Name: automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body
Uploaded: 2018-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body at JoVE.com

そのスライドが第三人間サイド バイ サイドと 2 番目の顕微鏡比較として使われたサブリナ ノーランと同様、スライドの 2 番目の人間サイド ・ バイ ・ サイド比較として使われていたアンソニー ・ ボーエンを認識したいと思います。

1. インドのインク スライドの準備
<ol><li>スライドにクリプトコッカス サンプルの 10 μ L をピペットします。すべての円形の酵母が動作しますが、この実験のため H99 は使用される唯一のひずみ。 注: 文化メディアから直接サンプルの場合は、1:2 PBS または水で希釈すること防ぐことができますインドのインク群生します。</li>
	<li>2 μ L のサンプル上にインドのインク汚れをピペットし、ミックスを物理的にピペット チップをサンプルにプッシュおよびインドのインクが均等に配置された表示されるまで円を描くように移動します。</li>
	<li>サンプルに、やさしく均等にサンプル上、coverslip の反対側を下げる、スライドの表面に対して coverslip の左端を押しながら観察を置きます。</li>
	<li>5 分間乾燥空気にスライドを許可します。</li>
	<li>軽くシールを形成およびインドのインク汚れを保持する coverslip 罫線にマニキュアの発光層を適用します。</li>
</ol>2. 画像スライド
<ol><li>カメラの付属品および知られているピクセル-ミクロン変換明視野顕微鏡でスライドを配置します。細胞カプセルが明確と細胞体は焦点を当て、暗いバンド フィルター、目標、およびコントラストを調整します。 注: さまざまなフィルターがあり、目的、およびコントラストの設定は、動作しますが、目的、Ph1 のフィルター、および 2 × 2 ビン × 20 が推奨されます。</li>
	<li>ビューのフィールドは密がクリプトコッカス細胞、細胞カプセルと背景のコントラストがはっきりとない過密、暗いバンドとして視覚化細胞体で正しく焦点を確認します。 注: サンプルや使用目的に応じて最適な画像のための細胞の正確な数が異なります。セルがないクラスター化または重複を確認する重要な側面が、細胞の焦点面が大幅に変化しない、重要なインドのインクがあることを染色 (フィールドの少なくとも 25%) の背景にはっきりと見える。</li>
	<li>単一ディレクトリ内の画像の計測アルゴリズムが実行され、出力データをイメージ ファイルの名前によると整理すると明確なタイトルを持つ単一のディレクトリに画像を保存します。</li>
</ol>3. アルゴリズム設定
<ol><li>Python のバージョン 2.7 をインストールします。</li>
	<li>「Pip インストール枕」コマンドを実行して追加 python ライブラリをインストールし、"pip は、openpyxl をインストール"します。</li>
	<li>次の手順に従って、MATLAB をインストールします。</li>
	<li>ビルド https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html で提供される指示に従い、MATLAB の python ライブラリ。</li>
	<li>この原稿の補足資料 ("QCA.py"、"Analysis2.m"、"TestRun.m") に含まれている 3 つの必要なファイルをダウンロードします。 メモ: これらのファイルは任意の場所に解凍することができますが、すべての 3 つは、同じディレクトリにある必要があります。</li>
</ol>4. アルゴリズムの使用
<ol><li>QCA.py をダブルクリックして、アプリケーションを実行します。 注: アプリケーションを起動するのに数分をかかる場合があります。"QCA.py"ファイルには、実際のアルゴリズムを実行する".m"ファイルを呼び出すプログラムの構造が含まれています。</li>
	<li>プログラムに記載されている手順に従います。<ol>
<li>入力画像ファイルの拡張子の前にピリオドをセミコロンで区切る (ex.」。TIF;。"jpeg) し、 Enterボタンをクリック。</li>
		<li>画像ファイルがあるディレクトリの選択]ボタンをクリックすると画像が含まれているフォルダーを選択するディレクトリを選択します。</li>
		<li>イメージ リストの生成ボタンをクリックしてディレクトリ内の画像ファイルのリストを生成します。画像は、右側のテキスト ボックスに表示されます。確認し、リストが正確で完全なことを確認します。</li>
		<li>ランダム イメージの選択] ボタンをクリックしてプレビューとして使用するリストからランダムな画像を選択します。 注: イメージは「誤ったイメージ モード エラー」のために開くことができる、アルゴリズムがまだ正しく動作にもかかわらず画像が表示されません。4.2.7 のステップの後、テスト画像が表示されます。</li>
		<li>対物レンズとビニング設定を入力します。既定の設定で使用される顕微鏡が一致しない場合「カスタム ピクセル変換」を選択し、画像ファイルのピクセル-に-um 変換を入力します。一度選択すると、変換の計算ボタンをクリックし、変換が右側のテキスト ボックスによると正しいを確認します。 注: x 倍率と 2 × 2 ビン選択 40 と図 1に示すように代表的な画像を求めた。</li>
		<li>円検出のアルゴリズム パラメーターを入力します。<ol>
<li>Min と Max カプセル半径エントリとして外側のカプセル検出の検出可能な最小値と最大半径を入力します。小さい範囲はより正確な結果になります。</li>
			<li>Min と Max の細胞体半径のエントリとして細胞体検出の検出可能な最小値と最大半径を入力します。 注: これらのエントリのすべての 4 つは、ソース画像によるとそれぞれの値 (ピクセル単位) を表す番号をする必要があります。</li>
			<li>アルゴリズムの感度閾値を調整するカプセルと細胞体感度のスライダーを移動します。低感度に厳格される偽の肯定的な円検出の削減、少ない真円の検出可能性がありますも。逆に、感度の高い検出率は増えますが、偽肯定的なサークルもあります。 注: 代表的な結果は、7 の最小カプセル半径、最大 45 カプセル半径、最小体半径 4、30 の本文の最大半径、87、カプセルの感度と 87 の体感度が得られました。</li>
		</ol>
</li>
		<li>テストの実行ボタンをクリックして、ランダムに選択したイメージのパラメーターをテストします。結果は、元のイメージの交換プログラムの上部中央に表示されます。正確な検索の結果場合は、同様に選択したパラメーターはすべて選択した画像に収まることを確認しようとする追加のランダムなイメージを選択することをお勧めします。<ol>
<li>ボディの数を最大化し、カプセルが検出され、正しく収まるように円が表示されるかどうかを目視で確認します。検出されたカプセル内に遺体を数は、右側にテキスト ボックスに表示されます。それ以外の場合、結果が正確になるまでは、アルゴリズム パラメーターを操作します。 注: 濃い色のついた丸は、可視化を支援するだけです。測定用に生成された実際のサークルは、HCT アルゴリズムによって計算される数学的な曲線です。</li>
		</ol>
</li>
		<li>画像ファイルのディレクトリ全体に検出アルゴリズムを実行するには、 [分析の開始] ボタンをクリックします。各イメージ分析を行い、プログラムが表示されます「終了」、右側のテキスト ボックスにすべての画像の分析が完了したとき。</li>
		<li>一致およびクリーンアップ] ボタンをクリックします。彼らは内に存在する検出されたカプセルに検出された細胞体に一致、カプセルから身を引いて真のカプセルの半径を計算します。 注: 蛍光を検出するアルゴリズムが使用されている場合のみ 1 つの円がある別の状況はこの手順を検出必要はありません。代わりに引いて体のみまたはプル カプセルのみボタンそれぞれのみ、青または緑の円のみのデータを収集するをクリックします。カプセルのデータが取得される場合にのみ、半径が参照するセルの合計半径細胞体の半径を引かれませんよう注意することが重要です。</li>
		<li>画像ディレクトリの"CleanedOuput.csv"ファイルに完成品のデータを検索できます。1 つのデータを選択した場合にのみ、ファイルは"CleanedBodies.csv"または"CleanedCapsules.csv"ラベルがされます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii,+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis.">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).</li><li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cryptococcal+Capsule+in+Pathogenesis+of+Cryptococcal+Meningitis.">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), 007 (2013).</li><li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection.">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis.">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Araujo, G. d. e. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells.">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+CAP59+(or+Cap59p)+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan.">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li><li>Guimar&#227;es, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+responds+to+mannitol+by+increasing+capsule+size+in+vitro+and+in+vivo:+Mannitol+impacts+the+structure+of+C.+neoformans+capsule.">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Capsule+Growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+Mammalian+Serum+and+CO2.">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li><li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates.">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li></ol>

著者はある利益相反を開示します。

この手法の重要なステップはインドのインク スライドを準備、顕微鏡画像を取得します。さまざまなスライドと画像技術が正常にテストされてアルゴリズム間の推奨プロトコルはこの原稿で説明されます。これらの粒子が大きすぎて多糖類の線維ネットワークに侵入すると、カプセルのドメインからインドのインク粒子の排除に基づく多糖類カプセルが検出されました。インドのインク除外は、暗い背景の上に明るい円の結果します。アルゴリズムでは、どれだけうまく彼ら彼らの背景とは対照的に基づく円を検出します。このように、重いインドのインク汚れは多糖類のカプセルと背景、信号対雑音比を向上、改善結果品質の高いコントラストになります。逆に、細胞体は明るい背景の上に暗いサークルとして検出されます。細胞体がフォーカル プレーン顕微鏡を設定する拡散反射光として表示される灰色の上部の円または下端とセルの中心に凝縮した濃いバンドとしてに基づいて外観が変更されます。同じ理由ですでに説明した、この結果円検出の最も正確な、細胞体が凝縮、暗いバンドとして表示される焦点面はイメージ獲得のため使用してください。
ここで報告する方法は、いくつかの変更とトラブルシューティングのラウンドを通じて進行しています。アルゴリズムは最初セルが 4 よりも小さいされないだろうことを期待してコード化されたまたは使用した顕微鏡に基づく 60 ピクセルよりも大きい。異なる倍率とこれらの制限はプロトコルで説明されているユーザー入力フィールドによって取り替えられた代わりにセルのサイズにこのアルゴリズムのアプリケーションを展開します。ユーザーは、最大精度の実験ごとに固有のパラメーターを入力ようになりました可能性があります。このアルゴリズムは、クリプトコッカスカプセル測定外の状況に適用されている場合、サンプルの生成および撮像方法を決定する一連の範囲の条件を見つけることを最初のセットを勧めします。
この手法の最も重要な制限は、心、すなわちクリプトコッカス カプセルの測定の特定のアプリケーションで設計されているです。追加のアプリケーションに合わせて簡単に変更できる、このスクリプトは直接上記カプセル測定プロトコルに適用されます。ただし、この制限は、その分野に関しては、既存のメソッドにこのメソッドの意義を説明します。また、出芽酵母のみ親セルのサイズを測定したい捜査官の問題が発生します。このアルゴリズムは、ユニークな細胞 (図 S2A) として芽を検出が可能です。まず、これは芽測定を削除または、それができない場合、両方のセルを削除したいと思いますその場合決定サークルは芽を検出すると、調査官が親である場合問題をすることができます。第二に、これは芽がアルゴリズムのケースが参考に親カプセル芽を測定する親カプセル (図 S2B) の範囲内でまだ細胞体として検出された場合別の問題を引き起こします。この例では 2 つのカプセル内に各細胞体が存在するので、2 回に各セルがカウントされます。これらの問題のいずれかは、プロトコルが終了したら簡単に対処できます。最終のデータ セットは、個々 の細胞は、元になった画像ファイルと x に従って分類されるを検出する場所スプレッドシートとして表示されますと細胞体 (図 S3) の y 座標。捜査官は、単に検索して芽に一致するデータを除外できます。カプセルのサイズにもかかわらず重要な重くクリプトコッカスフィールドはまだカプセルの測定またはイメージの獲得のための標準のプロトコルを確立する病原性因子を調査しました。この手法は、最小限の前提条件と研究室を自由に利用できる正確で便利な方法でこれらの役割を埋めるために設計されました。
この手法の応用が主として他の実験に適用します。任意の画像による検出または円形の物体の計測はこのアルゴリズムを解析する必要があります。蛍光顕微鏡画像は、個々 のレーザー チャンネルにアルゴリズムを適用することによって分析できます。細菌のコロニー カウント達成することができ、ガラクトース記者間区別することが追加変更と。酵母コロニー成長アッセイは、植民地領域のサイズを推定するこのアルゴリズムを使用しても評価でした。

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンス免疫抑制の人口に主にひと疾患に関連付けられている世界中で普遍的見つける病原性酵母です。クリプトコッカスは、特に感染症1のためのサハラ以南アフリカで合計年間死亡の重要な原因を占めています。クリプトコッカス感染症の主な臨床症状は髄膜脳炎は、感染させた大食細胞 (トロイの木馬方法) の輸送によって中枢神経系の侵略に続くまたは血液-脳関門の直接交差。クリプトコッカスは、人間の体温、ウレアーゼ活性、メラニン化、多糖類カプセル2の形成で複製する機能を含むいくつかの病原因子を表しています。多糖類のカプセルは、環境ストレス、ホスト免疫反応2等に対する防護壁として glucuronoxylomannan と glucoronoxylomannangalactan ポリマーおよび関数を繰り返しので構成されます。
クリプトコッカス多糖類カプセルのサイズが一貫して関連付けられていない病原性、病態2,3,4、5の要因であることの証拠があります。 6,7。カプセル サイズ髄膜炎病理学6に関連付けられて、クリプトコッカス感染症5を制御するマクロファージの機能に影響を与えることができます、8不在の場合の病原性の低下を招きます。したがって、クリプトコッカスの研究では、一般的なカプセルのサイズ測定がカプセル測定方法の標準的な fieldwide はありません。
現在、クリプトコッカス多糖類のカプセル測定、顕微鏡画像の手動測定に基づいており、画像と計測の両方の買収の正確なメソッドは、研究所9,10、間で異なります 11。このメソッドの当面の関心事は、いくつかの研究では、精度と信頼性の維持を困難にする個々 の測定の何千もの取得を必要とします。さらに、結果を公開するときにもしばしばある測定法の不十分な説明。多くの出版物は彼らの測定値が得られた方法を説明しないかどうか、彼らは 1 つの測定を使用またはいくつか、または他の平均、半径または直径が使用されるかどうか、彼らはカプセルの識別のためのしきい値を決定する方法は、どのような焦点平面が使用されました。詳細。いくつかの出版物だけの状態プログラムとしての法を用い, 例えば、「Adobe Photoshop CS3 使用されたセルを測定する「11。標準化およびレポートの詳細のこの欠乏、再現困難不可能ではない場合。人間の視力、コンピューターの明るさ、顕微鏡設定の違いは、照明、スライドおよび他の要因は、ピクセルの明度の値の比率に基づいて計算は一定になりますが、個人間だけでなく、サンプル、間変わることができるとサンプルとの間に適用されます。この手法は、カプセルの前にどれもなかったフィールドのサイズを測定する標準化された、正確、迅速、簡単な手法を提供することのコンテキストで生成されました。
前述したように、CHT アルゴリズムは, 老舗し、サークルを自動的に検出するスクリプトは、前に書かれています。このメソッドは、他のスクリプトの短い秋、2 つの分野で向上します。まず、円を検出するだけ十分ではない、クリプトコッカス細胞 2 つの明瞭な円は互いに関連して検出する必要がありますので。このメソッドは具体的にカプセル内の細胞体を検出し、両者の差別、関連体カプセル ペアでのみ計算を実行します。第二に、でもときに続いて同じプロトコル、別の捜査官で終る異なる画像を取得しました。捜査官すべてアルゴリズム パラメーター制御を許可すると、このツールは、取得方法の広い範囲を一致するように調整できます。標準化されたスコープ、目的、フィルターの必要はありません。
この手法は、調査官がその背景とは対照的イメージ内の円の検出する必要がありますどのような状況に容易に適用できます。両方円軽量化とその背景を検出できるより暗くカウント、およびこの手法を用いて測定します。

<table><tbody><tr><td>India Ink</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>261194</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td>25x75x1</td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-B</td><td>22x22-1</td></tr><tr><td>Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td><td>Sally Hansen</td><td>N/A</td><td>109 invisible</td></tr><tr><td>SAB Media</td><td>Sigma</td><td>S3306</td><td></td></tr><tr><td>Cryptotoccus neoformans</td><td>ATCC</td><td>208821</td><td>H99 strain</td></tr><tr><td>Olympus AX70 Microscope</td><td>Olympus</td><td>AX70TRF</td><td>Discontinued ; Bright Field Microscope</td></tr><tr><td>Qimaging Retiga 1300</td><td>Qimaging</td><td>N/A</td><td>Discontinued ; Camera Microscope Attachment</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>Most recent version recommended</td></tr><tr><td>Python Programming Language</td><td>Python</td><td>N/A</td><td>Version 2 necessary ; 2.7 recommended</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>Most recent version recommended</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr></tbody></table>

automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body

このテクニックの目的は、多数多糖類カプセル測定の一貫性のある、正確、かつ管理可能なプロセスを提供することです。
まず、一意に各イメージの計算された強度値に基づくしきい値のイメージが生成されます。その後、円は、オブジェクトと老舗サークル Hough 変換 (CHT) アルゴリズムを使用して背景のコントラストに基づいて検出されます。最後に、検出された細胞カプセルとボディ中心座標と半径のサイズと一致し、データが管理可能なスプレッドシートのユーザーにエクスポートします。
この手法の利点は、シンプルだが重要なです。最初に、これらの計算は人間ではなく、アルゴリズムによって実行されるので精度と信頼性を向上します。 正確性や信頼性に関係なく、どのように多くのサンプルは、分析の減少はありません。第 2 に、このアプローチは、クリプトコッカスフィールド カプセル測定がラボによって現在の状況ではなく潜在的な標準操作手順を確立します。第三に、手動カプセル測定されますがゆっくりと単調なため、オートメーションは高スループット データ解析およびますます強力な統計を円滑に多数の酵母細胞の迅速な測定ができます。
この技術の主要な制限方法から来るアルゴリズム関数。まず、アルゴリズムだけ円が生成されます。クリプトコッカス細胞と彼らのカプセルで円形の形態にかかる、非円形オブジェクトを検出するこの手法を適用することは困難でしょう。第二に、円を検出する方法のため、CHT アルゴリズムはクラスター化されたいくつかの円の外側のエッジに基づく巨大な擬似円を検出できます。ただし、擬似サークル内でキャッチすべての誤って細胞体簡単に検出できその結果のデータ セットから削除されます。
この手法は、インドのインク明視野顕微鏡に基づくクリプトコッカス属円形多糖類のカプセルを測定用適用される可能性が他のコントラストは円形オブジェクトの測定を用いた。

画像は、カメラ (図 1A) と相まって明るいフィールド顕微鏡を使用してインドのインク スライドの顕微鏡観察によって得られる最初。細胞分離とセルと背景のコントラストを作成する十分な汚れを使用して、ビューのフィールドを同様負荷をかけないように十分に低密度を持つことが重要です。プロトコルで述べたように、最適な画像のための細胞の正確な数はサンプル、顕微鏡、および使用する目的によって異なります。セルがないクラスター化または重複を確認する重要な側面が、細胞の焦点面が大幅に変化しない、重要なインドのインクがあることを染色 (フィールドの少なくとも 25%) の背景にはっきりと見える。これらの指示は、平均画素の輝度値、標準偏差により各画像に固有のしきい値を決定するアルゴリズムを許可します。当該しきい値を上回る強度値を持つピクセルは白と見なされ、低い強度の値を持つ任意の黒と見なされます。結果の画像は、カプセルが (図 1B) を終了のはっきりと鮮明な区別をことができます。アルゴリズムは、カプセルの検出に基づく堅牢なブラックのコントラスト サークルし元のイメージは、細胞体の堅牢な黒に白円を提供します。検出されたサークルの代表的な可視化は、(図 1C) プログラムの一部として生成されます。すぐに処理された画像を解析し、結果が正確な表示を確保することができます。
最適な画像を取得する正確なプロトコルに従うことが不可欠です。サブ最適な画像は通常カプセルとインク (図 2A) との間のコントラストの不足から生じます。最適なコントラストと集録パラメーターはサンプル、実験、カメラ、顕微鏡モデル等によって異なります。最適な画像は、カプセルの外側のエッジは、インドのインクの染みの明確な対照そしてその背景と対照的で暗いバンドのように細胞体を絞っているところに、酵母が可能であれば、区切られている一つです。セルが多すぎますが、ビューのフィールドまたは汚れが軽すぎる場合は、ピクセルの輝度値がクラスターし、プログラムはカプセルのサイズ (図 2B) を解明できるしきい値を設定することはできません。サブ最適な画像を使用する場合プログラムできます不適切なサイズの円の検出、ない任意の円を検出することができるまたはしきい値画像 (図 2C) に基づいて複数の擬似円の検出。
細胞体はカプセルの白い背景の上の堅牢な黒い丸として視覚化する必要がありますという点で、同様の問題をもたらす細胞体を検出します。画像取得の目的の焦点面を記述するとき、この問題はプロトコルで扱われます。使用する最高の焦点面では、細胞体が暗い、集中されたバンド (図 3A) として表示されるあります。セルを正しく焦点があるので、このフォーカル プレーンは標準として受け入れられるです。これは、Uvitex、キチン染色 (図 3B) と細胞壁の可視化によって確認されました。Uvitex (、細胞体の上下が染色、ピント) センターで弱い信号で細胞壁を集中汚れが明らかに鮮明なを示しています。
また、ことを確認することが重要だったこの手法の開発にこのアルゴリズムはカプセルと細胞体の測定を正確に判断できます。上記の図に代表的なサークルが有望な中、実際の測定値と比較したコンピューター人間の測定。アルゴリズムは正確かつ信頼性の高いプロトコルが正確に使用され、最適な画像が得られる (図 4A)。ただし、プロトコルが正しく続いて貧しい染色、人口過密、または他の前述のパラメーターによる最適画像を取得、そのアルゴリズム人間測定 (図 4B を再現できない精度を失い、).以来、この手法はもともと特定の個人 (筆頭)、異なる個々 の染色と測定様式間の相違は次のプロトコルにもかかわらず精度に影響を与えるかどうか、それを使用する頼まれました。プロトコルを指示した (図 4C) として続いた限りこの手法が広く適用できることがわかった。同様に、インドのインク スライドの位相コントラスト画像を取得できる顕微鏡でこの手法を使用できます。アルゴリズムが正確に 3 分の 1 でこの実験は繰り返された他の顕微鏡のセットアップしたことを確認するには、別の明るいフィールド顕微鏡を用いた捜査官カメラと相まってし、手動で測定されたカプセルで検出されたカプセルの直径を比較して直径。コンピューターと人間の測定 (図 4D) との間に有意な差は認められなかった。
最後に、蛍光染色のコンテキストでこのアルゴリズムの応用を検討しました。蛍光イメージング ピクセル輝度のノイズ比率へのシグナルに基づいているので汚れが自然に円形限り、アルゴリズムは蛍光画像を容易に適用できるはずです。このアプリケーションは、Uvitex 染色 (図 5A, 5 b) に説明した画像から細胞体を正常に検出するアルゴリズムができたときに確認されました。ユーザーは、彼らの実験のアルゴリズム パラメーターを最適化するように、標準化されたプロトコルを将来的に任意の新しいアプリケーションを開発します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig1.jpg"> 図 1: 得られた最適なイメージの代表の結果。A.インドのインク スライドの明視野顕微鏡により獲得される初期の画像。B.しきい値を使用して作成されたバイナリ イメージは標準偏差に追加平均ピクセルの輝度値から計算されます。このしきい値を超えるすべての値は白を考慮され、すべての下は黒と見なされます。C.カプセル (緑) と、アルゴリズムによって検出された細胞体 (青) の可視化。すべての画像は、2 x 2 のビニングと 40 倍の倍率で得られました。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56957/56957fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig2.jpg"> 図 2: サブ最適取得画像の代表的な結果。A.明視野顕微鏡を通じて取得される最初のインドのインク スライド。特に明るい背景強度のグラデーションに染色ムラと不十分な結果します。B.結果バイナリのイメージ カプセルできない高いバック グラウンド信号による区別はっきり。C.複数のカプセルは検出されません。すべての画像は、2 x 2 のビニングと 40 倍の倍率で得られました。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56957/56957fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig3.jpg"> 図 3:検出細胞体。A.最寄りの焦点面を中心としたカプセルの明視野像。B.最寄りの焦点面に細胞体の蛍光イメージを Uvitex。2 x 2 のビニングと 100 倍の倍率で画像を得た。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56957/56957fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig4.jpg"> 図 4:アルゴリズム (黒) と人間 (グレー) の結果の比較分析。A.プロトコルに従ってスライドを用意して、最適な画像が得られるとき測定のかなりの違いはありません。B.プロトコルに従わない場合アルゴリズム正確に識別できずカプセルを測定します。ここで具体的には背景は矛盾していた、カプセルと背景のコントラストをオフがあった。T 検定で計算の大きな変化は、* P 値 0.05 < の。C.独立した調査官はプロトコルに従うし、その解析アルゴリズムとの比較を依頼されました。限り、画像が適正に取得した、観察者間で信頼性は維持されます。+ 2 番目の顕微鏡と第 2 独立した調査官は、個人やハードウェア アルゴリズム保持精度を確認に使用されました。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56957/56957fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig5.jpg"> 図 5: アルゴリズムの潜在的な代替アプリケーション: 同定と蛍光顕微鏡の測定。細胞体染色し Uvitex とのイメージを作成、アルゴリズムによって識別されます。検出された円を超える蛍光信号に基づくので何が細胞壁として標識されます。検出アルゴリズムは、信号 (細胞壁) の特に優秀な蓄積を識別するために図 1 bと2 bで表される初期のバイナリ イメージを生成するために使用するしきい値を変更することによってカスタマイズできます。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56957/56957fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/56957/56957supfig1.jpg"> 補足図 1: Windows 環境で実行されるアプリケーションの代表的なスクリーン ショットします。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56957/56957supfig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/56957/56957supfig2.jpg"> 補足図 2: 検出された新進の表現酵母細胞。スケール バーを表す 10 μ m. a.親セルと芽のそれぞれは、独自のカプセル内の個別のセルとしてカウントされます。B. A 親細胞と芽はそれぞれ独自のカプセルと他の携帯カプセルのために一度、合計 4 つのセルに 1 つの親と 1 つの芽から検出される 2 回カウントされます。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56957/56957supfig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/56957/56957supfig3.jpg"> 補足図 3: セルの検出と測定後の最終的なデータの表現です。イメージ ファイルは、元の画像の名前です。合計半径は、代表的な緑の円、カプセルと組み合わせて細胞体の半径を指します。カプセル x とカプセル y にこのデータを適用するカプセルの座標を参照してください。体の半径は、代表の青い円の半径を指します。カプセルの半径は、カプセルだけの半径の結果体半径マイナス合計の半径を指します。3.2.5 の手順でピクセル-ミクロン換算がユーザーに含まれている限り、これらの値はミクロンになります。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56957/56957supfig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body at JoVE.com

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

クリプトコッカスの種多糖類カプセルと細胞体の自動測定

この手法では、多糖類のカプセルと体の半径を測定するために設計された自動バッチ イメージ プロセッサについて説明します。クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスカプセル測定用にデザインしながらの自動画像処理プロセッサは円形オブジェクトの他の基づいて、コントラスト検出にも適用できます。

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

automated-measurement-cryptococcal-species-polysaccharide-capsule

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

7.2K ビュー.  Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health. この手法では、多糖類のカプセルと体の半径を測定するために設計された自動バッチ イメージ プロセッサについて説明します。クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスカプセル測定用にデザインしながらの自動画像処理プロセッサは円形オブジェクトの他の基づいて、コントラスト検出にも適用できます。

ビデオ: Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are available to quantify and compare capsule production between different strains or mutants, there is no widely used method for sorting bacteria based on how much capsule they produce. We have developed a method to separate bacteria by capsule amount, using a discontinuous density gradient. This method is used to compare capsule amounts semi-quantitatively between cultures, to isolate mutants with altered capsule production, and to purify capsulated bacteria from complex samples. This method can also be coupled with transposon-insertion sequencing to identify genes involved in capsule regulation. Here, the method is demonstrated in detail, including how to optimize the gradient conditions for a new bacterial species or strain, and how to construct and run the density gradient.

We demonstrate the use of discontinuous density gradients to separate bacterial populations based on capsule production. This method is used to compare capsule amount between cultures, isolate mutants with a specific capsule phenotype, or to identify capsule regulators. Described here is the optimization and running of the assay.

不連続密度勾配を使用してカプセルの量による細菌の分離

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

遺伝学

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

免疫・感染学

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within a cell, tissue, organ, biological fluid, or organism. Metabolomics traditionally focuses on water-soluble metabolites. The water-soluble metabolome is the final product of a complex cellular network that integrates various genomic, epigenomic, transcriptomic, proteomic, and environmental factors. Hence, the metabolomic analysis directly assesses the outcome of the action for all these factors in a plethora of biological processes within various organisms. One of these organisms is the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a unicellular eukaryote with the fully sequenced genome. Because S. cerevisiae is amenable to comprehensive molecular analyses, it is used as a model for dissecting mechanisms underlying many biological processes within the eukaryotic cell. A versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of the water-soluble metabolome would provide the essential methodology for dissecting these mechanisms. Here we present a protocol for the optimized conditions of metabolic activity quenching in and water-soluble metabolite extraction from S. cerevisiae cells. The protocol also describes the use of liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of the extracted water-soluble metabolites. The LC-MS/MS method of non-targeted metabolomics described here is versatile and robust. It enables the identification and quantification of more than 370 water-soluble metabolites with diverse structural, physical, and chemical properties, including different structural isomers and stereoisomeric forms of these metabolites. These metabolites include various energy carrier molecules, nucleotides, amino acids, monosaccharides, intermediates of glycolysis, and tricarboxylic cycle intermediates. The LC-MS/MS method of non-targeted metabolomics is sensitive and allows the identification and quantitation of some water-soluble metabolites at concentrations as low as 0.05 pmol/&#181;L. The method has been successfully used for assessing water-soluble metabolomes of wild-type and mutant yeast cells cultured under different conditions.

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol for the identification and quantitation of major classes of water-soluble metabolites in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The described method is versatile, robust, and sensitive. It allows the separation of structural isomers and stereoisomeric forms of water-soluble metabolites from each other.

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

生化学

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic yeast. Capsule size can vary widely between strains, has the ability to grow rapidly when introduced to stressful or low nutrient conditions, and has been positively correlated with strain virulence. For these reasons, the size of the capsule is of great interest to C. neoformans researchers. The growth of the C. neoformans capsule is induced during phenotypic testing to help understand the effects of different treatments on the yeast or size differences between strains. Here we describe one of the standard methods of capsule induction and compare two accepted methods of staining and measuring capsule diameter: (i) India ink, a negative stain, used in conjunction with conventional light microscopy and (ii) co-staining with fluorescent dyes of both the cell wall and capsule followed by confocal microscopy. Finally, we show how measurement of capsule diameter from India ink-stained samples can be automated using computational image analysis.

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule is the primary virulence factor in Cryptococcus neoformans, and its size correlates with strain virulence. Capsule diameter measurements are used in phenotypic testing and to gauge therapeutic efficacy. Here a standard method of capsule induction is presented, and two methods of staining and measuring diameter are compared.

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

生物工学

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

C. parapsilosis (Cp) is an emerging cause of bloodstream infections in certain populations. The&#160;Candida clade, including Cp, is increasingly developing resistance to the first and the second line of antifungals. Cp is frequently isolated from hands and skin surfaces, as well as the GI tract. Colonization by Candida predisposes individuals to invasive bloodstream infections. To successfully colonize or invade the host, yeast must be able to rapidly adhere to the body surfaces to prevent elimination by host defense mechanisms. Here we describe a method to measure adhesion of Cp to immobilized proteins under physiologic fluid shear, using an end-point adhesion assay in a commercially available multichannel microfluidic device. This method is optimized to improve reproducibility, minimize subjectivity, and allow for the fluorescent quantification of individual isolates. We also demonstrate that some clinical isolates of Cp show increased adhesion when grown in conditions mimicking a mammalian host, whereas a frequently used lab strain, CDC317, is non-adhesive under fluid shear.

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

Adhesion is an important first step in colonization and pathogenesis for Candida. Here, an in vitro assay is described to measure adhesion of C. parapsilosis isolates to immobilized proteins under fluid shear. A multichannel microfluidics device is used to compare multiple samples in parallel, followed by quantification using fluorescence imaging.

C. parapsilosis (Cp) is an emerging cause of bloodstream infections in certain populations. The&#160;Candida clade, including Cp, is increasingly ...

<meta charset="utf8"></head><body>スクロース分泌シアノバクテリアと真菌パートナーとの共培養のためのプロトコール

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being explored as a method for solar-driven bioproduction. One approach involves the use of CO2-fixing cyanobacteria that secrete organic carbon to support the metabolism of a co-cultivated heterotroph, which in turn transforms the carbon into higher-value goods or services. In this protocol, a technical description to assist the experimentalist in the establishment of a co-culture combining a sucrose-secreting cyanobacterial strain with a fungal partner(s), as represented by model yeast species, is provided. The protocol describes the key prerequisites for co-culture establishment: Defining the media composition, monitoring the growth characteristics of individual partners, and the analysis of mixed cultures with multiple species combined in the same growth vessel. Basic laboratory techniques for co-culture monitoring, including microscopy, cell counter, and single-cell flow cytometry, are summarized, and examples of nonproprietary software to use for data analysis of raw flow cytometry standard (FCS) files in line with FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable) principles are provided. Finally, commentary on the bottlenecks and pitfalls frequently encountered when attempting to establish a co-culture with sugar-secreting cyanobacteria and a novel heterotrophic partner is included. This protocol provides a resource for researchers attempting to establish a new pair of co-cultured microbes that includes a cyanobacterium and a heterotrophic microbe.

<meta charset="utf8"></head><body>従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

This protocol provides a comprehensive guideline for the setup and quantitative monitoring of co-cultures, including photoautotrophic sugar-secreting cyanobacteria and heterotrophic yeasts.

従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

クリプトコッカスの種多糖類カプセルと細胞体の自動測定

要約

さらに動画を探す

この動画の章

不連続密度勾配を使用してカプセルの量による細菌の分離

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエの定量的メタボロミクス

クリプトコッカス・ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定

数百個の C.アルビカン細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

クリプトコッカスの種多糖類カプセルと細胞体の自動測定

要約

さらに動画を探す

この動画の章

不連続密度勾配を使用してカプセルの量による細菌の分離

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエの定量的メタボロミクス

クリプトコッカス・ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定

数百個の C.アルビカン細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化