この仕事のための資金は、国立科学財団大学院研究フェローシップ ・ プログラム、サン ディエゴ大学 NIH R01-HG007836 を与えると科学、ICT および将来計画の韓国大臣によって。
以前のバージョンのいくつかの数字が"・ ザ ・ フープル、g. d.らで出版された最初ゲル-seq: 全ゲノムとトランスクリプトーム シーケンスによる半透性ハイドロゲル障壁を用いた同時低入力 DNA および RNA 図書館準備によって。ラボオン チップ 17、2619-2630 doi:10.1039/c7lc00430c (2017)."ラボオン チップは、このパブリケーション内の図の再利用を認可しています。

<ol>
	<li>Mawy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing.">Single-cell sequencing.</a> Nat Methods. 11 (1), 18 (2014).</li><li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells.">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nat Biotech. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li><li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz-Seq:+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA-Seq+reveals+non-genetic+gene+expression+heterogeneity.">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA-Seq reveals non-genetic gene expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14 (4), 31 (2013).</li><li>Ramsk&#246;ld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells.">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).</li><li>Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing-based+technologies+will+revolutionize+whole-organism+science.">Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science.</a> Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).</li><li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing.">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li><li>Hoople, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-seq:+whole-genome+and+transcriptome+sequencing+by+simultaneous+low-input+DNA+and+RNA+library+preparation+using+semi-permeable+hydrogel+barriers.">Gel-seq: whole-genome and transcriptome sequencing by simultaneous low-input DNA and RNA library preparation using semi-permeable hydrogel barriers.</a> Lab Chip. 17, 2619-2630 (2017).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&amp;T-seq:+parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes.">G&amp;T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nat Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li><li>Dey, S. S., Kester, L., Spanjaard, B., Bienko, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genome+and+transcriptome+sequencing+of+the+same+cell.">Integrated genome and transcriptome sequencing of the same cell.</a> Nat Biotechnol. 33 (3), 285-289 (2015).</li><li>Gopal, A., Zhou, Z. H., Knobler, C. M., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+large+RNA+molecules+in+solution.">Visualizing large RNA molecules in solution.</a> RNA. 18 (2), 284-299 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-PAGE+Gel.">SDS-PAGE Gel.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), 087908 (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Qubit 3.0 Fluorometer Manual. MAN0010866. Life Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pd">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pd</a> (2017)</li><li>Vitak, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+thousands+of+single-cell+genomes+with+combinatorial+indexing.">Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing.</a> Nat Methods. 14 (3), 302-308 (2017).</li><li>Illumina. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nextera &#174; XT DNA Library Preparation Kit. , (2017).</li><li>Takara Bio USA Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing User Manual. , (2016).</li><li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis.">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nat Protoc. 2 (3), 739-752 (2007).</li></ol>

カザフスタンは、共同創設者兼 Singlera ジェノミクス社の科学アドバイザー

ゲル seq デバイス作製とプロトコル自体に関連付けられているいくつかの重要な手順があります。製作中にゲルの様々 な地域の所定の層の厚さで始まるをお勧めします。異なる製造オプションをテスト時間を大幅を過ごし、ここで説明したプロトコル [テーブルの材料および試薬カセットの最高のデバイスが生成されます。研究者は、代替カセット システムを使用している場合、デバイスを作成するときに使用されるボリュームを微調整するために必要な彼らがあります。作製での大きな課題は、高密度のゲル化領域が大きすぎて、カセットの端から剥離して電気泳動を妨げるカセットの内部の空気のポケットを作成する場合。冊別のレイヤーにいくつかのカセットをキャストすることによって研究者は、独自のハードウェアの最適構成をすばやく判断できる必要があります。
ゲル seq プロトコル プロトコルを完了する前に検証することができますいくつかの重要な手順があります。1 つの潜在的な障害ポイントは、gDNA RNA/cDNA の分離です。これは分離後ゲル seq デバイスをイメージングによって検証できます (図 3Bを参照)。1 つの一連の実験では、バッファーの私達の実験室の供給と DNA が汚れていたし、我々 のデバイスで実質的な autoflourescence を引き起こしていたことがわかった (図 3D参照)。これは、分離が起こったかどうかを決定することは困難です。蛍光イメージングを識別し、シーケンス ライブラリを生成する任意の高価な試薬を使用する前にこの問題を解決することができました。
もう一つの重要なポイントは、ステップ 6.2, 分離後の cDNA の qPCR の増幅です。研究者は、RNA シーケンス データの質を減らすので、この手順で overamplify しないように細心の注意を払う必要があります。この考察はゲル seq に一意ではありませんが、低入力 RNA シーケンス ライブラリ準備の一般的な側面です。ライブラリの準備をシーケンス処理中に PCR 増幅が必要です, 多くの場合が、それはシーケンス エラーとバイアスを導入することができます。必要な PCR のサイクル数は、サンプル量と複雑さによって異なります。それは一般的にライブラリがシーケンス処理されると、十分なクラスターを生成するために必要な最低限に PCR のサイクル数を制限することをお勧めします。理論的には、過剰なアーチファクトを導入せず十分なコピーの数を生成する正確なサイクル数を決定するプロトコルを最適化できます。実習では、ただし、サンプル品質の矛盾ロード、またはプロトコルの早い段階で処理が劇的に影響 PCR に最適な PCR のサイクル数に影響を与えるライブラリの準備のため使用可能な分子テンプレートの配布。リアルタイム PCR たちの反応を実行我々 は蛍光色素を用いた増幅反応の進行状況を監視する発見した最も一般的なソリューションとの指数 (サイクル数と線形) の反応を停止相。私たちの経験、リアルタイム監視の開発、適応、または新しいプロトコルを採用するときに特に関連するですが。
最後の重要なステップが生成してゲノムおよびトランスクリプトーム ライブラリ。このステップへの鍵は、できるだけ 0.2 ng/μ L (0.5 ng 合計) に近い DNA ライブラリの準備反応の開始サンプル濃度を設定します。通常、cDNA の過剰があるが、gDNA サンプルが困難ことができます qPCR 増幅 cDNA の比較的簡単です。注意 vacufuge 手順に注意は必要なサンプルが集中していたことがわかった。Vacufuge ステップが多く停止することができる 1000 細胞を用いた実験で、期待どおりに 100 の実験よりも早く細胞します。Vacufuge のサンプルの数は、我々 の実験蒸発速度も影響します。不慣れなサンプルとプロトコルを実行するときは、濃度ステップの途中を役立つことができるコンテンツ、flourometer を使用して DNA を検証することがわかった。幸いなことに、水のサンプル、ヌクレアーゼ フリーの集中の上研究者場合は、サンプルを希釈に追加します。理論的には、それは DNA を乾燥させると、希望の音量で再懸濁します、vacufuge を使用することが可能ただし、完全な蒸発を避けることをお勧めします。
我々 は博士 seq9、無料として、G & T seq8、ゲル seq7同時 DNA および RNA のライブラリを生成するための 3 つの現在の方法を表示します。ゲル seq、100-1000 セル範囲のサンプルに最適プルダウン ・ ターゲットやゲノムの事前知識は必要ありません。他の 2 つの方法単一電池への応用に適しています。ゲル seq の開発の目的の 1 つは、他の研究者によって簡単に実装可能なプロトコルを作ることでした。したがって、内ポリアクリルアミドゲル カセット テープの標準的なフォームファクターのデバイスを作製することを決めた。私たちは私たちの異なる膜の定義に使用法は小説、ほとんど遺伝学研究所既にゲル seq デバイスを製造するためのすべての必要な機器。さらに、デバイスのコストは簡単です - ちょうど $5.25 12 個の試料を処理することができますデバイスの。つまり、他ライブラリの準備のプロトコルと市販試薬を使用してライブラリを生成するための全体的なコストは高いままです。サンプルあたり試薬コストは全体転写増幅の $50 と $28 DNA と RNA の両方のライブラリの準備のためでした。幸いにも、ゲル seq デバイス自体は、プロトコルに依存しないです。たとえば、開発中に我々 正常にテスト文化から、古い RNA ライブラリ増幅プロトコル19セルを使用して、デバイスがマウスから組織サンプルに適してなかったとわかった。ライブラリの準備のための安価な代替案を開発する、未来に向かっている、我々 のプロトコルは、これらの新しい技術で動作するようになります。研究者は、それが彼ら独自のラボでゲル seq を実装するは簡単でしょうと考えています。これは、技術の急速な普及を促進すると思います。

次世代シークエンシング (NGS) は、遺伝学研究方法の深遠な影響を与えています。ここでの研究者は、一度全体の種のゲノムに焦点を当てて、今単一の腫瘍または 1 つの実験でも単一セルのゲノムを配列することが可能です。1 NGS もしました、トランスクリプトームと呼ばれるデータのコレクションのセル内にある RNA 転写産物をシーケンス処理する費用対効果。増幅し、小さい開始サンプルから DNA または RNA をシーケンスする能力は、過去 5 年間で達成されているのみ。2,3,4は残念ながら、標準のプロトコルに互換性がないと研究者はある特定のサンプルの DNA または RNA をシーケンス処理するかどうかを選択する必要があります。開始サンプルが十分に大きい場合は、半分に分割することができます。ただし、規模が小さいサンプルの分裂のための材料の損失はライブラリの品質に影響を与えるし、細胞間の興味深いバリエーションを平均することができますサンプルのプールします。5さらに、研究者は単一のセルまたは小さな異種腫瘍生検などを分割できないサンプルを調べることに興味を持つ。6
この問題を解決する 3 つのプロトコルが最近開発された同じ開始サンプルから DNA と RNA の両方をシーケンス処理する: ゲル seq7、G & T seq8、および DR seq9。この記事は、ゲル-seq、同時にごくわずかな追加コストで 100 細胞から DNA および RNA のライブラリを生成するための詳細なプロトコルを示します。ゲル seq の小説の側面は、DNA と RNA 低コスト ハイドロゲル行列を使用して大きさだけに基づいて区別する能力です。ゲル Seq プロトコルのコア技術革新は RNA から DNA を物理的に分離します。この分離は、電気泳動によってこれらの分子のサイズ違いの活用のポリアクリルアミドの膜の組み合わせを使用して実現されます。コンテキストでこれらのサイズ違いを置く、DNA と RNA をイメージする方法を検討してください: RNA ナノメートル スケール上に存在し、低温電子などの複雑な技術を使用してイメージを作成する必要があります DNA ミクロン スケール上に存在する、伝統的な顕微鏡を使用して表示することができますが、顕微鏡検査。10
このプロトコルでは DNA と RNA を分離するアプローチは、図 1に示します。左側のパネルは、DNA および RNA の無料ソリューション膜近くに浮かんでいるを示しています。電気フィールドを適用すると、右側のパネルに示すように、DNA および RNA は膜を介して移行を誘導する電気泳動の力を体験します。膜特性を調整することにより、RNA から DNA を分離する半透膜を作成しました。DNA 分子は膜に対して押されるが、サイズが大きいので端につれ。その一方で、小さな RNA 分子を再構成し、できます膜を通して彼らの方法を織る。レプテーション、として知られているこのプロセスはヘビが草を介して移動する方法に似ています。さらに小さいポリマー難しすぎて第二に、高密度の膜によってこれらの RNA 分子を停止する最終的に (> 200 塩基対) をくねらせるため。一度物理的に分離、DNA および RNA 回収し、処理できるゲノムとトランスクリプトームの両方に関する情報を生成します。我々 は DNA と RNA を区切ることができます、我々 は分離前に cDNA に転写される RNA が逆の場合より良い結果が得られますを発見しました。CDNA/RNA 雑種は単独で RNA より安定して、低密度の膜を通して渡すことができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig1.jpg"> 図 1.ゲル seq 動作原理。物理的に DNA と RNA を分離するために使用する基本原理。応用電界で小さな RNA 分子が低密度の膜を通って移行しますが、大きい DNA の分子が表面に閉じ込められています。この図は、王立化学協会の許可を得て参考文献 7 から再現しました。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57315/57315fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
本稿で詳細にゲル seq デバイス作製を生成する生物学的プロトコル ペアに DNA および RNA のライブラリ。両方の概要を図 2に示します。レイヤー 3 つ異なる密度ポリアクリルアミドゲルで互いの上に標準的なスタッキングのゲルを作成する同じプロセスでデバイスを作製しました。11生物学的プロトコルから始まる 100-1000 細胞を PBS で中断します。細胞を分離、cDNA/RNA 雑種からゲノム DNA を分離するデバイスを使用する前に、RNA が cDNA に変換されます。後分離と回復、ゲノム、トランスクリプトーム ライブラリは、標準の全ゲノム ライブラリの準備キットのプロトコルに密着したプロセスを使用して準備されます。チップ用の文書でラボでの開発とゲル seq の検証についてさらに詳細を読むことができます"ゲル seq: 全ゲノムとトランスクリプトーム シーケンス半透性ハイドロゲル障壁を用いた同時低入力 DNA および RNA 図書館準備で."7 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig2.jpg"> 図 2.ゲル seq プロトコル。ゲル seq デバイスおよびプロトコルを生成するための手順の概要については、DNA および RNA のライブラリ ペア。この図の部分は、王立化学協会の許可を得て参考文献 7 から再現されました。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57315/57315fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
単一セルからの DNA および RNA のライブラリを生成するため、研究者は G & T seq や DR seq. G 
DR seq は DNA や RNA からの cDNA の両方が同じ管で増幅される中古増幅ステップに依存します。サンプルが 2 つに分割し、DNA と RNA シーケンス ライブラリを準備する並列で処理します。ゲノム DNA と RNA からの cDNA の区別は、DR seq は計算のアプローチを取る。エクソンのみが存在するシーケンスは、それらは DNA や RNA から由来している可能性がありますと計算ゲノム DNA データの抑制されます。9このアプローチの利点は、DNA と cDNA/RNA 区切る必要はありません物理的にゲル seq と G & T seq. で行われるように欠点は、ただしは、DR seq のゲノムとトランスクリプトーム (すなわちイントロンとエクソン)、事前知識を必要とし、多くの転写産物がないまだ完全に核のシーケンスなどのアプリケーションに最適なできない可能性があります。スプライシング ・ イントロンが含まれています。12
ゲル seq の小説の側面は、DNA と RNA のサイズのみに基づいてセルの数百を分離する能力です。このメソッドには、ゲノム、トランスクリプトームの先験的知識は不完全な接続に対してロバストとポリ adenylated の成績証明書に限定されていませんが必要です。研究者が少なくとも 100 セルから始まる、アプリケーション、ゲル seq は安く、広く利用可能な材料を使用して簡単な方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Reagents&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide Monomer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads</td></tr><tr><td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0611</td><td>Referred to in the text as 6X loading dye</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits</td><td>Kapa BioSystems</td><td>7959613001</td><td>Referred to in the text as 2X qPCR mix</td></tr><tr><td>N,N&amp;prime;-Methylenebis(acrylamide)&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>146072-100G</td><td>Also known as bis-acrylamide</td></tr><tr><td>NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)</td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>Millipore</td><td>3098</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit)</td><td>Takara/Clontech</td><td>634888</td><td>Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3&amp;rsquo; SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)</td></tr><tr><td>Random hexamer with WTA adapter&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td>5&amp;prime;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>DNA AWAY Surface Decontaminant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7010PK&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Referred to in the text as DNA removal product</td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4415-1L</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11494</td><td>Referred to in the text as gel stain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Equipment&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide&amp;nbsp;syringe needles, gauge 18</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192554</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Branson CPX series ultrasonic bath</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z769363</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2010</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Mesh Filter Plate - Corning&amp;nbsp;HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 &amp;micro;m pore size</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3374</td><td>Referred to in the text as 8 um mesh filter plate</td></tr><tr><td>PowerPac HC Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Vacufuge Concentrator</td><td>Eppendorf</td><td>22822993</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell system</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195&amp;nbsp;</td><td>Any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>UVC500-115V</td><td>Discontinued, any equivalent hardware is acceptable</td></tr><tr><td>Gel Doc XR+ Gel Documentation System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>Referred to in the text as gel imager</td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR89</td><td>Referred to in the text as UV transilluminator</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ultrasonic&amp;nbsp;Bath</td><td>Bransonic</td><td>1207K35</td><td>Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.</td></tr></tbody></table>

gel-seq: a method for simultaneous sequencing library preparation of dna and rna using hydrogel matrices

増幅し、小さい開始サンプルから DNA または RNA をシーケンスする能力は、過去 5 年間で達成されているのみ。残念なことに、ゲノムの生成やトランスクリプトーム ライブラリの標準的なプロトコルに互換性がないと、研究者は特定のサンプルの DNA または RNA をシーケンスするかどうかを選択する必要があります。ゲル seq DNA と単純なハイドロゲル デバイスを用いた 100-1000 細胞から始まる RNA の両方のライブラリを同時に準備する研究者を有効にしてこの問題を解決します。対ライブラリを生成する生物のプロトコルと同様に、デバイス作製のための詳細なアプローチを提案する.他の研究者によって簡単に実装できるようにゲル seq を設計多くの遺伝学研究所はすでにゲル seq デバイス作製を再現する必要な機器を持っています。私達のプロトコルは両方全体転写増幅 (WTA) のための一般的に使用されるキットを採用しています、ライブラリ生成ゲノムおよびトランスクリプトームに精通したライブラリの準備は、既に研究者に精通していることも多い。我々 のアプローチでは、ごくわずかな追加コストと分割せず単一サンプル、DNA と RNA の両方のシーケンスの力をもたらすために研究者をことができます。

蛍光イメージング; 的ゲル seq デバイス/RNA の cDNA と gDNA 雑種の物理的な分離に視覚化できます。代表的な結果を図 3に示します。パネルを示しますゲル seq 素子を試作偽色が異なるゲル領域を区別するために追加されました。パネル B を検証に使用される 4 つの異なる分離のクローズ アップ表示します。第 3 レーン、ネガティブ コントロールは、背景を表し、界面ゲルの autoflourescence がないことを示しています。我々 は DNA の梯子の最初と 2 番目のレーンを読み込まれます。これらの車線は低高密度膜間、明らかに小さい片は低密度のゲルが通過できるインターフェイスで暗いバンドのみを表示します。第 4 レーンが興味の生物的サンプルの動作を示しています: 500 PC3 細胞。プロトコルの手順 3 で説明した 4 つの車線を読み込みます。画像は、ゲノム DNA と cDNA/RNA 雑種の分離を示しています。低密度の膜の上部に暗いバンドは megabase スケール ゲノム DNA cDNA/RNA ハイブリッド車は、低・高密度領域のインターフェイスに積層されています。はしごを搭載の車線とは異なり、ゲルの高密度領域内に存在複数のバンドもあります。これらのフラグメントは、100 より小さい bp、オフのターゲット製品はオリゴヌクレオチドのプライマーから逆のトランスクリプションの間に生成されます。パネル C は、成功した実験から全体のゲル seq デバイスの代表的なイメージを示しています。レーン標識 RNA/cDNA は、RNA をラベルのレーン表示だけ gDNA と RNA の分離ゲル seq プロトコルで処理しました。パネル D は、低密度の膜のすべての車線の上部に黒い帯で実験の失敗を示しています。これは、断片化された DNA で汚染された電気泳動バッファーによって引き起こされました。この手順では、きれいなネガティブ コントロールと分離された gDNA と RNA/cDNA ハイブリッド車の存在を示す 2 つの明瞭な黒バンドの両方の研究を見るべき。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig3.jpg"> 図 3.ゲル Seq 分離結果。ゲル seq デバイス (A) と DNA と RNA/cDNA ハイブリッド車 (B) の分離を示す蛍光イメージ。偽色がより簡単にゲル内の密度の異なる地域の間に区別するために追加されました。(C と D)成功 (C) と (D) 実験の失敗からゲル seq デバイス全体の代表的な蛍光イメージ。NTC = テンプレート コントロールはありません。この図の部分は、王立化学協会の許可を得て参考文献 7 から再現されました。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57315/57315fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
DNA と RNA/cDNA のハイブリッド車が分離されているし、ゲル seq プロトコルの残りの部分を完了する、シーケンス ライブラリを生成することが可能です。準備されたライブラリを検証するには、標準的なゲル電気泳動実験 (図 4) または、バイオアナライザーのいずれかを実行します。図 4の結果は、500 の PC3 細胞と 750 の HeLa 細胞から生成されたライブラリを示します。ゲル-seq (ラベルは 'ゲル) (ラベルは 'チューブ') 標準プロトコルで生成される比類のないサンプルと比較してから生成された一致するライブラリのフラグメント分布図であります。標準の全ゲノム ライブラリー作製キットを使用してライブラリを準備する場合に期待どおり、200 と 800 のヒト間ゲル seq のフラグメント サイズが表示されます。ライブラリの断片は、この手順で正しいサイズの範囲では表示されません、ライブラリの準備が失敗しました。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig4.jpg"> 図 4.ライブラリ フラグメント サイズ比較します。ゲル seq (ゲル) と標準コントロール (チューブ) のライブラリ サイズ分布を比較する蛍光ゲル電気泳動イメージ。左車線には、フラグメント サイズ 100、200、400、800、1200、および 2000 ヒトと低質量 DNA ラダーが含まれています。このキットを使用したライブラリの期待どおりにすべてのライブラリのためのフラグメント サイズは 200 と 800 のヒト間落ちる。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57315/57315fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
ゲル seq プロトコルの最終的な検証は、シーケンスの結果の分析に基づいています。我々 は検証実験の PC3 細胞を選択するこれらの細胞サンプルを許可する均一な発現プロファイルを持っている分割、ゲル seq と伝統的な方法の両方を使用して処理図 5を参照してください。図 5A 5 bに PC3 細胞のゲノム DNA の比較を示します。図 5A PC3 から生成されるゲノム コピー数変動 (CNV) プロファイルの比較を示していますゲル seq または標準の全ゲノム ライブラリ準備反応 (管コントロール) を使用しています。各ポイントは平均正規化されたビン数です。箱は参照ゲノム データから定義されるなど、各箱には、正常な 2 倍体の細胞、すなわち、フラット ライン、すべて常染色体優性の地域ごとの同じコピーを表すに等しい予期した数 (を除く X と Y) 染色体。PC3 には、上記の 2 つの背景コピー数のスパイクとして表示される同じ地域の複数のコピーが含まれています。ゲル seq 標準管反応として質的に同様の CNV プロファイルが得られます。2 つのプロット間の合意によって評価される定量的線形回帰パネル B. で示すように、ピアソン相関 r = 0.90 は、ゲノムデータのいずれかのメソッドから収集が機能的に同等であることを示します。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig5.jpg"> 図 5.ライブラリ検証します。ゲノムのゲル seq 検証 (A および B) および PC3 と Hela 細胞から生成されるトランスクリプトーム (C、D、および E) データ。パネル A の比較を示します PC3 から生成されるゲノム CNV プロファイルのゲル-seq (ゲル seq) または標準的な反応 (チューブ) のいずれかを使用します。MAPD 中央ペア差分の絶対値を =。パネル B は線形回帰パネル A の 2 つのサンプルの間で R = 0.90 を示すゲノムのデータが機能的に同等です。軸は、log2 正規化された箱のカウントを表示します。C と D のパネルあたりプラスミドあたりの成績証明書の数を示す各ポイントに PC3 細胞トランスクリプトーム データの比較百万 (TPM)。軸は正規化 log2 トラン スクリプトの数として 2 つのサンプル間の比較を表示します。パネル C は seq、ゲルを使用して生成された技術的な反復実験の比較を示しパネル D ゲル seq と伝統的な RNA シーケンス パネル E の比較を示してゲル seq が主成分分析を用いた RNA 式に基づいてセルの種類を解決できることを。X 軸、y 軸を示す分散の 6.5% だけの第 2 主成分アカウント間のサンプルのばらつきの 91.6% 最初の主成分のアカウントを示します。この図の部分は、王立化学協会の許可を得て参考文献 7 から再現されました。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57315/57315fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
同様に、私たちは標準のチューブでスマート Seq プロトコルに私たちゲル seq プロトコルからトランスクリプトーム データを比較しました。図 5は、両方ゲル seq 技術レプリケートします (図 5C) とゲル seq と標準的な方法 (図 5D) との間の相関関係を示しています。各ポイントあたりプラスミド毎の成績にはカウントは、百万 (TPM) TPM で検出された各遺伝子の両方のデータセットで > 5。線形回帰は赤い線として表示され、ピアソンの相関係数は、左上隅に表示されます。ゲル seq から技術的な複製 (R ∼ 0.8) を同意するが、あまりに関連付ける標準的な方法 (R < 0.7)。ゲル seq 導入遺伝子の数では、バイアスすることが示唆されました。幸いなことに、このバイアスは体系的なあり、図 5Eで主成分分析を見ることができる、異なる試料間にまだ描画できる有意義な結論。

Watch this Scientific Journal Video about Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices at JoVE.com

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

ゲル seq の両方 DNA と RNA-seq 単純なハイドロゲル デバイスを用いた 100-1000 細胞からごくわずかな追加コストでライブラリを同時に準備することも可能。 にします。対ライブラリを生成する生物のプロトコルと同様に、デバイス作製のための詳細なアプローチを提案する.

ゲル-seq: DNA および RNA のゲルのマトリックスを使用しての同時配列ライブラリの準備の方法

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

gel-seq-method-for-simultaneous-sequencing-library-preparation-dna

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K ビュー.  University of San Diego. ゲル seq の両方 DNA と RNA-seq 単純なハイドロゲル デバイスを用いた 100-1000 細胞からごくわずかな追加コストでライブラリを同時に準備することも可能。 にします。対ライブラリを生成する生物のプロトコルと同様に、デバイス作製のための詳細なアプローチを提案する.

ビデオ: Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

環境水試料から調製した次世代シーケンシングライブラリの品質を向上させるために自動化されたゲルサイズの選択

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

環境学

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

遺伝学

AQRNA-seqを用いたtRNA動態の解析

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

著者スポットライト:低分子RNAのマッピングとタンパク質翻訳メカニズムの解明におけるAQRNA-seqの役割

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

細菌におけるRIBO-seq:NGSシーケンシングのためのサンプル収集とライブラリ調製プロトコル

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

生化学

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループット マイクロ流体プラットフォーム

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

生物工学

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

全 Genomic DNA 分析のための超長いリード シーケンス

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

液滴ベースのRNAシーケンシングによるハイスループット酵母株フェノタイピング

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

ゲル-seq: DNA および RNA のゲルのマトリックスを使用しての同時配列ライブラリの準備の方法

要約

さらに動画を探す

この動画の章

環境水試料から調製した次世代シーケンシングライブラリの品質を向上させるために自動化されたゲルサイズの選択

ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

細菌におけるRIBO-seq:NGSシーケンシングのためのサンプル収集とライブラリ調製プロトコル

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループットマイクロ流体プラットフォーム

全 Genomic DNA 分析のための超長いリードシーケンス

液滴ベースのRNAシーケンシングによるハイスループット酵母株フェノタイピング

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

ゲル-seq: DNA および RNA のゲルのマトリックスを使用しての同時配列ライブラリの準備の方法

要約

さらに動画を探す

この動画の章

環境水試料から調製した次世代シーケンシングライブラリの品質を向上させるために自動化されたゲルサイズの選択

ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

細菌におけるRIBO-seq:NGSシーケンシングのためのサンプル収集とライブラリ調製プロトコル

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループット マイクロ流体プラットフォーム

全 Genomic DNA 分析のための超長いリード シーケンス

液滴ベースのRNAシーケンシングによるハイスループット酵母株フェノタイピング

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループットマイクロ流体プラットフォーム

全 Genomic DNA 分析のための超長いリードシーケンス