重音テト-ヤップS127Aマウス; の贈り物ありがとう f ・ カマルゴR26 rtTAM2マウス (株式 #006965)、ジャクソン研究所から購入しました。FACS 手順のヘルプについては、キアラ Frasson とジュゼッペ ・通奏低音をありがとうございます。この作品は AIRC 特別プログラム分子臨床腫瘍 ' 5 パーミル」によってサポートされ、AIRC PI-、S.P とエピジェネティクスの旗艦プロジェクト CNR Miur によって許諾する s. p.このプロジェクトは、欧州連合のホライゾン 2020年研究および革新プログラム (許諾契約 DENOVOSTEM 号 670126) の下で欧州研究会議 (ERC) からの資金を受けています。

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著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

ここで1を既に報告されているヤップの一過性の発現によって対応する前駆細胞の細胞 (または ySCs) にさまざまな組織の前のヴィヴォ最終分化した上皮細胞をプログラムし直すためのプロトコルは提示します。我々 は 2 つの手順の詳細な: 1 つレンチウイルスベクターとウイルス感染を回避し、トランスジェニック ヤップ式の活用第 2 1 つを FACS 精製細胞のプログラムし直すことができます。各プロトコルを分離するための効率的な戦略を提示し、プライマリ分化細胞の培養と外因性を強制する戦略ヤップ・ デ ・ ノボ体性組織固有拡張可能な幹細胞 (参照を生成する分化した細胞の遺伝子発現図 1 aと2 aのスキーム)。
我々 は決して否定的なコントロールのサンプル (図 1および2 C) から任意の副産物を検出という事実によって示されるように分化した細胞の純粋な人口を効果的に紹介する分離戦略に分離を行った。
本研究で一次乳腺 LD 細胞のリプログラミング用レンチウイルスベクターはドキシサイクリン誘導、遺伝子発現のタイトなコントロールの可能性を提供します。これにより、オンにして外因性ヤップ オフで表現されます。特に注意は、リプログラミング効率の面で支障が出るこのすることができます過剰なウイルス力価の使用を避けることで配置必要があります。プライマリ腺房細胞の場合我々 は最小限の操作でヤップ依存型のリプログラミングを取得する完全に遺伝子組換え手法に切り替えました。この後者の戦略は孤立した腺房クラスター、やっとのことでレンチ ウイルスの感染を受けやすい、非常に壊れやすい主膵腺に特に適しています。形質転換戦略では、ドキシサイクリン依存性遺伝子発現のタイトなコントロールのレンチウイルスベクターの同じ利点を提供しています。また、主な膵腺と悪用される形質転換戦略は LD の乳腺細胞のウイルス誘導リプログラミングと比較してはるかに高いリプログラミング効率の付加的な利点を負いません。異なったティッシュから得られるセルに関連付けられている異なる組み込み可塑性、を超えて膵リプログラミングが多い可能性がありますに由来するすべての制服と自律のヤップ式に関連付けられた式の高効率explanted セルです。特に、外因性ヤップがもはや必要である ySCs (yMaSC のコロニーおよび yDucts) の生成後自己再生能力に影響を与えずに実証しました。YSCs 内因性ヤップ/タズを再アクティブ化して外因性ヤップ1オフになっているときの自己更新のためそれらを使用するためです。
YSCs は確かに分化した細胞から現れる遺伝的系統トレース検証1リプログラミング実験の起源の細胞を制御することによって概念を検証しました。
広範な評価ySCs のリプログラミング ヤップによる通常体 SCs1として私を生成することを示しています) トランスクリプトーム レベルで ySCs 表示ネイティブ SCs; 大規模な重複ii) ySCs の分化の能力を表示し、いつもの原点の自分の組織の id に制限長子孫を生成できます。iii) ySCs は非変形し、非発癌性と生体内移植します。
ここを維持し、文化を展開する手順を述べる yMaSCs と yDucts organoids として 100% 基底膜マトリックス ヒドロゲルに埋め込まれています。これらの条件は、自己組織化の未分化性文化の長期的なメンテナンスを確保する三次元 organoids に ySCs、下流解析のアプリケーションで集団を幹これらを展開するを有効にします。未知の理由のため、我々 は yMaSC を取得に失敗しましたを置くことによってオルガノイド感染における培養条件で直接 LD 細胞プラスチック培養プレートのドキシサイクリン治療後 7 日つまり、乳腺のコロニーの条件の中間の成長ステップが不可欠です。私たちの手でさらにネイティブ MaSCs 培養継前に乳腺のコロニーの条件が必要です。さらに、単一のセルにプライマリのコロニーを分離を避けるため organoid 培養条件にそのままコロニーを転送ではなく我々 が最も効率的な organoid 副産物が得られます。
における培養条件はまた、organoids 窒素風呂で凍結する前に細胞解離を避けること彼らの行列から回復される ySCs、凍結保存する可能性を与えることの利点を耐えます。
発表手順を再プログラミング ヤップの対応する組織幹細胞 (テストしましたが乳腺、膵、神経細胞を用いた) に異なる成体組織から派生した分化細胞型に変換できます1。Ips または他のリプログラミングの努力からの違いでヤップ/誘導 SCs に起源のティッシュの思い出を維持できます。注記のうち、体細胞の幹のような特性に恵まれている細胞分化解消、細胞運命の可塑性の唯一の形態、組織の損傷後など、創傷治癒の5,17をサポートする生体内で観察されたリプログラミング,18,19,20. ヤップと TAZ が主通常恒常性に不可欠であることは注目に値するが、複数組織11,21の組織の修復のために重要です。一貫してここでプログラムし直す手順の生理的な機能を持つヤップ/タズ示されている最近に成人の腸内細胞の転換を引き起こすことによって潰瘍性大腸炎患者のマウス ・ モデルにおける腸管再生に必要とされます。19胎児の腸の機能が表示されます修復上皮。ヤップ リプログラミングところ体外をキャプチャするために挑戦している状態の体性幹細胞を生成する手段を提供することによって現在の誘導細胞可塑性戦略が広がります。このアプローチでは、ひと由来細胞にも拡張が体細胞の未分化状態の研究への再生医療応用から広範な関連性があるし、体細胞の拡張のための in vitro細胞幹します。

組織固有の体性幹細胞 (SCs) は、損傷後組織更新と修理のため重要です。簡単に分離し、限りなくの展開ex vivo体細胞 SCs 表す基礎研究と疾患モデルの SC 用だけでなく、潜在的な再生療法のための重要な問題する可能性。ただし、この方向の進歩は様々 な上皮臓器体外の SC 状態のキャプチャの難しさによって制限されており。確かに、いくつかの成体は、常駐 SCs が存在しない、または容易に利用できない可能性があります。 または、番号と再生の可能性は、老化や病気の条件によって侵食される可能性があります。単一の転写コアクチベーターの式を報告することによって、このギャップを埋める開始、2016 年にヤップ (はい関連タンパク質) やその密接に関連蛋白質 TAZ (PDZ モチーフと転写活性化)、終末分化した細胞に効率的な運用および分子に対応する組織特異 SCs1から見分けがつかない機能、拡張可能な非発癌性、自家細胞集団を作成します。パルス持続ヤップまたは数日間 TAZ 活動体 SCs の自己更新の外観を誘導するために十分です。これは、さらに異所性のヤップ/タズ1の表現なし携帯世代を通じて送信することができますもはや連続的な発現に依存する安定した状態です。プロトコルは乳腺とこれらの組織の分化した細胞から膵臓のde novo上皮幹細胞/前駆細胞を生成するために使用プロシージャの詳細をここで紹介します。この手順は、現在のリプログラミング/分化転換アリーナでブラック ボックスを塗りつぶします。これらの方向の主な取り組みは細胞へ誘導多能性幹細胞 (iPSC) 状態に、これらの胚の変換を中心としたところ確かとに多能性 SCs より分化した細胞。ただし、Ips、発癌性一度成体の完全かつ効率的な分化2プロトコルの開発の必要性を高める導入します。しかし、この分化ステップ可能な場合でもは長期的な拡張性、自己組織化と器官再作成電位の価格で来る。これらは、内因性の組織固有の SCs のみと現在記述されていたヤップ誘起 SCs (ySCs) の代表的な事実に、臓器再生のための必須の属性です。同様に、様々 な転写因子を生成もカクテルを使用して別に 1 つのセル型の直接分化転換は不可欠の潜在的な3増殖と幹細胞性を欠いているセルを区別されます。
ここで説明する手順はまた内因性 SCs が拡大することができ、分化前のヴィヴォ4最近導入された organoid 技術を活用します。ヤップ誘起 SCs は、内因性の SCs が存在しない実験、生物や病気の条件でも organoid 形成 SCs を生成するかもしれません。他の初期化の手順の違いでヤップによって与えられる細胞の可塑性の種類が生体組織に発生する SC のような状態に復帰の唯一の形式に対応していること、したいと思います。SC のような気質の買い戻しは組織の修復や発癌活性化5と関連付けられています。いくつかの成体組織の恒常性に不可欠なヤップや TAZ が再生、腫瘍の増殖培養1,6,7,8 体 SCs の拡大に必要不可欠、9,10、11,12

<table><tbody><tr><td>10 mL sterile syringes</td><td>Rays</td><td>10LC</td><td></td></tr><tr><td>100 mm&amp;nbsp; cell strainer</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 mL sterile conical tubes</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>24-well ultra low attachment plates</td><td>Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>40 mm cell strainers</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>48-well multiwell plates</td><td>Corning</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>50 mL sterile conical tubes</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>6-well multiwell plates</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, type I</td><td>Sigma</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D4902&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>1705-041</td><td></td></tr><tr><td>Disposable scalpels</td><td>Swann-Morton</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DnaseI</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>doxycycline hyclate</td><td>Sigma</td><td>D9891&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes (with strainer caps)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM)</td><td>BioLegend</td><td>118208</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>&amp;nbsp;#19780&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-EGFP</td><td>Addgene</td><td>&amp;nbsp;#84041</td><td>used as negative control</td></tr><tr><td>FUW-tetO-MCS</td><td>Addgene</td><td>&amp;nbsp;#84008</td><td>used as negative control</td></tr><tr><td>FUW-tetO-wtYAP</td><td>Addgene</td><td>&amp;nbsp;#84009</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-YAPS94A</td><td>Addgene</td><td>&amp;nbsp;#84010</td><td>used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant)</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>30721</td><td></td></tr><tr><td>heparin sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H3149&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer solution (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>human R-Spondin1 (His Tag)</td><td>Sino Biological</td><td>11083-H08H-5</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase from bovine testes</td><td>Sigma</td><td>H3506&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>K-14 antibody</td><td>Life Technologies</td><td>Ab7800&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>K-8 antibody</td><td>Life Technologies</td><td>Ab14053&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>&amp;nbsp;25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail)</td><td>BD Biosciences</td><td>51-9003632</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&amp;reg; Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T.Baker</td><td>0402</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>72340</td><td></td></tr><tr><td>non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish &amp;oslash; 94)</td><td>ROLL</td><td>18248</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Euroclone</td><td>ECM4004XL</td><td></td></tr><tr><td>PE Hamster Anti-Mouse CD61</td><td>BD Biosciences</td><td>553347</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f</td><td>BD Biosciences</td><td>551129</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rat Tail Collagen I (coating)</td><td>Sigma</td><td>122-20</td><td></td></tr><tr><td>Rat Tail Collagen I for 3D culture</td><td>Cultrex</td><td>3447-020-01&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>recombinant human FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>recombinant human Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>recombinant murine EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>recombinant murine FGF basic (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max)</td><td>Sigma</td><td>T6522&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris BASE&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05%</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth medium</td><td>Gibco</td><td>31220023</td><td></td></tr></tbody></table>

de novo generation of somatic stem cells by yap/taz

ここでプライマリの分化した細胞とターン ヤップ転写因子の発現による同じ系統の幹細胞/前駆細胞 (SCs) にそれらを分離するためのプロトコルを提案する.この方法では、マウス乳腺の管腔の分化 (LD) 細胞はターン完全に差別化された膵外分泌細胞膵臓にダクトのようなまたヤップは、乳腺 SCs の分子・機能特性を表わす細胞に変換されます。前駆細胞。同様に、内因性、自然の scs ヤップ誘起幹様細胞 (「ySCs」) 最終的にとして展開できること organoid 文化長期in vitro における異所性ヤップ/タズ、のさらなる必要性なし ySCs、遺伝性自己更新 SC のような状態に恵まれています。
ここに示すプログラムし直す手順を生成し、分化細胞から始まって様々 な組織の源の前駆細胞の in vitroを展開する可能性を提供しています。Ex vivo体細胞の単純な拡張は、細胞・発生生物学研究一般、腫瘍発生のメカニズムの理解より多くの再生医療のための含意を持ってください。

YMaSCs の生成 ヤップの発現による主な乳腺 LD 細胞を再プログラムする実験的戦略の概要については、図 1 aにされます。一次乳腺 LD の上皮細胞は13を並べ替え蛍光活性化細胞によって精製しました。図 1 bは、3 つの異なる集団を取得する典型的な並べ替えプロシージャを表します: 基底細胞 (EpCAM低CD49f高CD61-)、Luminal 前駆 (LP) のセル (EpCAM高CD49f低CD61+) と LD セル (EpCAM高CD49f低CD61-)。それが完全に区別される LD セルの純粋な調製を分離するために不可欠な 3 つの subpopulations のゲートは注意してくださいと成形条件 (参照図 1、左右パネル) 乳腺コロニーでシードするとき完全に成長が逮捕されました。逆に、外因性ヤップを表現する誘導、LD セルは 5% 基底膜マトリックス培養 (図 1) で簡単に認識できる密な上皮コロニーを形成する増殖を開始します。リプログラミング、効率は、約 3% の一般的な実験、単一細胞基底膜マトリックス培養 (図 1) でもともとシード数コロニー数をカウントすることによって獲得することができますを証明しました。プログラムし直された管腔細胞 (yMaSCs) 100% 基底膜マトリックスにおける培養条件 (図 1 aのスキームを参照してください)、複数ルーメン周辺開発複雑な器官毛細状構造に自己組織化への通路をすることができますし、ドキシサイクリン (すなわち遺伝子組換えヤップ発現の不在で) の不在でも驚くべき自己複製能力を表示 (図 1E)。病理 yMaSC 派生 organoids 表示基底層 (K14 正)、ECM と organoid (図 1 階) 内ルーメンのような空洞を直面している腔層 (K8 の肯定的な)、再構成した基底膜マトリックスに直面しています。このアーキテクチャは、ネイティブ MaSCs (図 1 f) によって形成されたオルガノイドの区別ではありません。
YDucts の生成 図 2 aで、ヤップの発現による主膵腺を再プログラムする実験的戦略を説明はします。全体の腺房のクラスターは、軽度の解離とろ過によりサイズ排除の組み合わせによる膵組織の大部分から分離されます。一般的な準備は、図 2 bに提示されます。分離、内分泌膵や膵管ツリーと単一のセルに最小限の解離フラグメントによって汚染なしとの均一なサイズの外分泌腺の腺房単位の懸濁液として腺房細胞のクラスターが表示されます。膵や膵管の破片による汚染は欠乏フィルタ (ステップ 2.1.10) 過酷な取り扱いのための徴候単一のセルに腺房のクラスターの不要な解離過度コラゲナーゼ処理またはバッファリングされていないアクティビティ追加 SBTI 治療によって抑制することができます組織が発表したタンパク質分解酵素の可能性があります。
図 2; の典型的な腺房リプログラミング実験を提示します。3 D コラーゲンの文化の 5-7 日以内-私はドキシサイクリンの存在下でゲルに基づく、容易にR26 rtTAM2/重音テト ヤップS127Aマウス由来膵腺管のようなクラスターに薄い撰 (我々 というyDucts)、拡大中央キャビティ中で増殖する上皮細胞の単層。典型的な実験のための 70% 程度である、リプログラミング効率は、シード房 (図 2 D) の合計数以上のダクトのようなクラスター数の得点を簡単に測定できます。陰性対照細胞、つまりR26 rtTAM2/+細胞またはR26 rtTAM2/重音テト ヤップS127Aセル左ドキシサイクリン、なし常として残っているされませんこれら文化の条件で以前に報告される1 ポスト mitotic の腺房クラスター ,14,15。プログラムし直された yDucts、マトリゲル ベース organoid 文化条件16に単一セルのレベルで継代するにすることができます (図 2 aのスキームを参照)、(すなわちドキシサイクリンの不在でも驚くべき自己複製能力を表示します。遺伝子組換えのヤップ発現の不在) で (図 2 e)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> 図 1:主な乳腺 LD の単離細胞や乳腺の誘導は幹細胞です。(A)実験手順の概略を採用し、主な乳腺 LD セルをプログラムし直します。(B)代表 FACS プロット典型的な並べ替えプロシージャを示す LD セルを浄化します。i) 解離細胞は生きているセル (P1; 青) の前方および側面の散布によるとゲートします。ii) 人口 P1 は、さらにその林のプロフィールによるとゲート、: リネージュ陰性細胞 (P2; 灰色) の個体を選択すると、系列陽性造血細胞を除くiii) 人口 P2 と分かれています、EpCAM高(P3; 黄色 + 緑) EpCAM、低(P6; 赤) の集団。iv) P3 と P6 は、さらにゲート、CD61/CD49f のプロフィールによると 3 つの集団に: EpCAM低CD49f高CD61-基底細胞 (P7; 赤)、EpCAM高CD49f低CD61+ LP 細胞 (P8; 黄色)EpCAM高CD49f低CD61 と- LD セル (P9; 緑)。(C)画像が乳腺のコロニー中播種後 15 日乳腺のコロニーを形成する示された構造感染 LD 細胞の能力の説明されます。コロニー形成にヤップを表現する細胞ターン細胞、陰性対照細胞 (EGFP 感染) に対しのまま成長阻止された単一のセル。スケールバー = 50 μ m。(D) (C) のように、示された細胞の能力を形作っているコロニーの定量化。データ平均 + 標準偏差で、それぞれ六つの技術的な複製を持つ 5 つの独立した実験の代表であります。(E)ヤップ書き換え乳腺幹細胞様の細胞 (yMaSCs) ドキシサイクリンの不在での三次元 100% 基底膜マトリックス ハイドロゲルは新鮮な内における培養条件に 12 日後の代表的なイメージ。スケールバー = 100 μ m。(F)代表的な蛍光 K14 (緑) の基底のマーカーと K8 の内腔のマーカー (赤) オルガノイドから派生するイメージ示された細胞における培養条件に 12 日後。スケール バー = 10 μ m。この図は予想et al., 20161から再現します。<a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> 図 2: プライマリ膵腺房細胞, 膵前駆細胞の誘導の分離。(A)実験手順の概略を採用し、主な膵外分泌細胞をプログラムし直します。(B)分離手順 (ステップ 2.1.14) 直後後主膵腺の代表的なイメージ。腺房の準備は、単一のセルの最小の存在と腺房のクラスターの均一な懸濁液として表示されます。スケール バー = 400 μ m。(C)主膵腺管構造の代表的なイメージはR26 rtTAM2 (上部パネル) から派生したまたは R26 rtTAM2; 重音テト ヤップS127A (下方のパネル) マウス 3 D コラーゲン培養私と -ハイドロゲルを用いた 5 日間の有無ドキシサイクリン (愛人)、示される。のみプライマリ腺のヤップ表現はドキシサイクリン添加後嚢胞のような器官毛細として育つセルに変換します。スケール バー = 70 μ m。(D) (C) のように遺伝子組み換えのヤップ発現時に管オルガノイドを形成する膵臓腺の能力の定量化。データ平均 + 標準偏差で、4 つの技術的なレプリケートを実行、5 つの独立した実験の代表であります。(E)ドキシサイクリンの不在での三次元 100% 基底膜マトリックス ハイドロゲルは新鮮な 3 通路後ヤップ reprogramed 管のような細胞 (yDucts) の代表的なイメージ。スケール バー = 130 μ m。<a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">主な乳腺細胞の分離</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ca2 +キレート ソリューション</td>
			<td>4 ° C でのストア</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0.02 w/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">コラーゲン コート液私</td>
		</tr>
<tr>
<td>酢酸 0.02N、pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ラット尾コラーゲン (コーティング)</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>当期のソリューション</td>
			<td>4 ° C でのストア</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>解離中</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ヒアルロニダーゼ原液</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>原液コラゲナーゼ私</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>溶血性ソリューション</td>
			<td>4 ° C でのストア</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl ソリューション</td>
			<td>1 パーツ</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20.6 グラム/L の</td>
			<td>9 パーツ</td>
		</tr>
<tr>
<td>7.2 pH を調整します。</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>4 ° C でのストア</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヒアルロニダーゼ原液</td>
			<td>0.2 μ m のフィルターは、4 ° C で保存</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヒアルロニダーゼ ウシ精巣 (粉末)</td>
			<td>2,000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ナトリウム リン酸バッファー 1 M pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl ソリューション</td>
			<td>T. amb を格納します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7.1 グラム/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>7.65 に pH を合わせなさい</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>並べ替えのソリューション</td>
			<td>0.2 μ m のフィルターは、4 ° C で保存</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES pH 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>洗浄媒体 #1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>洗浄中 #2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>政府短期証券</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>乳腺の 2次元培養培地</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>政府短期証券</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘパリン</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-グルタミン</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>マウス bFGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>マウス EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">誘導と yMaSCs の継</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">乳腺のコロニー中</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>政府短期証券</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘパリン</td>
			<td>4 μ G/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-グルタミン</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>マトリゲル (播種する前にすぐに追加)</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>マウス bFGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>マウス EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">乳腺における媒体</td>
		</tr>
<tr>
<td>高度な DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘパリン</td>
			<td>4 μ G/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>人間の頭</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>マウス bEGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>マウス EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R Spondin 1</td>
			<td>1 μ G/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: yMaSCs の生成します。すべての異なる文化メディアと一次乳腺 LD 細胞の分離と yMaSCs (セクション 1) の誘導に必要なソリューションの構成
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">主な膵腺管構造の分離</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">腺房の培</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 μ G/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>デキサメタゾン</td>
			<td>1 μ G/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>政府短期証券</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>その X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Waymouth の媒体</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">腺房洗浄中</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>RPMI 培地</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">腺房のリカバリ媒体</td>
		</tr>
<tr>
<td>腺房の培</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>政府短期証券</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">コラゲナーゼ私溶液</td>
		</tr>
<tr>
<td>腺房洗浄中</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>原液コラゲナーゼ私</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>4 ° C でのストア</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (リン酸緩衝生理食塩水)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>原液コラゲナーゼ私</td>
			<td>-20 ° C でストア</td>
		</tr>
<tr>
<td>コラゲナーゼ、型私 (粉末)</td>
			<td>6,000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">膵オルガノイドの継</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">コラゲナーゼ私ソリューション B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>原液コラゲナーゼ私</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">膵臓における媒体</td>
		</tr>
<tr>
<td>高度な DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>ガストリン</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>人間 FGF10</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>人間の頭</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>マウス EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-アセチルシステイン</td>
			<td>1.25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>ニコチン酸アミド</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペン/連鎖球菌</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: yDucts の生成します。すべての異なる文化メディアとプライマリ腺房細胞の誘導分離および yDucts (セクション 2) の通過に必要なソリューションの構成

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De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

体 SCs の可用性は再生医療の重要な疾患モデル作製と SC プロパティへの洞察力を得るために。再プログラムする実験的戦略の紹介、体外が単一の転写コアクチベーター ヤップの一過性の発現によって彼らの対応する拡張幹/前駆細胞の細胞に成体細胞を区別します。

・ デ ・ ノボヤップ/タズによる体細胞の幹細胞の生成

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

de-novo-generation-of-somatic-stem-cells-by-yaptaz

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

9.0K ビュー.  University of Padua School of Medicine. 体 SCs の可用性は再生医療の重要な疾患モデル作製と SC プロパティへの洞察力を得るために。再プログラムする実験的戦略の紹介、体外が単一の転写コアクチベーター ヤップの一過性の発現によって彼らの対応する拡張幹/前駆細胞の細胞に成体細胞を区別します。

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Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

発生生物学

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and organs. The O9-1 cell line is derived from the endogenous mouse embryonic NCCs and maintains its multipotency. However, under specific culture conditions, O9-1 cells can differentiate into different cell types and be utilized in a wide range of research applications. Recently, with the combination of mouse studies and O9-1 cell studies, we have shown that the Hippo signaling pathway effectors Yap and Taz play important roles in neural crest-derived craniofacial development. Although the culturing process for O9-1 cells is more complicated than that used for other cell lines, the O9-1 cell line is a powerful model for investigating NCCs in vitro. Here, we present a protocol for culturing the O9-1 cell line to maintain its stemness, as well as protocols for differentiating O9-1 cells into different cell types, such as smooth muscle cells and osteoblasts. In addition, protocols are described for performing gene loss-of-function studies in O9-1 cells by using CRISPR-Cas9 deletion and small interfering RNA-mediated knockdown.

O9-1 is a multipotent mouse neural crest cell line. Here we describe detailed step-by-step protocols for culturing O9-1 cells, differentiating O9-1 cells into specific cell types, and genetically manipulating O9-1 cells by using siRNA-mediated knockdown or CRISPR-Cas9 genome editing.

養殖と O9 1 神経堤細胞の操作

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

遺伝学

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., 2007; Okita, et al., 2007; Maherali, et al., 2007). We have devised a reprogramming strategy in which these four transcription factors are expressed from doxycycline (dox)-inducible lentiviral vectors (Brambrink et al., 2008). Using these inducible constructs, we can derive induced pluripotent stem (iPS) cells from mouse embryonic fibroblasts (MEFs). In this video, we demonstrate the procedure for the generation of inducible lentiviruses that express the four transcription factors and show how to infect MEFs with these viruses in order to produce iPS cells. By using inducible lentiviruses, the expression of the four factors in controlled by the addition of doxycyline to the culture medium. The advantage of this system over the traditional retroviral infection is the ability to turn the genes on and off so that the kinetics of reprogramming and gene expression requirements can be analyzed in detail.

This video shows the procedure for generating induced pluripotent stem cells using inducible lentivirus that express Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4.

ソックス- 2の強制発現によってMEFSからiPS細胞を生成し、OCT - 4、c - Mycの、とKLF4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006;  Wernig, et al., ...

生物学

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent epiblast cells by orchestrated exposures to cytokines, including bone morphogenetic protein 4 (Bmp4). In human embryos, the earliest PGCs have been identified on the endodermal wall of yolk sac around the end of the 3rd week of gestation, but little is known about the process of human PGC specification and their early development. To circumvent the technical and ethical barriers of studying human embryonic PGCs, surrogate cell culture models have been recently generated from pluripotent stem cells. Here, we describe a 13-day protocol for robust production of human PGC-Like Cells (hPGCLCs). Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) maintained in the primed pluripotency state are incubated in the 4i na&#239;ve reprogramming medium for 48 hours, dissociated to single cells, and packed into microwells. Prolonged maintenance of hiPSCs in the na&#239;ve pluripotency state causes significant chromosomal aberrations and should be avoided. hiPSCs in the microwells are maintained for an additional 24 hours in the 4i medium to form embryoid bodies (EBs), which are then cultured in low-adherence plasticware under a rocking condition in the hPGCLC induction medium containing a high concentration of recombinant human BMP4. EBs are further cultured for up to 8 days in the rocking, non-adherent condition to obtain maximum yields of hPGCLCs. By immunohistochemistry, hPGCLCs are readily detected as cells strongly expressing OCT4 in almost all EBs exclusively on their surface. When EBs are enzymatically dissociated and subjected to FACS enrichment, hPGCLCs can be collected as CD38+ cells with up to 40-45% yield.

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of both sperm and eggs. Human embryonic PGCs are specified from pluripotent epiblast cells through interactions of cytokines. Here, we describe a 13-day protocol of inducing human cells transcriptomally resembling PGCs at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells.

プライミング多能性胚様体の表面で人間の始原生殖細胞のような細胞の生成誘導多能性幹細胞

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

StemgentヒトTFのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

神経科学

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

山中因子の過剰発現によって多能性の成体体細胞のin vivoでの再プログラミング中

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

iPS細胞由来iTenocytesによる効果的な細胞治療への活用

Generation of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived iTenocytes via Combined Scleraxis Overexpression and 2D Uniaxial Tension

Today&#39;s challenges in tendon and ligament repair necessitate the identification of a suitable and effective candidate for cell-based therapy to promote tendon regeneration. Mesenchymal stromal cells (MSCs) have been explored as a potential tissue engineering strategy for tendon repair. While they are multipotent and have regenerative potential in vivo, they are limited in their self-renewal capacity and exhibit phenotypic heterogeneity. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can circumvent these limitations due to their high self-renewal capacity and unparalleled developmental plasticity. In tenocyte development, Scleraxis (Scx) is a crucial direct molecular regulator of tendon differentiation. Additionally, mechanoregulation has been shown to be a central element guiding embryonic tendon development and healing. As such, we have developed a protocol to encapsulate the synergistic effect of biological and mechanical stimulation that may be essential for generating tenocytes. iPSCs were induced to become mesenchymal stromal cells (iMSCs) and were characterized with classic mesenchymal stromal cell markers via flow cytometry. Next, using a lentiviral vector, the iMSCs were transduced to stably overexpress SCX (iMSCSCX+). These iMSCSCX+ cells can be further matured into iTenocytes via uniaxial tensile loading using a 2D bioreactor. The resulting cells were characterized by observing the upregulation of early and late tendon markers, as well as collagen deposition. This method of generating iTenocytes can be used to assist researchers in developing a potentially unlimited off-the-shelf allogeneic cell source for tendon cell therapy applications.

著者スポットライト:腱修復のための細胞および組織工学の進歩 

This article describes a procedure to produce iTenocytes by generating iPSC-derived mesenchymal stromal cells with combined overexpression of Scleraxis using a lentiviral vector and uniaxial stretching via a 2D bioreactor.

強膜過剰発現と2D一軸張力 の組み合わせによる 人工多能性幹細胞由来iTenocytesの生成

Today&#39;s challenges in tendon and ligament repair necessitate the identification of a suitable and effective candidate for cell-based therapy to ...

・デ・ノボヤップ/タズによる体細胞の幹細胞の生成

要約

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非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

養殖と O9 1 神経堤細胞の操作

ソックス- 2の強制発現によってMEFSからiPS細胞を生成し、OCT - 4、c - Mycの、とKLF4

プライミング多能性胚様体の表面で人間の始原生殖細胞のような細胞の生成誘導多能性幹細胞

StemgentヒトTFのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

山中因子の過剰発現によって多能性の成体体細胞のin vivoでの再プログラミング中

強膜過剰発現と2D一軸張力の組み合わせによる人工多能性幹細胞由来iTenocytesの生成

強膜過剰発現と2D一軸張力の組み合わせによる人工多能性幹細胞由来iTenocytesの生成

・ デ ・ ノボヤップ/タズによる体細胞の幹細胞の生成

要約

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非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

養殖と O9 1 神経堤細胞の操作

ソックス- 2の強制発現によってMEFSからiPS細胞を生成し、OCT - 4、c - Mycの、とKLF4

プライミング多能性胚様体の表面で人間の始原生殖細胞のような細胞の生成誘導多能性幹細胞

StemgentヒトTFのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

山中因子の過剰発現によって多能性の成体体細胞のin vivoでの再プログラミング中

強膜過剰発現と2D一軸張力 の組み合わせによる 人工多能性幹細胞由来iTenocytesの生成

強膜過剰発現と2D一軸張力 の組み合わせによる 人工多能性幹細胞由来iTenocytesの生成

・デ・ノボヤップ/タズによる体細胞の幹細胞の生成

強膜過剰発現と2D一軸張力の組み合わせによる人工多能性幹細胞由来iTenocytesの生成

強膜過剰発現と2D一軸張力の組み合わせによる人工多能性幹細胞由来iTenocytesの生成