Name: proliferation and differentiation of murine myeloid precursor 32d/g-csf-r cells
Uploaded: 2018-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells at JoVE.com

著者は、教授ルード ・ Delwel と 32D/G-CSF-R セルラインをご提供する教授 Ivo Touw と教授ダニエル g. Tenen Bosc23 細胞株をご提供するためにありがとうございます。この作品は MA J にチェコ共和国 (GACR 15 03796S と GACR 17 02177S) の助成機関の補助金によって支えられた、MA - j、ジョージア州英国フェローシップ (プロジェクト号 341015) チェコ科学アカデミー (RVO 68378050) の分子遺伝学研究所からのサポートPD にプラハ ・ カレル大学から MK とジョージア州英国親睦 (プロジェクト号 1278217) にプラハのチャールズ大学。

メモ: 手順は、拡張を記述する、分化および 32D/-r-CSF G 細胞の伝達以下に示します。
1. 準備
<ol><li>メディアの準備
	<ol>
<li>250 mL の培養液の準備: FBS (ウシ胎児血清) とマウス IL 3 に 10% 熱 (ロズウェル パーク記念研究所) RPMI 1640 培が不活化 (10 ng/mL)。<ol>
<li>また、自家製の IL 3 を使用します。自家製 IL 3 を生成するには、IL 3 表現するベクトルを HEK293 細胞を変換し、IL-3 清22を含むを収集します。 注: 抗生物質、ペニシリン G など (100 IU/mL)、(100 μ g/mL)、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン (40 μ g/mL) は、特に明記しない限り、プロトコルのすべてのステップで, 培養細胞の使用できます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>分化培地 50 mL を準備: RPMI 1640 中 10% 添加した引受とヒト G-CSF (100 ng/mL)。 注: しないすべての血清バッチ サポート 32D/-r-CSF G 細胞の分化 (重要)。実験開始前に、血清中の別のバッチをテストします。少なくとも 4 つの異なるバッチをテストし、最適な区別する 32D/G-CSF-R セルの能力に基づいて選択することをお勧めします。32D/G-CSF-R 分化プロトコルの以下を参照してください。</li>
		<li>凍結培地 10 mL を準備: RPMI 1640 中 40% 添加した引受と 10 %dmso (ジメチルスルホキシド)。</li>
	</ol></li>
	<li>レトロ ウイルスの生産
	<ol>
<li>Bosc23 細胞 (6 × 106) 16 cm シャーレで単一細胞懸濁液をプレート、FBS 文化の confluency まで 80% (24 h) に達すると 10% を含む DMEM (ダルベッコ変更イーグル培地) の 18 mL で育んでいます。 注: 細胞培養単分子膜やフォームではなく塊で成長してください。細胞数は、異なるメソッド (ここに示すプロトコルの残りの部分に有効) を使用して実行できます。サンプル数が少ない、場合 Bürker チャンバーを用いた顕微鏡下で手動カウントを推奨します。この場合、死んだ細胞の排除のためトリパン ブルー色素を使用します。セル 1:1 を混ぜて 0.4% トリパン ブルー PBS で。多くのサンプル数のカウントを実行するには、セルの自動カウンターを用いることができます。</li>
		<li>レトロ ウイルスの構造 (たとえば、MSCV) の 40 μ g、pCL エコ (包装ベクトル)23の 20 μ g、PEI (ポリエチレンイミン) の 80 μ l と減少血清媒体 (例えばオプティ-MEM) 媒体 (抗生物質) なしの 2 mL を組み合わせます。部屋の温度 (RT) で 20 分のこの混合物を孵化させなさい。</li>
		<li>16 ml の 2% を DMEM Bosc23 細胞中に慎重に取り付けます FBS。事前使用前に 37 ° C の中を温めます。 注: トランスフェクション効率を減らすことができるので、トランスフェクション、時に抗生物質を使わない。</li>
		<li>1.2.2 で混合物を追加します。注意深く、Bosc23 滴文化と 37 ° C で 4 時間インキュベートプリンスエド ワード島の毒性により 6 h 未満までのインキュベーションを制限します。</li>
		<li>インキュベーション後、Bosc23 媒体を 18 mL に変更 10% を含む DMEM を予め加温 FBS、37 ° C で 48 時間のための細胞を養うとバイオ セーフティ レベル 2 の実験室で料理を配置、ここで、このステップから維持、標準的な安全手順に従ってください。</li>
		<li>50 mL の円錐管に 25 mL の血清ピペットを使用して Bosc23 媒体 (含まれているマウス白血病ウイルスエンベ レトロ ウイルス粒子) を収集し、4 ° C で保存 注: (重要) トランスフェクション効率は、高力価ウイルスを生成する 90% に達する必要があります。</li>
		<li>18 mL 加温 DMEM の 10% を追加 Bosc23 に FBS 細胞し、24 h の育成します。</li>
		<li>1.2.6 のステップを繰り返します。 注: ウイルスの整合性を維持するために同じ温度 (4 ° C) に達すれば 1.2.6 1.2.8 からレトロ ウイルス上清をプールできます。</li>
		<li>ウイルス上清中に Bosc23 の汚染を避けるためには、4 ° C で 10 分間 1500 × g で収集されたウイルスをスピンします。分注ウイルスは、ドライアイスや液体窒素を用いて凍結をスナップし、-80 ° C で保存ただし、その作りたてのウイルスは凍結する在庫より感染効率の面で高品質。 注: (重要) 避けるため繰り返し凍結/融解ウイルス、ウイルスの劣化につながるので。</li>
	</ol></li>
	<li>レンチ ウイルスの生産
	<ol>
<li>HEK293T (人間の萌芽期の腎臓の 293 t) 細胞 (6 × 106) 16 cm シャーレで単一細胞懸濁液をプレート、FBS 文化の confluency まで 80% (24 h) に達すると 10% を含む DMEM の 18 mL で育んでいます。 注: 細胞培養単分子膜やフォームではなく塊で成長してください。</li>
		<li>15 μ g のプラスミド pCMVdR8.74 (ギャグ/ポル、12 μ g のエンコーディング) をパッケージ化 (pGhU6) などレンチ ウイルスの構造を組み合わせると pMD2.VSVG (VSV G、1.4 μ g のエンコーディング)、85.2 μ L PEI、(抗生物質) なし減少血清培地 2 mL。室温に 20 分間のこの混合物を孵化させなさい</li>
		<li>2 %dmem の 16 ml HEK293T の中に慎重に取り付けます FBS。事前使用前に 37 ° C の中を温めます。トランスフェクション効率を減らすことができるので、トランスフェクション、時に抗生物質を使用しないでください。</li>
		<li>慎重に 1.3.2 HEK293T 細胞培養への準備混合物をドロップし、37 ° C で 4 時間インキュベートプリンスエド ワード島の毒性を防ぐために 6 時間以内に潜伏期間を制限します。</li>
		<li>18 mL に変更培地加温 DMEM の 10 %fbs と 37 ° C で 48 時間のための細胞を育成バイオ セーフティ レベル 2 の実験室で料理を配置、ここで、このステップから維持、標準的な安全手順に従ってください。</li>
		<li>HEK293T 媒体 (含む・ ロープ ・ レンチ ウイルス粒子) 50 mL コニカル チューブに 25 mL の血清ピペットを使用してを収集し、4 ° C で保存 注: (重要) トランスフェクション効率は、高力価ウイルスを生成する 90% に達する必要があります。</li>
		<li>慎重に予め温めておいた DMEM の 18 mL を追加し 10% FBS HEK293T 細胞へ。37 ° C で 24 時間を育成します。</li>
		<li>1.3.6 のステップを繰り返します。 注: ウイルスの整合性を維持するために同じ温度 (4 ° C) に達すれば、1.3.6 1.3.8 からレンチ ウイルス上清をプールできます。</li>
		<li>4 ° C で 10 分間 1500 × g で収集されたウイルスをスピン HEK293T 細胞とウイルス上清の汚染を避けるためには、分注ウイルスは、ドライアイスや液体窒素を用いて凍結をスナップし、-80 ° C で保存ただし、凍結する在庫よりも感染効率の面で高い品質の作りたてのウイルスそれは注意してください。 注: (重要) 避けるため繰り返し凍結/融解ウイルス、ウイルスの劣化につながるので。</li>
	</ol></li>
	<li>GFP レポーターを含むウイルスの滴定
	<ol>
<li>シード DMEM の 300 μ L で 1 × 10 5/NIH 3T3 細胞 10 %24 ウェル プレートによくあたり FBS。7 つの井戸が 1 つのウイルスの力価が適用されます。</li>
		<li>37 ° C でウイルスを解凍し、1、5、10、50、100、500 μ L のウイルスを NIH 3T3/文化に追加します。すべてのウイルスをネガティブ コントロールにも追加しません。37 ° C で 48 時間のウイルスの存在下で細胞を養う</li>
		<li>トリプシン/EDTA (エチレンジアミン四酢酸) の 30 μ L を使用して/NIH 3T3 細胞を収穫 (0.25% トリプシン、PBS で 0.01 %edta) 細胞の FACS (蛍光活性化細胞選別) 管で 250 μ L の PBS の場所と。</li>
		<li>各サンプル24フローサイトメトリーによる GFP+細胞の頻度を決定します。ヘキスト 33258 などの生存性色素の添加により死んだ細胞を除外します。</li>
		<li>(GFP+細胞のめっきされたセルの数と割合に基づく) GFP+のセルの合計数を計算してウイルス感染症用のボリュームに対してそれらをプロットします。 注: (重要) 性感染症はウイルス大量が適用されるときに高原に達する。したがって、どの感染効率が線形の範囲 (例を表 1に示すように) 発生ウイルス濃度に基づいて価を推定することが重要です。GFP+細胞の数は、特定のウイルス量の機能性ウイルス粒子 (TU - 変換ユニット) の数を示します。TU の mL 数を再計算します。</li>
	</ol></li>
	<li>ピューロマイシン レポーターを含むウイルスの滴定
	<ol>
<li>シード 3 mL DMEM に 5 × 10 4/NIH 3T3 細胞 10 %6 ウェル プレートのウェルあたり FBS6 井戸 1 つのウイルスの力価を採用してください。37 ° C で一晩文化</li>
		<li>次の日は、表 2に示されているようにウイルスを希釈します。ウイルスを希釈に使用して予め温めておいた DMEM 10 %fbs。ボルテックスにかけないでください。</li>
		<li>NIH/3T3 細胞から培養液を外し、希薄ウイルスの 1 つの mL を追加します。</li>
		<li>37 ° C で一晩インキュベートします。</li>
		<li>優しくウイルス含有培地 2 ml に予め温めておいた DMEM の 10% を取り替える政府短期証券、37 ° C で一晩インキュベートし、</li>
		<li>優しく NIH 3T3/媒体を 2 mL に予め温めておいた DMEM 10 %fbs 含むピューロマイシン (2 μ G/ml) に置き換えます。</li>
		<li>37 ° C ・ ピューロマイシン 3 日おきに更新中慎重に、中が黄色の文化。</li>
		<li>感染後 10-12 日、各ウェルから培地を吸引、PBS でやさしく洗浄します。</li>
		<li>クリスタル バイオレット溶液 (0.5% 20% エタノールと dH2O でクリスタル バイオレット)、1 mL で常温では、2 分を汚し、慎重に PBS で 2 回洗います。</li>
		<li>顕微鏡 (倍率 X4) 各ウェルに存在の青いコロニーをカウントします。コロニーを守らなければなりませんない負の制御にも。</li>
		<li>TU/ml の希釈倍率を考慮した数字の合計を計算します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 拡張と 32D/-r-CSF G 細胞の維持
<ol><li>32D/G-CSF-R セルが固定されている場合、因数を取ると雪解けの 1 分の 37 ° C の水浴のセルと直接に 10% に予め温めておいた RPMI 1640 培の 10 mL バイアルから細胞を注ぐ 15 mL チューブに FBS。反転チューブ 3 回し、400 × g にセルをスピンダウンは、上清を除去し、IL 3 0.3 × 106セル/mL の濃度で含まれている培地の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>最適な細胞成長濃度は 0.25 0.5 × 106セル/mL。セルを分割する濃度 0.1 0.2 × 10 にそれらをもたらす 2 日ごと6セル/mL。 注: (重要) 32D/G-CSF-R セルは部分的に 1 × 106セル/mL 以上の濃度に成長した場合を区別するために彼らの能力を失う可能性があります。したがって、時間に 32D/G-CSF-R セルを分割するのに非常に重要です。</li>
	<li>必要に応じて、凍結し、-80 ° c または液体窒素中での時間の長い期間のセル因数を格納します。スピン ・ ダウン 3 × 106細胞培養上清を削除し、凍結培地 1 mL で再懸濁します。-80 ° C で凍結容器にチューブを入れる長期保管のため液体窒素のセルの位置を変更します。</li>
</ol>3. 32D/-r-CSF G 細胞の情報伝達
<ol><li>0.3 × 106セル/mL の濃度で 6 ウェル プレートにプレート 32D/G-CSF-R セルです。</li>
	<li>10 と 40 の間の MOI (感染症の多様性) に到達するウイルスの適切な量を追加します。 注: 高い MOI は興味の遺伝子の発現の高いレベルと同様に、GFP+細胞の増加の割合になります。10; の MOI で 0.3 × 106に感染するには、細胞の例。3 × 106 TU 32D/G-CSF-R セルに追加する必要があります。</li>
	<li>最終濃度 8 μ g/mL に polybrene を追加し、37 ° C で 6 時間インキュベートまたは、スピン接種手順を実行: スイング バケツ ローターを用いた培養プレートに 30 ° C で 90 分 1200 × g で遠心し、37 ° C で 3 時間インキュベート</li>
	<li>収集細胞は 15 mL チューブに移し、5 分 (4 ° C) 450 × g でスピンします。</li>
	<li>上澄みを廃棄、6 ml の培地の小球形にされた細胞を再懸濁します、37 ° C でコート t25 フラスコ細胞培養用フラスコ、文化が、</li>
	<li>48 時間後に、細胞を収穫し、450 の × g で 5 分 (4 ° C) で、それらをスピンします。上清を捨てます。</li>
	<li>GFP レポーターの場合: 流れの cytometry の選別機を使用して PBS と並べ替えの GFP+セルを 500 μ l 添加にセルを配置します。ベクターを含むピューロマイシン レポーターの場合: 2 μ g/mL ピューロマイシンを含む培養液中の細胞を配置。</li>
	<li>さらなる分析と実験に必要なセルを展開します。 注: (オプション) Transduced セルできます-80 ° C の凍結容器でメディアを凍結で冷凍、さらに液体窒素で保存します。</li>
</ol>4. 32D/G-CSF-R セル拡散の試金
<ol><li>増殖率場所 0.2 × 106細胞培養培地 1 mL を評価し、37 ° C で一晩インキュベート</li>
	<li>次の日はセルの数をカウントし、0.2 × 10 の6セル/mL の培養液を使用しての濃度に戻るそれらを希釈します。37 ° C で一晩インキュベートします。細胞濃度および表 3を使用して毎日文化に適用される希薄の記録を保持します。</li>
	<li>増殖を評価する必要がある日数の 4.2 の手順を繰り返します。 注: 増殖アッセイの長さは、興味の遺伝子の影響に依存します。強い表現型の場合 8-9 日は (参照してください図 3 a) 有意な効果を観察するための十分な可能性があります。ただし、軽度の表現型の場合、時間の長い期間は必要あります。</li>
	<li>表 3に示すように増殖曲線を作る、細胞増殖を評価します。</li>
</ol>5. 32D/G-CSF-R 細胞分化アッセイ
<ol><li>0.2 × 106 32D/G-CSF-R 細胞サイトカインなし RPMI 培地で 2 回洗います。 注: 残留 IL 3 の存在が分化を阻害するので文化への G-CSF の添加前に洗浄のステップは重要です。</li>
	<li>細胞濃度 0.2 × 106セル/mL (0 日目) の結果、24 ウェル/プレートで 1 mL 分化培地 (100 ng/mL、G-CSF を含む) にセルを配置します。37 ° C で一晩文化</li>
	<li>細胞/ml (ステップ 1.2.1) 上記の数をカウントします。</li>
	<li>Cytospin 2 5 × 104セル (76 mm × 26 mm) スライド ガラスに遠心分離機を用いた 20 × g で必要なアダプターです。</li>
	<li>24 ウェル/プレート (1 日) に 0.2 × 105セル/mL の濃度で分化培地とプレート細胞を更新します。古い板を廃棄して続行するステップ 5.6 新しいプレートとの次の日。</li>
	<li>2 に 7 日 5.5 5.3 の手順を繰り返します。手順 4 で説明した G-CSF の存在下で細胞増殖を評価します。 注: (重要) 分化、細胞増殖が遅く、したがって G-CSF の存在下で 3 〜 4 日後より高い濃度で培養細胞に十分です。</li>
	<li>細胞の形態に基づく 32D/-r-CSF G 細胞の分化状態を評価します。<ol>
<li>常温 5 分のメタノールのステップ 5.4 からセルを修正し、風乾するスライドを残します。 注: 0 に 7 日目からスライドすることができます RT に格納されているし、同時に固定します。同様に、彼らも保存できます RT で固定後より長い一定期間のため。</li>
		<li>次の製造元のプロトコルを汚す 5 月グリューンヴァルト ギムザを使用してセルを汚します。</li>
		<li>顕微鏡と X40 の倍率を使用して染色の細胞を可視化します。</li>
		<li>爆発、中間分化した細胞は、および図 1と表 4で説明のイラストを使用して成熟した顆粒球の数を定量化します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

実験的なモデルの選択は、研究の主要な課題の 1 つです。主な動物やヒトの細胞は、最も生物学的に関連するデータを生成すると考えられている、これらのモデル倫理的な問題を伴うことがあります、高価なまたは洗練された養殖/分離のプロシージャに関連付けられていることが多い。一次電池の数は限られて、それらは遺伝的に操作するは難しい。さらに、一次電池はデータ解釈<sup class="...

造血幹・前駆細胞の人口の成熟細胞は、骨髄系 (好中球、好酸球、好塩基球、単球) から細胞を含む広い範囲から有機物を供給します。造血幹細胞の骨髄系細胞の生産を運転するプロセスはイエウサギと呼ばれ、十分な生産要求の変化への応答で成熟した骨髄系細胞がストレスと生物の適切な対処のための前提条件感染症や出血量などの条件。成熟した骨髄系細胞の分泌不足は、病原体、減らされた血凝固および他の生命にかかわる条件1,の2を除去する無力をもたらすかもしれない。さらに、骨髄系開発の変化が急性骨髄性白血病 (AML)3などの造血器腫瘍に関連付けられてあります。細胞表面の受容器4、トランスクリプション要因5の変更された式の欠陥障害シグナリング経路6形成の突然変異のように、様々 な理由によってイエウサギの変化が発生する/遺伝子7、または8腫瘍サプレッサーの遺伝子の不活化の活性化。
様々 な方法は、骨髄性の開発を研究し、このプロセスで特定の遺伝子変異の影響評価開発されています。イエウサギを研究するために使用する一般的なアプローチは、初代培養細胞およびトランスジェニック マウスを含みます。これらのモデルは、生物学的関連性の高いデータの取得を許可する、しかし彼らは特定の制限があります。一次電池の使用細胞の限られた数および遺伝子発現とその後の生物学的または生化学的な分析を変更する可能性を絞り込む、文化の制限期間が発生します。トランスジェニック マウスは高価であり、生物学的正当性の合理的な程度を必要とします。さらに、体内モデルでの作業は、特定のプロセスの興味の遺伝子の役割を理解することの複雑さの程度を追加します。したがって、これらの制限を回避するために代替的なアプローチが必要です。細胞は疑う余地のない利点を持っている: (1) 彼らは生化学的・生物学的研究のための十分な材料を生成することができます無制限の増殖能力を持っている、(2) 彼らは (ノックダウン、ノックアウト、遺伝子操作を受けやすい過剰発現)、(3) コストは比較的低く、(4) 彼らは特定の実験的アプローチに必要な生物学的簡素化の程度を許可します。
親の IL 3 (インターロイキン-3) 依存 32D セルライン グリーンバーガーおよび同僚によって、友人マウス白血病ウイルス9C3h/hej マウス骨髄細胞の感染によって 1983 年に設立されました。いくつか 32D クローンは文献で記述されていた: cl 239cl 3 の10、および cl 1011。32D cl 3 細胞は IL 3 に増殖し、顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)10の治療に好中球に分化する示されていた。それどころか、もともとは G-CSF の治療に反応ながら IL 3 依存 32D の cl-10 セルを区別することがないです。1995 年に博士 Ivo Touw のグループは、この受容体11の機能的に重要な領域を識別するために野生型と G-CSF 受容体 (G CSF R) の変異形 32D の cl-10 セルを遺伝子導入。本研究により IL 3 に同様に依存している、32D/G-CSF-R のセルの生成が、細胞が増殖、成熟好中球に分化する不可逆的停止 g-csf IL 3 の交換後 6 ~ 10 日以内。これらの特性は、32D cl 3 と 32D/G-CSF-R セル 2 つの明確に定義された成長と分化因子 - IL 3 と G-CSF によって変調することができますマウスの好中球分化の簡略化モデルを作る。最後の十年の間に複数のグループは、文化12,13,14,15骨髄細胞の分化と増殖における特定の遺伝子の役割を研究するのに 32D/G-CSF-R セルを使用しています。,16、G-CSF シグナル17,18を検討します。重要なは、この細胞ラインを使用して得られた結果は、初代培養細胞およびトランスジェニック マウス16,19,20,21で得られるデータと相関。したがって、この問題に対処する他の方法と並行して使用することができます骨髄性の微分を調査する貴重なシステムを表す 32D/G-CSF-R セル、広く使用され、確立されたモデルであると考えます。
ここでは、32D/G-CSF-R セル行の処理を説明する詳細なプロトコル、どのカバー拡大、分化およびこれらの細胞の分化・増殖の評価が表示されます。32D/-r-CSF G 細胞の遺伝の変更の詳細については、ウイルスの滴定のためのプロトコルと同様に、レトロ ウイルスやレンチ ウイルスの伝達によっていずれかが提供されます。また、32D/-r-CSF G 細胞の潜在的なアプリケーションを示すいくつかの代表的な結果が提供されます。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 powder medium</td><td>Merck, Kenilworth, NJ, USA</td><td>T 121-10</td><td>without NaHCO3, with L-glutamine</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15028</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>31985-047</td><td>L-Glutamine, Phenol Red</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA)</td><td>MT35011CV</td><td>For differentiation of 32D/G-CSF-R cells</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>10270</td><td>Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells</td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>S9137</td><td>Streptomycin sulfate salt powder</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>murine IL-3</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>human G-CSF</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td><td>300-23</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine</td><td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td><td>23966</td><td>Linear, MW 25,000 (PEI 25000)</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>VWR Chemicals, Radnor, PA, USA</td><td>0458</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&amp;uuml;nwald Giemsa</td><td>DiaPath, Martinengo, BG, Italy</td><td>10802</td><td></td></tr></tbody></table>

proliferation and differentiation of murine myeloid precursor 32d/g-csf-r cells

造血幹・前駆細胞の生物学の理解では、再生医療と血液病理の治療にとって重要な意味を持ってください。生体内でモデルや初代培養を使用して得ることができる最も関連性の高いデータ、にもかかわらず造血幹・前駆細胞の低豊富はかなり彼らの調査のための適切な技術のプールを制限します。したがって、細胞の使用は、上映または大規模な細胞数を必要とする試金のパフォーマンスのための生物材料の十分な生産できます。ここで詳細な説明、読み出し、イエウサギと好中球の分化に関与するプロセスの調査のために使用されている増殖・分化アッセイの解釈を提案します。これらの実験は、IL 3 存在下で増殖し、G-CSF で区別する能力を持って 32D/G-CSF-R サイトカイン依存マウス骨髄細胞ラインを採用しています。32D/G-CSF-R セルを処理するためのプロトコルを最適化を提供し、議論する主要な落とし穴とデメリット説明アッセイと予想される結果を危険にさらす可能性があります。さらに、この資料には、レンチ ウイルスやレトロ ウイルスの生産、滴定、および 32D/-r-CSF G 細胞の情報伝達のためのプロトコルが含まれています。機能分子研究一次造血幹・前駆細胞や生体内でモデルで得られた結果を補完することができますを正常に実行するこれらの細胞の遺伝的操作を用いることができることを示す.

32D/-r-CSF G 細胞の増殖と分化
32D/G-CSF-R pro 増殖とプロの分化条件下で細胞の増殖を評価するために IL 3、G-CSF をそれぞれ含んでいる媒体で 32D/-r-CSF G 細胞を培養されました。IL 3 含む媒体 (10 ng/mL) で培養された細胞分割 (図 2 a) すべて 24 h 約であることが観察されました。徐々 に減速し、4 日 (<strong class="xf...

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Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

ここでマウス骨髄前駆体 32D/G-CSF-R 細胞株を培養、ウイルス感染および増殖と分化アッセイを行う目的として詳細なプロトコルが表示されます。この細胞株は、骨髄性細胞と骨髄細胞の増殖および好中球分化の興味の遺伝子の役割を勉強に適しています。

マウス骨髄前駆体 32D/G-CSF-R の増殖・分化細胞

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

proliferation-differentiation-murine-myeloid-precursor-32dg-csf-r

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K ビュー.  Institute of Molecular Genetics of the ASCR. ここでマウス骨髄前駆体 32D/G-CSF-R 細胞株を培養、ウイルス感染および増殖と分化アッセイを行う目的として詳細なプロトコルが表示されます。この細胞株は、骨髄性細胞と骨髄細胞の増殖および好中球分化の興味の遺伝子の役割を勉強に適しています。

ビデオ: Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of acute leukemia. However, the nature of this disease has not been well documented in the literature. Here, we provide a technical protocol for characterizing C1498 cells in vitro and for determining the nature of the induced leukemia in vivo. The first part of this procedure is focused on determining the hematopoietic lineage and the stage of differentiation of cultured C1498 cells. To achieve this, multi-parametric flow cytometric staining is used to detect hematopoietic cell markers. Immunofluorescence microscopy, cytochemistry and a May-Gr&#252;nwald Giemsa staining are then performed to assess the expression of myeloperoxidase, the activity of esterases and cellular morphology, respectively. The second part of this protocol is dedicated to describing the leukemia disease that is induced in vivo. The latter can be achieved by determining the frequencies of leukemic and inherent cells in the blood, hematopoietic organs (e.g., bone marrow and spleen) and non-lymphoid tissues (e.g., the liver and lungs) using specific staining and flow cytometry analyses. The nature of the leukemia is then confirmed using May-Gr&#252;nwald Giemsa staining and staining for specific esterases in the bone marrow. Here, we present the results that were obtained using this protocol in age-matched C1498- and PBS-injected mice.

This manuscript provides a technical procedure that can be used to characterize C1498 cell cultures in vitro and the acute leukemia induced in mice after their injection. Phenotypic and functional analyses are performed using flow cytometry, immunofluorescence microscopy, cytochemistry and May-Gr&#252;nwald Giemsa staining.

マウスC1498細胞株およびその関連白血病マウスモデルを特徴付けるための詳細なプロトコル

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

がん研究

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞の培養

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

生物学

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the mature Schwann cell fate. We subjected rat and human MSCs to transient hypoxic conditions (1% oxygen for 16 h) followed by expansion as neurospheres upon low-attachment substratum with epidermal growth factor (EGF)/basic fibroblast growth factor (bFGF) supplementation. Neurospheres were seeded onto poly-D-lysine/laminin-coated tissue culture plastic and cultured in a gliogenic cocktail containing &#946;-Heregulin, bFGF, and platelet-derived growth factor (PDGF) to generate Schwann cell-like cells (SCLCs). SCLCs were directed to fate commitment via coculture for 2 weeks with purified dorsal root ganglia (DRG) neurons obtained from E14-15 pregnant Sprague Dawley rats. Mature Schwann cells demonstrate persistence in S100&#946;/p75 expression and can form myelin segments. Cells generated in this manner have potential applications in autologous cell transplantation following spinal cord injury, as well as in disease modeling.

Marrow stromal cells (MSCs) with neural potential exist within the bone marrow. Our protocol enriches this population of cells via hypoxic preconditioning and thereafter directs them to become mature Schwann cells.

成熟シュワン細胞の発生源としての骨髄由来前駆細胞の低酸素プレコンディショニング

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

発生生物学

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine induced differentiation of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells to the four myeloid lineage cells. CD34+ cells are isolated from human umbilical cord blood and co-cultured with MS-5 stromal cells in the presence of cytokines. Immunophenotypic characterization of the stem and progenitor cells, and the differentiated myeloid lineage cells are described. Using this protocol, CD34+ cells may be incubated with small molecules or transduced with lentiviruses to express myeloid disease mutations to investigate their impact on myeloid differentiation.

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Here, we present a protocol for immunophenotypic characterization and cytokine induced differentiation of cord blood derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells to the four myeloid lineages. The applications of this protocol include investigations on the effect of myeloid disease mutations or small molecules on myeloid differentiation of the CD34+ cells.

ヒト臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞のパンミエロイド分化

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

マウスの骨髄からGM-CSF由来肺胞のようなマクロファージや樹状細胞の生成および同定

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

免疫・感染学

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

大量の骨髄前駆細胞と新規セルソーティング戦略を使用してマウスの骨髄から樹状細胞前駆体の生成

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state against self-antigens as well as antigens derived from commensal organisms. The disruption of this immune homeostasis can lead to chronic inflammation and to the development of autoimmunity. Dendritic cells (DCs) are the professional antigen-presenting cells of the innate immune system involved in activating na&#239;ve T cells to initiate immune responses against foreign antigens. However, DCs can also be differentiated into TolDCs that act to maintain and promote T cell tolerance and to suppress effector cells contributing to the development of either autoimmune or chronic inflammation conditions. The recent advancement in our understanding of TolDCs suggests that DC tolerance can be achieved by modulating their differentiation conditions. This phenomenon has led to tremendous growth in developing TolDC therapies for numerous immune disorders caused due to break in immune tolerance. Successful studies in preclinical autoimmunity murine models have further validated the immunotherapeutic utility of TolDCs in the treatment of autoimmune disorders. Today, TolDCs have become a promising immunotherapeutic tool in the clinic for reinstating immune tolerance in various immune disorders by targeting pathogenic autoimmune responses while leaving protective immunity intact. Although an array of strategies has been proposed by multiple labs to induce TolDCs, there is no consistency in characterizing the cellular and functional phenotype of these cells. This protocol provides a step-by-step guide for the development of bone marrow-derived DCs in large numbers, a unique method used to differentiate them into TolDCs with a synthetic triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid-difluoro-propyl-amide (CDDO-DFPA), and the techniques used to confirm their phenotype, including analyses of essential molecular signatures of TolDCs. Finally, we show a method to assess TolDC function by testing their immunosuppressive response in vitro and in vivo in a preclinical model of multiple sclerosis.

Here, we present a protocol to develop and characterize tolerogenic dendritic cells (TolDCs) and evaluate their immunotherapeutic utility.

開発とマウス免疫寛容樹状細胞の機能解析

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

医学

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

マウス骨髄由来の樹状細胞とマクロファージの蛍光融合タンパク質の発現

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Activation of Mouse Bone Marrow-Derived Macrophages in Response to Antibodies

Source: Kozicky, L. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56689">Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate the activation of bone marrow-derived macrophages in response to bacterial lipopolysaccharide and intravenous immunoglobulin.

抗体に応答したマウス骨髄由来マクロファージの活性化

Source: Kozicky, L. et al., Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation. J. Vis. Exp. (2017)
In ...