Name: two-photon intravital imaging of leukocytes during the immune response in lipopolysaccharide-treated mouse liver
Uploaded: 2018-02-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
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この研究助成金から国立研究財団の韓国 (NRF) (Y m グラント号 2016R1A2B4008199 MSIP。 韓国政府によって資金を供給されるによって支えられましたH.) 厚生省と韓国の福祉 (許可番号: HI14C1324)。

すべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会の延世大学医科大学、韓国のガイドラインにしたがって運営しました。LysM 緑の蛍光蛋白質 (GFP; gfp/+) マウス8と CX3Cr1 GFP (gfp/+) 生体イメージングのための 8-12 週齢9マウスが使用されました。すべての手術器具はオートクレーブと 70% アルコールで消毒.
1. カスタム設計されたマウス肝イメージング ツールのサポート室
<ol><li>マウス肝イメージング室の設計<ol>
<li>(図 1) をイメージング マウス肝臓の次のサイズの部屋を作る: 内側のチャンバー (120 mm 長さ × 幅 160 mm × 30 mm 高さ)、外側室内 (100 mm 長さ × 幅 100 mm × 24 mm)、ボルト (Ф 3 × 30 mm 高さ)、ナット (Ф 4 mm)、と翼形ナット (Ф 4 mm)。</li>
		<li>硬化エージェントとエラストマーの比が 1:9 の基本とのシリコーンの 120 g の合計を測定します。</li>
		<li>液状シリコーン混合物を 250 mL の三角フラスコに入れて、よく混ぜてね。フラスコを乾燥器に入れて、ポンプを真空下で約 1 時間の空気の泡を削除します。</li>
		<li>カスタム設計されたマウスの商工会議所の高さ 10 mm ほどに液状シリコーン ミックスを注ぐそれをさせ (図 1 a) の日のカップルのための治療法。</li>
	</ol>
</li>
	<li>カバー スライドとベッドを固定レバーの準備<ol>
<li>金属製のフレームでは、シリコーン接着剤を使用してガラスを添付します。1 日 (図 1 b) で乾燥させます。</li>
		<li>水浸漬レンズ用蒸留水を効果的に保持するために半永久的な水ブロック構造が不可欠です。1 mm のシリコーン接着剤を丸めを行い、一晩それを強化します。</li>
		<li>硬化剤とエラストマー ベースのミックスし、それを注ぐ高さの約 8-10 mm。 実行 6 ウェル プレートに硬化プロセス 1.1.2-1.1.4 で説明したよう。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 組合の準備
<ol><li>1 × リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 性腸炎サルモネラ血清型から LPS 粉末を希釈するための準備します。(1 × PBS: 137 mM 2.7 mM KCl 塩化ナトリウム 10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4)。</li>
	<li>37 ° c の水浴の PBS を予熱して慎重に LPS 粉ボトル (25 mg) を開きます。</li>
	<li>ピペットで移しなさい援助を使用して、滅菌 PBS (5 mL) を注ぎ LPS パウダー ボトルと優しくかき混ぜるまたは在庫ソリューションを準備するソリューションを中断します。 注: LPS 粉末を液状、過酷なボルテックス泡が発生できます。1.5 mL チューブの因数を作るときに損失を最小限にするために泡を避けます。</li>
	<li>− 20 ° C、LPS 原液を格納し、注射用 1 mg/mL 組合ソリューションに希釈します。</li>
	<li>1 mg/mL の LPS 溶液 (20 mg/kg) を 1 mL の注射器を使用して非麻酔下マウスの腹膜に注入します。対照動物の PBS の同じボリュームを挿入します。</li>
	<li>十分な炎症性応答を 2 時間待つ。</li>
</ol>3. 血管を染色するテキサス赤デキストランの準備
<ol><li>2 つの 15 mL の円錐管と滅菌 PBS の 10 mL を準備します。</li>
	<li>テキサス赤デキストラン粉 (25 mg) 3 mL の PBS を希釈し、よく混ぜます。空 15 mL の円錐管に混合物を転送します。</li>
	<li>デキストランの混合物 (3 mL) を含む 15 mL の円錐管に残り PBS (7 mL) を転送します。</li>
	<li>0.45 μ m のシリンジ フィルターを 10 mL の注射器の先端に接続します。シリンジ フィルターが針を置き換える必要があります。</li>
	<li>デキストランの混合物 (10 mL) をフィルター処理します。こぼれることを避けるために均等に押し、注射器。</li>
	<li>光ブロック 1.5 mL チューブにデキストラン溶液 2.5 mg の 500 μ L を分注、− 20 ° C で保存解凍後、4 ° C で保存します。</li>
</ol>4. 手術のプロセス
<ol><li>手術テーブルと、手術前に 70% アルコールを使用してすべての機器を消毒します。肝切除のためのツールを設定し、37 ° c (図 2 a、 B) 加熱プレートを調整します。</li>
	<li>麻酔、腹腔チレタミン/チレタミンの 30 mg/kg とキシラジンの 10 mg/kg、マウスを注入します。これらのソリューションは、混合し、同時射出のため PBS で希釈できます。マウスのつま先を軽く押す anesthetization を確認します。 反射がない場合次の手順に進みます。</li>
	<li>マウスの網膜の乾燥を防ぐために眼軟膏の少量を適用します。</li>
	<li>脱毛クリーム (図 2) を使用して腹部周辺の体毛を削除します。</li>
	<li>尾静脈またはインスリン注射器 (図 2 D) を使用してレトロな軌道注入を介してテキサス赤デキストラン溶液 (2.5 mg/mL の濃度) の 200 μ L を注入します。</li>
	<li>マーカーで右弓下の領域をマークします。剣状突起から肋骨の終わりに線描する必要があります。鉗子、はさみ (図 2 e, F) で表皮をカットします。</li>
	<li>マイクロ剪刀、鉗子を用いた腹腔内を開き、慎重に肝臓を公開します。左葉外側綿棒 (図 2, H) を使用して展開する必要があります。</li>
	<li>肝臓の乾燥を防ぐために腹腔内に 500 μ L の滅菌 PBS を注ぐ。</li>
	<li>カスタム設計されたチャンバーで右側臥位でマウスを置き、シリコン ベッドに組織接着剤の少量を適用します。その後、綿棒 (図 2 i) を用いた肝慎重に取り付けます。 メモ: 肝臓の組織は非常にもろい、機械的に引っ張らないで、肝を。優しく、綿棒でそれをロールアウトします。</li>
	<li>数秒後は、500 μ L の肝臓から乾燥を防ぐため滅菌 PBS で再び肝臓を濡れています。肝臓に金属製のフレームを置き、ナット (図 2 j) でしっかりと固定します。</li>
</ol>5 2 光子顕微鏡を用いた肝臓の生体イメージング
<ol><li>880 nm、緑、セットし禅ソフトウェア (カールツァイス) レーザーをオンに、波長を設定するを実行し、赤のチャンネル。蛍光強度 (図 3 a) によるとレーザー パワーを調整します。排出フィルター情報のとおりです: グリーン/Alexa488、500-550 nm、赤/Alexa 555、575 610 nm。</li>
	<li>イメージングの段階でチャンバーを配置し、水浸対物レンズ カバー ガラスに近い X 20 を配置します。</li>
	<li>その体温 (図 3 b) を維持するためにマウスの体の下でシリコン ラバー ヒーターを修正します。</li>
	<li>金属製のフレームに 500 μ L の蒸留水をドロップ、肝臓 (図 3) に近い対物レンズを引き出します。</li>
	<li>イメージングの領域の深さを調べるし、フォーカスを調整します。</li>
	<li>イメージングを実施します。</li>
	<li>長期用チレタミン/チレタミンとキシラジンの混合物の半分線量イメージング中にそれぞれの時間を挿入します。この段階で、37 ° C でマウスの体温を維持することが不可欠です。常に目にマウスに anesthetization 時間とすべてのマウスは異なりますので。 注: このメソッドは手術とイメージング後回復に適していません。我々 は倫理的手術後すぐにマウスを犠牲します。</li>
	<li>安定した anesthetization の 30 分毎のペダルの反射神経をチェックします。</li>
</ol>6. データの分析
<ol><li>データ分析ソフトウェア Volocity を開き、ソフトウェアにライブラリ内の生データをインポートします。</li>
	<li>状況に合わせて、スナップショット画像からノイズを除去します。 注: 滑らかな画像を得るためには、'罰金または '中央' のフィルターを使用します。さらに、暗いまたはぼやけた画像を明確にするのに 'コントラスト強調' 機能を使用します。</li>
	<li>スナップショット画像を JPEG または TIFF ファイルと AVI ファイルの映画の 100%、輸出に編集した項目に適合します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Girard, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fuels,+hormones,+and+liver+metabolism+at+term+and+during+the+early+postnatal+period+in+the+rat.">Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat.</a> J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).</li><li>Marques, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+liver+biology+in+vivo+using+conventional+confocal+microscopy.">Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy.</a> Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).</li><li>Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy+Imaging+of+the+Liver+following+Leishmania+Infection:+An+Assessment+of+Hepatic+Hemodynamics.">Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics.</a> J Vis Exp. (101), e52303 (2015).</li><li>Honda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+neutrophil+recruitment+in+hepatic+ischemia-reperfusion+injury+in+mice.">Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).</li><li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation.">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).</li><li>Sierro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Liver+Capsular+Network+of+Monocyte-Derived+Macrophages+Restricts+Hepatic+Dissemination+of+Intraperitoneal+Bacteria+by+Neutrophil+Recruitment.">A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment.</a> Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li><li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice.">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li></ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

肝臓は多くのグループ3,10, その機能の重要性のために積極的に研究されています。例えば、ヘイマンらは agarose を使用して繊細な手法を提案します。ただし、このメソッドは、高精度なことが判明した、アガロースの設定時間がかかります。ただし、私たちの方法論ですべての手順が実施される他の交絡因子を最小限に抑え、30 分以内。ハートビートは、ビデオを乱すことがので第二に、肝臓を安定化非常に重要です。この現象を避けるためには、マウスを右側臥位に再配置されます。
このプロトコルでもう一つの重要なステップは、金属製のカバー フレームと金属製のバー上でその場所の生産だった。私たちが直面した最も重要な障害だった肝固定圧力の適切な量を使用してに応じて肝壊を克服する方法を決定します。当初、蝶ナットのみがカバー スライドを保持するために適用されたとき血液の循環が低下して、肝臓がカバー スライドの重量に耐えることができませんでした。代わりに、バーに沿ってカバー スライドを配置する前にボルトをロールバックする方法を考案しました。カバー スライドは、ボルトによって支えられた、ので押していないダウン難しい肝臓に、バランスと固定をまだ維持肝の太さとここにいくつかのスペースを与えた。LysM GFP マウス6を使用すると、このデザインが悪用された場合、正弦波と中心静脈における好中球の可視化を確認しました。5は、また、LCMs。 LCMs を観察するためにこのモデルで使用されていた CX3Cr1 GFP マウスが肝臓の表面によく見つかりました。
肝の台座やシリコン ベッドの高さも不可欠でした。それは余りに高かった、肝臓の血液循環が中断されます。肝の台座の高さが低すぎると肝臓の安定した固定を維持するために困難だった。すべてのマウスがあったので異なったサイズ、異なる高さの類似細胞培養に使用する 6 ウェル プレートを使用していたシリコン ベッドを制作しました。この方法で各マウスのサイズに従って部屋をカスタマイズすることができました。要約すると、小説と形態を調査するマウス肝臓の生体イメージングと炎症性条件の下で肝臓の免疫細胞の運動性のための単純なプロトコルを考案しました。
この新しいプロトコルは、肝の急性の免疫応答を観察したい人この分野の研究に非常に有用かもしれない。ただし、この方法では、研究者の組織接着剤で肝臓の固定のために 6 時間を超える長期的なイメージングを行うことができません。このプロトコルは、1 回限りの唯一の方法と、したがって、マウスはすぐにイメージング後犠牲にする必要があります。肝臓がシリコン ベッドから分離されているとき、肝臓最終的に過度の出血で、その結果、ベッドから削除されます。したがって、再挿入し、腹部の縫合は将来観察可能ではありません。

肝臓は、哺乳類の主要な代謝器官それはエネルギー、ホルモンおよび解毒1の司令塔として機能します。その重要性のため研究者は炎症時に肝臓の変化を明らかにする多くの in vitroとin vivoの実験を行った。肝2からのライブ画像をキャプチャする生体顕微鏡を使用されています。確かに、イメージングの方法をされている様々 な肝臓は2,3,4,5,6を導入しました。しかしより簡易な外科的アプローチを開発、標的臓器や免疫細胞の安定化を達成するために、我々 は生体イメージングのための彼らの努力を最小限に抑えるための研究者を導くことができる単純なプロトコルを設計しました。
本研究では、安定的かつ新規イメージング室と出血や可能な限りの感染を最小限に抑えるために使用できる手術手技を紹介しました。肝臓は 2 時間以上そのまま残ったことを確かめた。この方法では、我々 は正常に LCMs7と敗血症性条件下における好中球の形態を識別されます。以来、このメソッドは、手術中に震えていると予期せぬ炎症など物理的・生物的交絡要因を最小化、このメソッドを使用して応答で肝臓の免疫細胞の急性反応を観察することができると見込んでください。試薬には、LP が好きです。

<table><tbody><tr><td>Custom designed chamber</td><td>Live Cell Instruments</td><td></td><td>Custom-designed size</td></tr><tr><td>Metal cover slide</td><td>Live Cell Instruments</td><td></td><td>Custom-designed size</td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#72204-03</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone elastomer kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer flask</td><td>DURAN</td><td>21 216 36</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plate (Flat type)</td><td>HYUNDAI Micro Co.</td><td>H31006</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>ADARSH</td><td>55204</td><td></td></tr><tr><td>High Q BOND SE 5 mL</td><td>BJM LAB</td><td></td><td>To make semi-permanent dam</td></tr><tr><td>Flexible Silicone Rubber Heaters</td><td>Omega</td><td>SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800</td><td></td></tr><tr><td>DC power supply</td><td>Toyotech</td><td>DP30-03A</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td></td><td></td><td>Home-made</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6011</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red Dextran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>15 mL High-clarity polypropylene&lt;br/&gt; conical tube</td><td>FALCON</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m filter (Minisart Syringe Filter)</td><td>Sartorius</td><td>16555k</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml Micro Tube, Amber</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-X</td><td>For light-blocking</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Korea Vaccine</td><td>KV-S01</td><td></td></tr><tr><td>3 mL syringe</td><td>Korea Vaccine</td><td>KV-S03</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>Korea Vaccine</td><td>KV-S10</td><td></td></tr><tr><td>0.3 mL insulin syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>324900</td><td></td></tr><tr><td>Hair removal cream 100 mL</td><td>Body natur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton swab</td><td>ABDI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoletil 50 5 mL</td><td>Virbac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun 10 mL</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating plate</td><td>Live Cell Instruments</td><td>PH-S-10</td><td>Custom-designed size</td></tr><tr><td>DC controller</td><td>Live Cell Instruments</td><td>CU-301</td><td></td></tr><tr><td>Microdessection Scissors</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-5418</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>Vet bond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>ZEN software (Black Edition)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Program for LSM 7 MP</td></tr><tr><td>LSM 7 MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Analysis program</td></tr></tbody></table>

two-photon intravital imaging of leukocytes during the immune response in lipopolysaccharide-treated mouse liver

敗血症は組織と臓器障害を引き起こす可能性が重度の感染症の種類の損傷。敗血症に関連する死亡率および罹患率率が非常に高く、ない直接の治療または臓器関連のメカニズムをリアルタイムで詳細に調べた。肝臓は毒素と人間の体内で感染症を管理する主要臓器であります。ここで、肝被膜マクロファージ (LCMs) 好中球などの免疫細胞の運動性を追跡するためにエンドトキシンの誘導後マウス肝臓の生体イメージングを実行する目的とします。したがって、露出低侵襲手術と肝臓の手術法を考案しました。リポ多糖 (LPS)、一般的なエンドトキシンを腹腔内に注入したマウス。露出と LPS 投与する LysM 緑の蛍光蛋白質 (GFP) でマウスの肝臓、その好中球がわかった募集の生体イメージングのための外科的手法を使用してマウスの肝臓はリン酸バッファーのそれと比べると増加しました。生理食塩液投与の肝。LPS 処理後の好中球数は時間と大幅に増加。また、CX3Cr1 GFP マウスを使用して、我々 は正常に、LCMs と呼ばれる肝マクロファージを可視化。したがって、生体内で免疫の移動を制御する新しい試薬の有効性を調べるためには、運動性および肝臓における好中球および LCMs の形態を決定することができによる臓器障害や組織損傷の治療の効果を識別するために敗血症における白血球の活性化。

シンプルで非常に安定した画像処理室が考案されました。チャンバーの下部は、マウス本体と臓器のすべりを防止するシリコンで覆われていた。また、シリコンは弾力性の適切な量があるのでそれはカバーのスライド (図 1 a, C) の圧力による損傷が予想されるを防ぐことができます。第二に、組織の安全な接着剤 (ボンド獣医) は、シリコーンの円形のベッドの上で抽出した肝臓を修正するために適用されました。このメソッドには、心拍や呼吸運動によって引き起こされる震えているを避けるために私たちが有効になります。最後に、金属カバー スライドは配置され固定ボルトとナット、マウスの体サイズと突出レバー (図 1 b-D) の位置に基づきます。麻酔が正しく実行されたときこれらのイメージング設定 6 h 以上最後の可能性があります。
手術を開始する前にマウスの体温は、37 ° C (図 2 a) に設定された事前加熱室に動物を配置することによって制御されました。次に、二次感染を防ぐためには、70% アルコールで滅菌やオートクレーブ (図 2 b) 二次感染を防ぐためにマウス外科およびイメージ投射のためのすべての必要なツールがあった。マウスの体の毛は、脱毛クリーム (図 2) で、腹部から特に、削除されました。切開する前に、皮膚ポビドン ヨードで殺菌。血流を介して静脈注射 (図 2 D) テキサス赤デキストランとのレッテルを貼られました。剣状突起に始まり、右の肋骨で終了線が描かれました。この右弓下切開線は、出血を最小限に抑えるを助けた。マイクロはさみやメス、解剖が開始されました。(図 2 e, F) の腹腔内から腸の追放を避けるために、腹部はあまりに開かれませんでした。脂肪組織層と微小解剖はさみ鉗子除去し、切開領域だった滅菌 PBS、コットン綿棒 (図 2) で洗浄します。左外側の葉は、最大 4 つの肝葉の綿棒を使って撮影され、組織ボンド (獣医ボンド) を用いたシリコン ベッドを接続します。肝組織は非常にもろいが、肝臓外に移動された綿棒 (図 2 H、私) を使用しています。金属カバーのガラスを適用すると、肝臓はイメージングを実施しました。乾燥を防ぐため、滅菌 PBS は肝臓とカバーガラス (図 2 j) の間隔に適用されました。カバーガラスの高さ調整とナッツのために必要な場合。
2 光子励起顕微鏡に搭載された X、Y、および Z 軸マイクロメータ コント ローラーと黒いカーテン (図 3 a) とシールドします。レーザーは、禅ソフトウェア安定モード ロックだった。安定した画像を取得するには、標的臓器のドリフトを防止する必要があります。したがって、イメージング室や手術法に加え電子加熱パッドの配線された粘着テープ (図 3 b) によって整然とイメージングの段階からセキュリティで保護されました。最後に、蒸留水の十分な量は、水浸漬レンズ (図 3) 用カバーガラスの上に追加されました。
血流は、テキサス赤デキストラン静脈内注射後画面に明示しました。赤と緑の両方を同時にキャプチャするために波長 880 のイメージングを行った nm。生体イメージング解析によると適切な好中球数は PBS 状態で血液を常に循環されました。一方、LPS の好中球数投与マウス有意に増加しました。好中球の多くは、血流中循環されたが、彼らは炎症状態で容器外に移行しなかったに注意してください。(図 4 a、附則ムービー 1)。LPS 投与マウスにおける好中球がもっとしっかりと (図 4 a、補足の映画 1) 容器で好中球のより頻繁に検出をした血管の内腔に付着しました。好中球の運動から離れて CX3Cr1 GFP マウスの LCMs は (図 4 b) 組織の奥深くにではなく、肝組織の表面に観察された.LCMs は、LPS 投与マウスでも肝臓に少しの動き又は作動を示した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57191/57191fig1.jpg"> 図 1.肝の商工会議所および子会社のツールのデザイン。(A) マウスのカスタム設計されたチャンバーにシリコーン混合物を注ぐ。(B) 金属製のカバー スライドの寸法 (1 インチ = 25.4 ミリメートル、Ф = 直径)。(C) 画像は、カスタム設計された肝商工会議所に満ちてシリコーン ・ エラストマー プラスチックを示しています。(D) 他の部分は、肝の商工会議所を組み立てるために使用されました。固定用のボルトとナットは、鉄から成っていた。矢印で示されたボルトおよびナット、それぞれ、(C) と (D)。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57191/57191fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57191/57191fig2.jpg"> 図 2.肝臓外科手術の手順です。(A) 金属とゴム 37 ° C および術前に、の温度コント ローラーでプレートを加熱します。(B) 全体的な手術、肝切除術 (a. 綿綿棒やコンテナー、b. 70% アルコール、c. 紙組織 d. かみそり e. 脱毛クリーム、f. 特注チャンバー、g. サージカル テープ、h. 自家製肝台座、i. ウイング ナット、ナット、j. 金属カバー支援ツールスライド、k. 微小解剖はさみ、l. 鉗子、m. はさみ、(名) 3 mL シリンジ、o. マーカー、p. 0.3 mL インスリン注射器、q. 1 mL 注射器)。肝切除術 (C J) プロシージャ。(C) 適用する脱毛クリーム腹部のサイトで。(テキサス赤デキストランとマウスの D) レトロな軌道注入。(E) マーカーで切開部位をマーキングします。(F) 鉗子、ハサミで表皮を切断します。(G) 腹腔内に切開すること。(H) 左葉外側をそっと抜きます。(I) は獣医のボンドを使用して肝臓の台座に、葉をアタッチします。(J) を最終的なセットのイメージです。ナットは金属製のカバー スライドに固定され、してカバー スライドは蝶ナットで固定しました。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57191/57191fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57191/57191fig3.jpg"> 図 3.2 光子励起顕微鏡とイメージングの段階の設定します。(A) 二光子励起顕微鏡 (LSM 7 MP) と x および y 方向に移動するイメージングの段階のビュー。(B) 肝イメージング室加熱パッドのゴムは、マウスをカバーするテープを使用して添付されました。(C) ドロップは対物レンズとカバーガラスの間ピペットと蒸留水。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57191/57191fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57191/57191fig4.jpg"> 図 4.生きたマウスの肝臓で肝被膜マクロファージと好中球の可視化します。(A) 拡張する LysM GFP マウスの肝臓における好中球のフォーカス スナップショット。コントロールのイメージは、PBS 投与マウスからだった。LPS の画像は、LPS 投与マウスからだった。20 X を使用して画像を取得した 1.0 NA 水浸漬のレンズ (視野 [視野] = 424.3 μ m × 424.3 μ m、深さ 40 μ m、スライス間隔を = = 1 μ m、時間間隔 = 60 s、サイクル = 31)。スケールバー = 50 μ m。 (B) 内部と表面 CX3Cr1 GFP マウスの肝臓における LCMs のエリアのスナップショット。20 ×/1.0 NA 水浸漬レンズを使用して画像を取得した (FOV 424.3 μ m × 424.3 μ m、深さを = = 40 μ m (内側)/10 μ m (表面)、スライス間隔 = 1 μ m、時間間隔 = 60 s (インナー)/20 s (表面)、サイクル = 31)。スケールバー = 50 μ m.<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57191/57191fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57191/57191mov1.jpg"> 附則ムービー 1。PBS の比較には、LPS 治療肝臓と肝臓が扱われます。2 つの異なる条件で明確な違いがよく観察されます。LPS 処理に肝臓、好中球の数が大幅に増加し、運動性は低下しました。映画両方の条件での安定性が観察されます。血流はテキサス赤デキストランのラベルが付きます。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57191/Movie_1.avi" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

最小の侵入と生きたマウス肝臓の二光子励起イメージングのための新しい外科プロトコルを設立しました。この手法は、リポポリサッカライド誘起ブタエンドトキシン肝臓の微細構造を確認できた。肝の白血球の遊走に各種の試薬処理の有効性を決定するこのメソッドが利用されることを期待しています。

リポ多糖投与マウス肝臓における免疫応答時に白血球の二光子励起生体イメージング

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

two-photon-intravital-imaging-leukocytes-during-immune-response

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K ビュー.  Yonsei University College of Medicine. 最小の侵入と生きたマウス肝臓の二光子励起イメージングのための新しい外科プロトコルを設立しました。この手法は、リポポリサッカライド誘起ブタエンドトキシン肝臓の微細構造を確認できた。肝の白血球の遊走に各種の試薬処理の有効性を決定するこのメソッドが利用されることを期待しています。

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

免疫・感染学

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

マウス膝窩リンパ節の生体内イメージング

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

以下の肝臓の生体顕微鏡イメージング<em&gt;リーシュマニア</em&gt;感染症：肝血行動態の評価

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

CXCR6.Gfpレポーターマウスを使用して、健康で罹患肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

マウスの腸間膜静脈内の生体顕微鏡白血球 - 内皮及び血小板 - 白血球の相互作用

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

皮膚における遺伝的にタグ付けされたレポーター細胞の生体内2色2光子イメージング

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

生物工学

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

医学

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

<meta charset="utf8"></head><body>マウス肺移植における細胞動態のリアルタイムモニタリング

Intravital Two-Photon Microscopy of the Transplanted Mouse Lung

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by crosstalk between donor and recipient cells. A better understanding of these processes relies on the use of preclinical animal models and is aided by an ability to study intra-graft immune cell trafficking in real-time. Intravital two-photon microscopy can be used to image tissues and organs for depths up to several hundred microns with minimal photodamage, which affords a great advantage over single-photon confocal microscopy. Selective use of transgenic mice with promoter-specific fluorescent protein expression and/or adoptive transfer of fluorescent dye-labeled cells during intravital two-photon microscopy allows for the dynamic study of single cells within their physiologic environment. Our group has developed a technique to stabilize mouse lungs, which has enabled us to image cellular dynamics in na&#239;ve lungs and orthotopically transplanted pulmonary grafts. This technique allows for detailed assessment of cellular behavior within the vasculature and in the interstitium, as well as for examination of interactions between various cell populations. This procedure can be readily learned and adapted to study immune mechanisms that regulate inflammatory and tolerogenic responses after lung transplantation. It can also be expanded to the study of other pathogenic pulmonary conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:Intravital Imagingによる肺移植免疫学の進歩

Here, we present a protocol to intravitally image the transplanted mouse left lung using two-photon microscopy. This represents a valuable tool for studying cellular dynamics and interactions in real-time following murine lung transplantation.

移植されたマウス肺の生体内2光子顕微鏡検査

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by ...

リポ多糖投与マウス肝臓における免疫応答時に白血球の二光子励起生体イメージング

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白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで