール注入領域をきれいにし、血管拡張を促進する尾をこする。</li>
	<li>1 mL の滅菌注射器 30 G 針を使用して、100 μ L を管理 (図 1 b) の尾静脈を介して静脈内エバンス ブルー色素。すぐに出血を防ぐために親指と指尾を保持することによって、注射部位に圧力を適用します。 注: 尾静脈の可視化は、注入領域にひを向けることによって改善できます。マウス尾静脈に静脈注射の実行に関する詳細は、公開されているプロトコル18で見つけることが。</li>
	<li>30 分間循環する色素を許可します。</li>
</ol>3. 血管血管を刺激します。
<ol><li>20 μ L のボリュームで配信される最終的な投与ができる濃度に関心の透過性誘導剤を希釈滅菌ソリューションを使用すると、キャビネット層流。 注:図 1-図 2に示すように、pbs は、2.5 ng/μ L の濃度で血管の血管を刺激するために VEGFA を使用例実験で車両制御として使用されます 50 ng、および PBS の総線量を降伏します。</li>
	<li>31 G 針 2 別の 300 μ L の滅菌シリンジに関心と車両制御の透磁率を誘発するエージェントをロードします。それぞれのマウスに 3 通ソリューションの 20 μ L 注入する十分なソリューションを読み込む (すなわち針のデッド ボリュームを考慮するエージェントとマウス、プラス追加ボリュームあたりの車両の 60 μ L を準備)。</li>
	<li>イソフルラン (3% 麻酔導入立ち直り反射が失われ、マウスが外部刺激に応答するまで、マウスが一定の呼吸率を確かめる麻酔維持のため 1.5%) でテストする最初のマウスを麻酔します。</li>
	<li>掻きマウス (図 1) の側面に透過性促進剤の 20 μ L を注入します。針が、皮膚に対して 15 ° の角度であることを確認します。成功した注入を示す皮膚内で発生したバブルの形成を確認します。少なくとも 1 cm 離れて、2 追加サイトに皮内注射を繰り返します。</li>
	<li>第 2 側面を公開し制御車両ソリューションと帳票の注射を繰り返しますマウスをオンにします。皮膚のサンプルのそれに続くコレクションの識別を容易にするために各部位の位置を紙に記録します。 注: この段階で慎重にマウスの皮膚を処理します。たとえば、皮内注射の際の皮膚をつまんでは避けてください。</li>
	<li>その家のケージに注入されたマウスを戻り、それが (数秒) 内では通常意識を回復し、ケージの周りに移動するまでマウスを監視します。</li>
	<li>最初のマウスは、回復しながらすぐに手順 3.3 3.5 秒のマウス (までの六つのセッションごとに最大限にマウス).各マウスは、以降のステップに進むための時間を調整する注入した時の記録を残します。</li>
</ol>4. 真皮内で蓄積されたエバンス ブルーの定量化
<ol><li>マウスが注入された同じ順序を観察、皮内注射を受けた後、頚部転位 20 分で各マウスを処分します。 メモ: 血管漏れの期間使用すると、透水性誘導剤によって異なります、したがって、皮内注射と殺処分の間の時間を最適化するを必要があります。</li>
	<li>各場所は、その前後のクリーンな組織 (図 1) で包まれたコルク ボードに足ピンにマウスを抜粋しました。</li>
	<li>鋏は使いよう 】 を使用して、死んだマウスの胸まで下腹部から約 3-4 cm の縦切開を作る。メスと鉗子、真皮の内側とエバンス ブルー蓄積 (図 1E) のサイトを明らかにするための両方の側面から皮膚はいじめます。たるんだ皮膚をピンで止めるし、メスの漏れサイトの周りの地域から脂肪を除去します。必要な場合は、皮膚にエバンス ブルー漏れの大きさを示す代表的な写真を撮る。</li>
	<li>鉗子やメスを使用して、各サイトの流出・ エバンス ブルー色素を含む消費税皮膚領域は透過性誘導剤や車両を注入しました。 注意: 後続ステップ 4.7 ホルムアミド ボリュームの似ている部分が残りホルムアミドのようなボリュームで希釈する抽出された色素をできるように、各皮膚サンプルが吸着されること、ように皮膚の同様に大きさで分類された地域を消費税に世話します。.3.5 の手順で記録したインジェクション マップは、摘出するエリアを定義に役立ちます。</li>
	<li>1.5 mL チューブに各サンプルを配置し、それに応じて、ラベル付け、管の底にかかっている各サンプルを確かめます。さらに使用するまでの 20 ° C でサンプルを格納します。すぐに処理する場合以下の手順に従います。</li>
	<li>オーブンでまたは 55 ° C で加熱ブロックのウェルに開いてチューブを配置することによって、皮膚のサンプルを一晩乾燥します。</li>
	<li>エバンス ブルー色素を抽出、発煙のフードのサンプルを 250 μ L の脱イオン ホルムアミドを追加、チューブを閉じます。皮膚サンプル ホルムアミドすべて覆われてしまっています、オーブンまたは 55 ° C で加熱ブロックで一晩インキュベートを確認します。</li>
	<li>遠心分離機の最大速度でベンチトップ遠心分離機のサンプル (> 10,000 x g) 40 分。</li>
	<li>ヒューム フードの透明は、平底 96 ウェル プレート (図 2 a) の別のウェルに各サンプルから色素を含む上清の 100 μ L を転送します。</li>
	<li>メジャー ピーク 620 エバンス ブルー吸光度 740 のリファレンスを読む nm nm の分光光度計です。 注: 620 nm がピークのエバンス ブルーの吸光度、ながら 740 nm エバンス ブルーは吸収されない、参照波長を果たします。</li>
	<li>(図 2 b) 技術的な可変性を考慮して同じエージェントまたはマウスの各車両の帳票注射の吸光度の測定値の平均値します。</li>
	<li>対車両制御 (図 2) 透水性誘導剤からの測定値の倍の違いを計算します。</li>
</ol>

<ol>
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著者は宣言する利害の対立があります。

195217の最初の記述からマイル アッセイは血管の血管の分子機構を研究するため比較的、簡単、迅速かつ信頼性の高い方法で研究者を提供しています。たとえば、マイル アッセイは、したがって19,20,21を誘発するまたは血管ブロック エージェント8 の有効性をテストする能力や異なるエージェントの効力をテストする使用されています、22,23。別の例として血管透過性亢進を誘発するエージェントは、遺伝子改変マウス及び特定の受容体とシグナル伝達タンパク質リガンド誘導性の血管のための要件を決定する彼らの濾胞でテストされています。レスポンス10、11,12,13,14,15,20,23。マイルの試金のいくつかの変更されたバージョンはので、トレーサーの使用に関して、例えば使用されています。したがって、さまざまなサイズの微粒子11,13dextrans の蛍光標識といくつかの研究でエバンス ブルーを置き換えられます。
血管血管メカニズムを調査するため他のアッセイのマイル アッセイの主な利点はそれが比較的容易に行えるし、高価な機器を必要としません。さらに、そのまま血管のコンテキストでこのアッセイのモデルの血管漏れ、体内法を通して漏れを測定に関係なく体外試金のトランスもフラックス アッセイまたはトランス内皮電気抵抗 (のようTEER) アッセイは、内皮細胞の単層のみ、焦点します。したがって誘導剤の異なる配送ルートを活用してまたはのため別のサイトで血管漏れを分析することによって、ここで説明するマイル アッセイから血管血管の代替生体内で試金が異なる場合があります。続いて血管漏れ検査、肺や気管の11,13,15尾静脈を介してエージェントの全身投与による例です。マイルの試金の制限の 1 つは、します特定のエージェントの皮内注射、原則としても血圧と内皮バリアに加えてフローに影響も直接血管の透過性の影響をそのため。それにもかかわらず、この試金は最近による血管透過性を測定するため示されている VEGF の全身血圧15に及ぼす影響とは無関係。マイルの試金のもう一つの制限は、さまざまな組織で血管ベッドに異なる透過性促進剤及び皮膚のマイルの試験で得られた結果できない場合があります、したがって、代表などで発生する内容の応答可能性があります、肺や脳。
動物の年齢と体重は、マイルのアッセイで漏に影響を与える可能性があります。研究者をこれらの変数の影響を最小限に抑えるには、同腹子を使用する必要がありますまたは同様にサイズを使用して、コントロールとしてマウスを高齢者します。ときマウス興味の特定遺伝子の変異を評価し、マウス コントロールとして使用されるヘテロ接合体の繁殖戦略と野生型同腹子対ヘテロ接合体を生成します。さらに、いくつかの麻酔薬を静脈注射24,25を介して投与の記載されている血管収縮を避けるためにすぐに元に戻せる状態のガス麻酔薬イソフルランなどを使用することをお勧めします。マウス外側尾静脈にエバンス ブルー色素の注入はこのプロトコルの重要なステップを実験とデータの品質に大きく影響することができます。したがって、研究者は尾静脈注射を行う主務する必要があります、可能性があります必要があります経験またはマイル測定開始前に練習実験します。代わりに、研究者は、エバンス ブルー、レトロな軌道注入それを経験している場合などを提供するのに他の静脈内のルートを使用できます。透過性促進の皮内注射ソリューションは皮膚にエージェントに依存しない損傷を引き起こすことができます。そのため、皮内注射ボリュームの 20 μ l を超えないようにする必要があります、する必要があります常にヒスタミン阻害剤の存在下で行わし、車両制御の注射に正規化します。
マイル アッセイに使用されている多くの研究者によって、VEGF のシグナル伝達経路のたとえば、コンポーネントを評価 VEGF A 誘発血管透過性亢進の原因腹水癌患者16とビジョンを損なういくつかの新生血管浮腫目の病気7。私たちと他の人が VEGF A シグナル伝達カスケード12,13,14,の特定のコンポーネントの不足のために遺伝的に変更されたマウスにおける VEGF の誘導血管漏れを比較するのにマイルの試金を使用しているため、15,20,23. メインの病理学的 VEGF のアイソ VEGF165、信号 VEGFR2 と NRP1 の細胞質ドメインが SRC 家族キナーゼの ABL キナーゼを介した活性化を促進する NRP1 の複合体を介して、このアプローチを使用して私たちの最近の研究が明らかに14血管の応答を呼び起こす。VEGFA はまた血管の成長を促進する、その血管の活動は具体的には抑制されること場合、虚血性の組織に血流を回復する治療に使用可能性があります、したがって。操縦する血管の血管に向かって血管内皮細胞の VEGF の応答分子機構の解明研究があります、したがって、病理学的 VEGF A 誘発浮腫を抑制する選択的に操作できる経路を識別がんや虚血性眼疾患等の疾患。マイルの試金はこれらと分子のレギュレータと血管血管のエフェクターを解明する機能研究の他の多くの種類を支えるための便利な方法をする間違いなくいきます。

心血管システムの主な機能は循環のすべての臓器組織間ガス, 栄養素, と廃棄物の転送を有効にするのには。血管は、このような交換の1を許可するように基底の透磁率の臓器固有のレベルを持っています。例えば、腎臓の血管が血液脳関門を形成するタイトな非常に不可解なインタ フェース2,3,4ながら、浸透性の高い。血管の内側の粘膜を形成する内皮細胞は循環と基になる組織の間の物理的な障壁を提供して臓器特異的に血管透過性を調節します。しかし、ある特定の刺激は基底のレベル1を超える間に循環からの流体の漏出を高めるため内皮障壁の部分的崩壊を引き起こします。このような血管は、たとえば、サイトで観測された組織の外傷、炎症、腫瘍での敗血症、新生血管の疾患、脳や心臓、目の中に組織の虚血が発生するとそれぞれ脳卒中や心筋梗塞が原因5,6,7,8します。 慢性的に上昇、血管浮腫、眼疾患9に視力の低下など、組織の損傷が原因となりが発生。したがって、血管血管応答のモデリングは血管透過性を増加するメカニズムを理解するため、これを阻害するエージェントの有効性をテストすることが望ましい。
マイル アッセイは、血管の血管の代理指標として体内の血管漏れ対策確立、一般的に使用される、比較的単純な手法です。マイル アッセイが評価する信頼性の高い方法を提供する考えが一般に血圧や血流などの内皮障壁規制とは関係なく血管漏れを高める可能性があります因子を配合アカウントに入れないのに、物質の透磁率変調活動し、彼らの活動を促進するシグナル伝達の仲介。したがって、マイル アッセイは血管の血管のメディエーターとアクション10、11,12,13,のメカニズムを識別した数多くの研究に不可欠なされている14,15など血管内皮増殖因子 VEGF のことはもともと VPF16血管透過性因子として同定されました。
もともとモルモット17血管透過性亢進を勉強するマイルとマイルによって開発された, その分析後に適応されました選択血管透過性の分子機構を解明するためのモデル生物であるマウスを使用して遺伝子操作に彼らの絶妙な適合性のための規則。簡単に言えば、エバンス ブルー色素を静脈内に成体マウスに注入し、30 分 (図 1) を循環させること。車両制御対透水性誘導剤は血管漏出 (図 1) を誘発するために、マウスの側面に反対で複数のサイトでは皮内注射します。その結果、アルブミン結合エバンス ブルー色素は extravasates、(図 1) 真皮に蓄積されます。後マウスをカリング人道的、エバンス ブルーは真皮から抽出され血管漏出のレベルは光学濃度 (図 2) 物質-車両によるテストの比率として計算されます。

<table><tbody><tr><td>Pyrilamine maleate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5514-5G</td><td>Resuspend in PBS</td></tr><tr><td>Deionised Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4117</td><td>Use in fume cupboard</td></tr><tr><td>Microlance Needles 30g x 0.5&quot;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Plastipak 1ml Luer</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Mouse restrainer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hair clippers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Merial</td><td>ap/drugs/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Scalpal&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunt scissor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heatblock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cork board</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop refrigerated centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165</td><td>Reliatech</td><td>M30-004</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay

脊椎動物の生物における血管内皮細胞の主な機能は、血液と血液細胞、プラズマ高分子と水に内皮細胞の透過性によると合わせることができるという、体の各組織間の障壁として機能するには生理学的な必要はありません。特定疾患におけるサイトカインおよび成長因子が解放される一過性の血管透過性を増加する内皮障壁を対象とします。ただし、彼らの長期の存在は、慢性血管血管と浮腫のことにより組織損傷を引き起こす可能性があります。マイル アッセイは、血管漏れのプロキシの測定を通して血管血管を研究する研究者を可能にする生体内で手法です。ここでは、哺乳類の生理学と病理学を研究に最も広く使用されているモデル生物であるマウスでこの手順を実行する方法の詳細なプロトコルを提供します。プロシージャは、ラベルをマウスの側面に反対に透過性誘導剤と車両制御ソリューションの複数の皮内注射が続く循環アルブミンにエバンス ブルー色素の静脈内投与を含みます。その結果、エバンス ブルー色素は、徐々 にそれが蓄積し、車両に対する透過性誘導剤による漏れと定量化のため抽出することができます真皮にリークします。マイル アッセイ野生型で実行することができますまたは遺伝的マウスモデルを変更し、血管の透過性を調節し、エージェント/ターゲットの誘導またはブロックできるを識別する分子機構を研究対象に薬剤管理と組み合わせることがしたがって。

車両制御 (PBS) 野生型 C57/Bl6 マウスにおける相対的血管漏出を誘導するのに VEGF A の能力を評価するためにマイルの試金を使用しました。ここで、20 μ L 溶液 50 皮内注射で刺激なしの野生型マウスを用いた代表的な実験を示す VEGF A PBS または車両 PBS のみの ng。VEGF a 注入皮膚サンプルでエバンス ブルー色素漏出の増加が明確 PBS と比較して明らかな上皮内(図 1E) だった、ホルムアミド (図 2 a) の色素の抽出の後。複数の実験の定量化は、ことを示しています 50 VEGF-A の ng は大幅 PBS 単独で (図 2 b)、平均よりも青漏れは三枚開き (図 2) の車と比較して血管・ リーケージの増加より多くのエバンスを誘導します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> 図 1: マイル アッセイにおける血管漏れの誘導します。模式図 (上部パネル) とマウスでマイルの分析を実行するときの一連のステップの対応する画像 (底面)。(A) ピリラミン マレイン酸は 10 ~ 30 分 (B) 100 μ l 1% マウスの尾に青いエバンス静脈注射前に内因性ヒスタミンの放出を防ぐために腹腔内に注入されます。(C) 30 分後、血管漏れはエージェントの皮内注射による (50 ng の VEGF-A の緑の円) 対車両制御 (PBS; 白い円).(D, E)エバンス ブルー蓄積のサイトにアクセス、マウスは皮内注射後の選別の 20 分、両翼の皮膚解剖し釘付けに。i. p.: 腹腔内;静脈: 静脈;内径: 皮;スケール バー、1 cm.<a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> 図 2: マイル アッセイにおける血管漏れの定量化します。(A) エバンス ブルーの染料は肌サンプルを図 1にそれぞれの皮内注射から得られた吸光度を分光光度計で読み取りの 96 ウェル プレートに読み込まれるからホルムアミドで抽出されます。(B、C)両方透過性を誘発するエージェントのいずれか (B) 正規化された吸光度値 (光学密度、OD) をプロットすることによって複数の実験から吸光度の測定値のグラフィカルな表現 (VEGF A; 濃い緑の円) および車両 (PBS; グレー円)、または (C) 倍 OD で車両対エージェントの変更 (誤差範囲: SEM)。帳票 PBS と VEGF のサンプルのように (A) の吸光度の測定値は平均化され (B、C) にそれぞれ白または緑の円で表示されます。<a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

ここでは、マウスの皮膚に透過性促進剤の皮内投与により血管漏出を測定するためのプロトコルを提案する.この手法は、促進、あるいは血管漏れを抑制または血管の透過性を調節する分子機構を研究する分子の能力を決定する使用できます。

マイル アッセイで皮膚の血管の血管誘導剤の評価

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

evaluating-vascular-hyperpermeability-inducing-agents-skin-with-miles

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K ビュー.  University College London. ここでは、マウスの皮膚に透過性促進剤の皮内投与により血管漏出を測定するためのプロトコルを提案する.この手法は、促進、あるいは血管漏れを抑制または血管の透過性を調節する分子機構を研究する分子の能力を決定する使用できます。

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Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary sites. Recently, we established that cancer cell dissemination in primary breast cancer and at metastatic sites in the lung occurs only at doorways called Tumor MicroEnvironment of Metastasis (TMEM). TMEM doorway number is prognostic for distant recurrence of metastatic disease in breast cancer patients. TMEM doorways are composed of a cancer cell which over-expresses the actin regulatory protein Mena in direct contact with a perivascular, proangiogenic macrophage which expresses high levels of TIE2 and VEGF, where both of these cells are tightly bound to a blood vessel endothelial cell. Cancer cells can intravasate through TMEM doorways due to transient vascular permeability orchestrated by the joint activity of the TMEM-associated macrophage and the TMEM-associated Mena-expressing cancer cell. In this manuscript, we describe two methods for assessment of TMEM-mediated transient vascular permeability: intravital imaging and fixed tissue immunofluorescence. Although both methods have their advantages and disadvantages, combining the two may provide the most complete analyses of TMEM-mediated vascular permeability as well as microenvironmental prerequisites for TMEM function. Since the metastatic process in breast cancer, and possibly other types of cancer, involves cancer cell dissemination via TMEM doorways, it is essential to employ well established methods for the analysis of the TMEM doorway activity. The two methods described here provide a comprehensive approach to the analysis of TMEM doorway activity, either in na&#239;ve or pharmacologically treated animals, which is of paramount importance for pre-clinical trials of agents that prevent cancer cell dissemination via TMEM.

We describe two methods for assessing transient vascular permeability associated with tumor microenvironment of metastasis (TMEM) doorway function and cancer cell intravasation using intravenous injection of high-molecular weight (155 kDa) dextran in mice. The methods include intravital imaging in live animals and fixed tissue analysis using immunofluorescence.

インビタルイメージングと固定組織解析を用いた癌細胞播種に伴う転移戸管媒介血管透過性の腫瘍微小環境の評価

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

がん研究

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

アン<em生体内で&gt;</em血管透過性をテストする&gt;アッセイ

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

医学

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

生体材料の血管新生を評価するために、完全な皮膚欠損モデル<em&gt;インビボ</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

生物工学

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. Exposure to an allergen in a sensitized individual can result in clinical symptoms that vary from minor erythema to life threatening anaphylaxis. In the laboratory, various animal models have been developed to understand the mechanisms driving allergic responses. Herein, we describe a detailed method for measuring changes in vascular permeability to quantify localized allergic responses. The local anaphylaxis assay was first reported in the 1920s, and has been adapted from the technique published by Kojima et al. in 20071. In this assay, mice sensitized to OVA are challenged in the left ear with vehicle and in the right ear with OVA. This is followed by an intravenous injection of Evans Blue dye. Ten min after injecting Evans Blue, the animal is euthanized and the dye that has extravasated into the ears is extracted overnight in formamide. The absorbance of the extracted dye is then quantified with a spectrophotometer. This method reliably results in a visual and quantifiable manifestation of a local allergic response.

Allergic responses, characterized by the activation of mast cells and basophils, are driven by the cross-linking of IgE and release of proinflammatory mediators. A quantitative assessment of allergic responses can be achieved by using Evans Blue dye to monitor changes in vascular permeability after allergen challenge.

マウスにおけるローカルアナフィラキシーの測定

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

免疫・感染学

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that system. Changes in blood flow to the small intestine can result in effects on the absorptive functions of the organ. Particular interest in toxins liberated from feedstuffs through fermentative and digestive processes has developed in ruminants as an area where productive efficiencies could be improved. The video associated with this article describes an in vitro bioassay developed to screen compounds for vasoactivity in isolated cross-sections of bovine mesenteric artery and vein using a multimyograph. Once the blood vessels are mounted and equilibrated in the myograph, the bioassay itself can be used: as a screening tool to evaluate the contractile response or vasoactivity of compounds of interest; determine the presence of receptor types by pharmacologically targeting receptors with specific agonists; determine the role of a receptor with the presence of one or more antagonists; or determine potential interactions of compounds of interest with antagonists. Through all of this, data are collected real-time, tissue collected from a single animal can be exposed to a large number of different experimental treatments (an in vitro advantage), and represents vasculature on either side of the capillary bed to provide an accurate picture of what could be happening in the afferent and efferent blood supply supporting the small intestine.

The small intestine is frequently exposed to toxins that can influence blood flow and negatively impact nutrient absorption. Using a multimyograph and mesenteric artery and vein isolates, compounds or toxins of interest can be screened for vasoactivity.

バイオアッセイとしてウシ腸間膜動脈と静脈の切片を分離して使用すると、小腸で血管作用をテストするために

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

A Methodological Approach to Non-invasive Assessments of Vascular Function and Morphology

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis. Damage to the endothelium may predispose the vessel to atherosclerosis and increase the risk for cardiovascular disease. Assessments of peripheral endothelial function are good indicators of early abnormalities in the vascular wall and correlate well with assessments of coronary endothelial function. The present manuscript details the important methodological steps necessary for the assessment of microvascular endothelial function using laser Doppler imaging with iontophoresis, large vessel endothelial function using flow-mediated dilatation, and carotid atherosclerosis using carotid artery ultrasound. A discussion on the methodological considerations for each of the techniques is also presented, and recommendations are made for future research.

The present article describes the methodological considerations for several non-invasive assessments of vascular function and morphology that are commonly used in medical research to assess different stages of atherosclerosis.

血管機能と形態の非侵襲的なアセスメントに方法論的アプローチ

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis.  Damage to the endothelium may ...

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose (MED) Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary to produce erythema (inflammatory reddening) on the surface of the skin. In this context, the MED is regarded as a key factor in determining starting doses for UV phototherapy for common skin conditions such as psoriasis and eczema. In research settings, MED testing also has potential to be a powerful tool for assessing within- and between-persons variation in inflammatory responses. However, MED testing has not been widely adopted for use in research settings, likely owing to a lack of published guidelines, which is a barrier to obtaining reproducible results from this assay. Also, protocols and equipment for establishing MED vary widely, making it difficult to compare results across laboratories. Here, we describe a precise and reproducible method to induce and measure superficial erythema using newly designed protocols and methods that can easily be adapted to other equipment and laboratory environments. The method described here includes detail on procedures that will allow extrapolation of a standardized dosage schedule to other equipment so that this protocol can be adapted to any UV radiation source.

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose MED Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Minimal erythema dose (MED) testing is used to establish dosage schedules for ultraviolet radiation phototherapy. It can assess individual variation in inflammatory response but lacks methodology for achieving reproducible results. Here, we present a precision implementation of MED and demonstrate its ability to capture individual variation in inflammatory response.

ヒト炎症反応の個々の変動を評価するための最小紅斑用量(MED)試験の精密実施

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

ラット腸間膜に微小血管透過性の調節を調査するために、微小灌流法

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

生物学

ヒトにおける微小血管機能障害の新規メカニズムの解明

Intradermal Microdialysis: An Approach to Investigating Novel Mechanisms of Microvascular Dysfunction in Humans

The cutaneous vasculature is an accessible tissue that can be used to assess microvascular function in humans. Intradermal microdialysis is a minimally invasive technique used to investigate mechanisms of vascular smooth muscle and endothelial function in the cutaneous circulation. This technique allows for the pharmacological dissection of the pathophysiology of microvascular endothelial dysfunction as indexed by decreased nitric oxide-mediated vasodilation, an indicator of cardiovascular disease development risk. In this technique, a microdialysis probe is placed in the dermal layer of the skin, and a local heating unit with a laser Doppler flowmetry probe is placed over the probe to measure the red blood cell flux. The local skin temperature is clamped or stimulated with direct heat application, and pharmacological agents are perfused through the probe to stimulate or inhibit intracellular signaling pathways in order to induce vasodilation or vasoconstriction or to interrogate mechanisms of interest (co-factors, antioxidants, etc.). The cutaneous vascular conductance is quantified, and mechanisms of endothelial dysfunction in disease states can be delineated.

著者スポットライト:心血管疾患リスク集団のメカニズムを明らかにするための薬理学的解剖アプローチ 

Intradermal microdialysis is a minimally invasive technique used to investigate microvascular function in health and disease. Both dose-response and local heating protocols can be utilized for this technique to explore mechanisms of vasodilation and vasoconstriction in the cutaneous circulation.

皮内微小透析:ヒトにおける微小血管機能障害の新しいメカニズムを調査するためのアプローチ

The cutaneous vasculature is an accessible tissue that can be used to assess microvascular function in humans. Intradermal microdialysis is a minimally ...

マイルアッセイで皮膚の血管の血管誘導剤の評価

要約

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インビタルイメージングと固定組織解析を用いた癌細胞播種に伴う転移戸管媒介血管透過性の腫瘍微小環境の評価

アン

生体材料の血管新生を評価するために、完全な皮膚欠損モデル

マウスにおけるローカルアナフィラキシーの測定

バイオアッセイとしてウシ腸間膜動脈と静脈の切片を分離して使用すると、小腸で血管作用をテストするために

血管機能と形態の非侵襲的なアセスメントに方法論的アプローチ

ヒト炎症反応の個々の変動を評価するための最小紅斑用量(MED)試験の精密実施

ラット腸間膜に微小血管透過性の調節を調査するために、微小灌流法

皮内微小透析:ヒトにおける微小血管機能障害の新しいメカニズムを調査するためのアプローチ

皮内微小透析:ヒトにおける微小血管機能障害の新しいメカニズムを調査するためのアプローチ

マイル アッセイで皮膚の血管の血管誘導剤の評価

要約

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インビタルイメージングと固定組織解析を用いた癌細胞播種に伴う転移戸管媒介血管透過性の腫瘍微小環境の評価

アン

生体材料の血管新生を評価するために、完全な皮膚欠損モデル

マウスにおけるローカルアナフィラキシーの測定

バイオアッセイとしてウシ腸間膜動脈と静脈の切片を分離して使用すると、小腸で血管作用をテストするために

血管機能と形態の非侵襲的なアセスメントに方法論的アプローチ

ヒト炎症反応の個々の変動を評価するための最小紅斑用量(MED)試験の精密実施

ラット腸間膜に微小血管透過性の調節を調査するために、微小灌流法

皮内微小透析:ヒトにおける微小血管機能障害の新しいメカニズムを調査するためのアプローチ

皮内微小透析:ヒトにおける微小血管機能障害の新しいメカニズムを調査するためのアプローチ

マイルアッセイで皮膚の血管の血管誘導剤の評価