Name: measuring gene expression in bombarded barley aleurone layers with increased throughput
Uploaded: 2018-03-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
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著者は、グレイソン バトラーとマーガレット ・ バレットを実験、ジュディ石粒の均質化についてのアドバイスを蛍光についてのアドバイスをリン ・ ハナムの遂行に助けに感謝します。この作品は全米科学財団 (IOB 0443676) 支えられた制度開発賞 (アイデア) から国立科学研究所の一般医療 [許可番号 P20GM0103423、健康の国民の協会からの補助金コルビー大学自然科学部

1. エフェクターとレポーターの遺伝子の準備を構築します。
<ol><li>目的の開いたリーディング ・ フレームからドライブ式に構成プロモーター (例えばトウモロコシ ユビキチン、 UBI) を採用しているエフェクターの構造を構築します。たとえば、TaABF1 の5ドライブ強い恒常発現するUBI::TaABF1を含んでいるプラスミッドを構築します。</li>
	<li>ガスなどの開いたリーディング ・ フレームの上流側に配置その活動は測定されるプロモーターを含む記者構造を構築します。たとえば、 HVA1プロモーター2、5からの表現を測定するHVA1::GUSを含んでいるプラスミッドを構築します。</li>
	<li>内部統制構築を構築 (例えばUBI::ルシフェラーゼ)。</li>
	<li>シリカ結合列を使用して (材料の表を参照) をプロトコル、ごとに必要な遺伝子構造の高品質のプラスミッドの準備します。紫外分光法を用いた (参照材料表)、慎重にそれぞれのプラスミッドの準備の濃度を測定します。</li>
</ol>2. 大麦の爆撃の準備
<ol><li>スプレッドシートの設定 (例については図 1を参照) は、殺到するプラスミド、適切なホルモン治療と実験の一部となる各処置のための他の関連情報を示します。</li>
	<li>ヒマラヤ大麦 (実験に含まれている各治療のため 40) の穀物から胚を切ったまな板と滅菌のかみそりの刃を使用します。変色または平均より大幅に小さい粒を除外します。</li>
	<li>すべての無胚穀物を 50 mL チューブに配置します。10 分の水と岩石の 40 ミリリットルを追加します。</li>
	<li>慎重に (穀物を失うことを避けるため) に水を注ぐし、10% の漂白剤の 40 mL を加えます。20 分の岩。</li>
	<li>漂白剤を注ぐ、40 mL の滅菌水を追加します。5 分間ロック。この滅菌水洗浄を 4 回繰り返します。</li>
	<li>ラガータイプ ソリューション (コハク酸ナトリウム 20 ミリメートル、20 ミリメートル塩化カルシウム、pH 5.0) の 40 mL を加えて、クロラムフェニ コール原液 (10 mg/mL) の 40 μ L。</li>
	<li>(クロラムフェニ コール) ラガータイプの溶液のほとんどをチューブからバーミキュ ライト プレートに転送 (材料の表を参照してください)。バーミキュ ライト プレートでろ紙の表面に粒を転送します。粒を均等に します。(しかし完全に) 部分的に穀物を維持する十分な imbibing ソリューションに注ぐが冠水しました。バーミキュ ライト板の上にふたを配置します。</li>
	<li>蛍光灯で約 48 時間の 24 の ° C で無胚穀物を孵化させなさい。必要に応じて追加のラガータイプのソリューションを追加します。</li>
	<li>90 mm プラスチック シャーレを開くし、逆の蓋に自体と 20 mL の皿にラガータイプ溶液 20 mL を注ぐ。クロラムフェニ コール (10 mg/mL) の 20 μ L をそれぞれに追加します。アルコールでそれらを浸すことによって細かい点鉗子の 2 つのペアを滅菌します。</li>
	<li>シャーレの蓋に無胚穀物のいくつかを配置します。鉗子を使用して、優しく各結晶粒から種皮 (透明) を削除します。穀物の滑らかな側面から種皮を除去しながら基礎となる (アリューロン) 細胞に損傷を与えない。皮をむかれた穀物を含むラガータイプ液シャーレに転送します。</li>
	<li>すべての穀物から種皮を剥離後バーミキュ ライト プレートに戻します。24 ° C で皮をむいた無胚粒は、16-20 時間インキュベートします。</li>
	<li>砲撃の粒を使用して、直前にシャーレに濾紙の間それらの動揺によって表面の水分を削除します。</li>
</ol>3. 砲撃のプラスミッド DNA の準備
<ol><li>1.5 mL チューブの衝突実験に含まれるそれぞれの治療のためにラベルを付けます。各管にUBIの 2.5 μ g を追加::ルシフェラーゼ内部統制プラスミド、 GUSレポーター プラスミドとエフェクター プラスミドの必要な量 (2.5 μ g に通常 0.025 μ g) の 2.5 μ g。5 μ L の総ボリュームをさせる水を追加します。</li>
	<li>1.6 μ m の金 microcarriers (材料の表を参照) を準備次プロトコル6を公開しました。</li>
	<li>各治療のプラスミド DNA を含む 1.5 mL チューブに中断された microcarriers の 50 μ L を追加します。製造元のプロトコル6によるとプラスミド DNA と microcarriers をコートします。</li>
	<li>最後のステップでプラスミド コーティング microcarriers 48 μ L 100% エタノール, 5 macrocarriers のそれぞれに中断された microcarriers のピペット 8 μ L で中断され、空気にそれらを許可するときは乾燥します。</li>
</ol>4. パーティクルガン無胚オオムギ子実の
<ol><li>粒子衝突装置 (材料の表を参照) を設定6。</li>
	<li>1550 psi 破裂ディスクにキャップを保持し、楽器でそれをマウントします。</li>
	<li>(一緒に停止画面) 目的プラスミドの組み合わせを含む macrocarrier をマイクロ ・ キャリアの進水アセンブリに配置します。アセンブリを照射室の一番上のスロットに挿入します。キャップと標準距離 (6 mm)、macrocarrier カバーの蓋を保持するラプチャー ディスクの間の距離を設定し、11 mm (図 2 a) の macrocarrier 走行距離を許可する (標準) の中間位置に停止画面サポートを配置します。</li>
	<li>90 mm のシャーレの蓋にフラット ダウン テープろ紙円に (内側を指して薄く終了) とタイトな放射状パターンで 8 無胚穀物の手配 (図 2B参照)。</li>
	<li>停止画面から 6 cm の距離で照射室に穀物が付いている皿を配置します。</li>
	<li>95 kpa 照射室を避難し、サンプルを砲撃します。</li>
	<li>真空を解放した後 1 mg/ml クロラムフェニ コールを含むラガータイプ溶液 4 mL を含むラベル 60 mm のペトリ皿に衝撃された穀物を転送します。</li>
	<li>衝突のすべてが完了するまでを繰り返します。24 時間、24 の ° c の (100 rpm で動揺のプラットホーム) の孵化させなさい。</li>
</ol>5 衝撃された穀物からの可溶性タンパク質抽出
<ol><li>鉗子を使用すると、60 mm のペトリ皿から 8 衝撃された穀物を削除し、それらをペーパー タオルの上に乾燥しみ。それぞれ 800 μ L を含む 2 つのラベル付きの 2.0 mL チューブ (管あたり 4 粒) に穀物を分ける研削バッファー (100 mM Na リン酸塩 pH 7.2, 5 mM DTT、10 μ G/ml leupeptin、20% グリセロール) と 5 mm ステンレス鋼ビード。衝撃された穀物のすべてに対してこのプロセスを繰り返します。</li>
	<li>(最大 48) 2.0 mL チューブをビード ホモジナイザーの 2 つのラックに配置 (材料の表を参照してください)。ホモジナイザーでラックをマウントします。</li>
	<li>サンプルを 30 Hz で 3 分間振る。</li>
	<li>ホモジナイザー ラックをホモジナイザーから外し、再度サンプルを冷却するアイス (5 分) の上に置きます。</li>
	<li>反対の方向で - ホモジナイザー戻ってラックをマウントします。3 分間、30 Hz で再度サンプルを振る。</li>
	<li>5.5 手順 5.3 を繰り返します氷の上のラックにクールします。これは揺れの 12 分の合計追加されます。</li>
	<li>10 分の 4 ° C で 16,000 x g で穀物抽出物を遠心分離します。</li>
	<li>
すぐに、遠心分離後マイクロ遠心チューブ用の 2 番目のセットにクリアの培養上清をデカントします。各管の迅速な渦を与えます。氷の上には、チューブを格納します。</li>
	<li>上清を転送した後洗浄および再利用できるように、スチール ビーズをペレットから回復します。</li>
</ol>6. 穀物抽出物からルシフェラーゼ活性の測定
<ol><li>各管に試金する穀物エキス、ルシフェラーゼ アッセイ混合物の 200 μ L を含む 12 × 75 mm ガラスの試験管を準備 (45 mM Tris 硫酸 pH 7.7、15 mM MgCl2、20 mM DTT、1.5 ミリメートルの EDTA、1 mM ルシフェリン 1 mM ATP)。</li>
	<li>最初の試験管に最初の穀物抽出液 100 μ L を追加します。渦に迅速によく混ぜます。すぐにルミノのチューブ ホルダーに管を配置し、ドアを閉じます。測定が終了したら、ルミノ-次の管の配置のためのドアを開けっ放しからチューブを削除します。</li>
	<li>このプロセスを繰り返して、すべてのサンプルが測定されています。</li>
</ol>7. 穀物抽出物から GUS 活性の測定
<ol><li>96 well プレートの各ウェルに GUS アッセイバッファー (50 mM Na リン酸塩 pH 7.2、2.5 mM-メチルウンベリフェリルグリコシド - D-グルクロニド、10 mM DTT、2 ミリメートルの EDTA、10 μ G/ml leupeptin、メタノール 20%、0.02% アジ化ナトリウム) の 200 μ L を追加します。</li>
	<li>各穀物の場所の 50 μ L をよく対応するのに抽出します。ミックス チップを追加した後。フィルム シールの上部をシールします。</li>
	<li>暗闇の中で 37 ° C で 96 well プレート間 20 時間インキュベートします。</li>
	<li>10 分の 4 ° C で 4,000 x g で 96 ウェル プレートを遠心し、氷の上に置きます。</li>
	<li>黒 96 well プレートの各ウェルに 0.2 M Na2CO3の 250 μ L を追加します。</li>
	<li>対応する各遠心ガス分析の混合物の 6.25 μ L を追加まあ (含む 0.2 M Na2CO3) ブラック 96 ウェル プレートします。ミックス チップを追加した後。基準として 6.25 μ 10 μ M、40 μ M、100 μ M 4-メチルウンベリフェロンと井戸があります。</li>
	<li>プレート蛍光光度計に黒いプレートを置き、メチルウンベリフェロンの蛍光を読み取る。360 の励起波長での測定値を取る nm、発光波長 460 nm。40 μ M 4-メチルウンベリフェロンのも含む 6.25 μ L と 0.2 M Na2CO3の 250 μ L 1000 蛍光ユニットの読書を与えるような楽器のゲインを設定します。</li>
</ol>8. データ分析
<ol><li>スプレッドシートにルシフェラーゼと GUS の試金のための値を入力します。これは遺伝子構造がアリューロン細胞に正常に配信されないことを示します、20,000 の相対発光ユニットの-1より低いのルシフェラーゼ読んですべてのサンプルを対象から除外します。</li>
	<li>各正常に衝撃された穀物の (4 つの無胚穀物のグループを表す) を抽出し、ガスとルシフェラーゼの生データから正規化されたガス式を次のように計算: GUS を正規化 = [(空白ガス - ガス式) (2,000,000) x]/(ルシフェラーゼ式-ルシフェラーゼ空白)。 注: これは何は 2,000,000 のルシフェラーゼ読書与えた砲撃で観察されて GUS 活性量を正規化します。</li>
	<li>エフェクターの構造やエフェクターやホルモンの欠如で式のレベルを比較することによってテストされているホルモン治療の存在下で特定の報道記者構造の表現の相対的なレベルを報告します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chen, K., An, Y. Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+responses+to+gibberellin+and+abscisic+acid+in+barley+aleurone.">Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone.</a> J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).</li><li>Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gibberellin+response+complex+in+cereal+alpha-amylase+gene+promoters.">A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters.</a> Plant Cell. 4, 203-211 (1992).</li><li>Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+nature+of+abscisic+acid+(ABA)+response+complexes;+composite+promoter+units+that+are+necessary+and+sufficient+for+ABA+induction+of+gene+expression.">Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression.</a> Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).</li><li>G&#243;mez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibberellin/abscisic+acid+antagonism+in+barley+aleurone+cells:+site+of+action+of+the+protein+kinase+PKABA1+in+relation+to+gibberellin+signaling+molecules.">Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules.</a> Plant Cell. 13, 667-679 (2001).</li><li>Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wheat+PKABA1-interacting+factor+TaABF1+mediates+both+abscisic+acid-suppressed+and+abscisic+acid-induced+gene+expression+in+bombarded+aleurone+cells.">The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells.</a> Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).</li><li>Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+TaABF1+during+abscisic+acid+and+gibberellin+signaling+in+aleurone+cells+of+cereal+grains.">Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains.</a> Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).</li><li>Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+definition+of+ABA-response+complexes:+the+promoter+units+necessary+and+sufficient+for+ABA+induction+of+gene+expression+in+barley+(Hordeum+vulgare).">Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare).</a> Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).</li><li>Ritchie, S., Gilroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscisic+acid+signal+transduction+in+the+barley+aleurone+is+mediated+by+phospholipase+D+activity.">Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).</li><li>Takemiya, A., Shimazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+inhibits+blue+light-induced+stomatal+opening+via+inhibition+of+protein+phosphatase+1.">Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1.</a> Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).</li><li>Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+WRKY+gene+from+creosote+bush+encodes+an+activator+of+the+abscisic+acid+signaling+pathway.">A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).</li><li>Ishibashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+are+involved+in+gibberellin/abscisic+acid+signaling+in+barley+aleurone+cells.">Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells.</a> Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).</li><li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity.">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li><li>Hong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-mediated+regulation+of+a+rice+ABA+responsive+element+binding+factor.">Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor.</a> Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).</li><li>Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABI5+acts+downstream+of+ABI3+to+execute+an+ABA-dependent+growth+arrest+during+germination.">ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination.</a> Plant J. 32, 317-328 (2002).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS2-LIKE+PROTEIN+KINASE5,+an+SNF1-RELATED+PROTEIN+KINASE3-Type+protein+kinase,+is+important+for+abscisic+acid+responses+in+Arabidopsis+through+phosphorylation+of+ABSCISIC+ACID-INSESENSITIVE5.">SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5.</a> Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).</li><li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+regulation+of+ABA+signaling+and+biosynthesis+by+a+bZIP+transcription+factor+targets+drought-resistance-related+genes.">Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes.</a> Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

パーティクルガンによるエフェクター遺伝子の導入構築、記者構造の過渡式続いて GA/ABA シグナル伝達経路と結果ホルモン調節遺伝子で特定の俳優の役割を解剖するための重要な戦略式です。 ただし、大麦アリューロン細胞2,3,4,5,6でこのような実験を行うための既存?...

オオムギ糊粉層、植物1におけるホルモン調節遺伝子発現の研究の確立されたモデル システムです。特に、発芽や苗の早期開発のために必要な遺伝子の数はアブシジン酸 (ABA) によるストレス反応に関連する遺伝子が活性化しながらジベレリン (GA) によってアクティブ化されます。GA と ABA シグナル伝達経路が絡み合っている ABA および逆1にいくつか GA 活性化遺伝子の発現が阻害されると。
ジョージア州/ABA シグナル伝達経路で特定俳優の役割の結果を許可する記者の構成要素の過渡式に続いて、粒子の爆撃によってエフェクター遺伝子構造の導入をされている理解のための重要な戦略下流遺伝子発現が決定されます。ガス(β-グルクロニダーゼ) などルシフェラーゼレポーター遺伝子の使用エフェクター コンストラクトを受けた細胞内遺伝子発現の高感度で定量的に計測が可能します。たとえば、転写因子 TaABF15,6エフェクター コンストラクトの導入確立、ABA で誘導される遺伝子HVA1などによる TaABF1、 Amy32bなどの遺伝子の ga 処理で誘導しながら追加されなくなります。粒子衝突実験的戦略としては、ジョージア州/ABA シグナル伝達経路の多様な側面を調査する複数の研究所で使用されています。このような作業は、ga 処理で誘導2の ABA 誘導遺伝子3、活性化のため重要なプロモーター同定し、蛋白質キナーゼ4の発見につながっているし、転写因子を調節する5これらの遺伝子の表現。
既存プロトコル2,3,4,5,6パーティクルガンと一時的な遺伝子発現のそれに続く測定は、各一連の砲撃労働集約的、します。ほとんどの穀物は乳鉢と乳棒で手作業で均質化し、酵素試金は個別に実施します。この原稿は部分的に自動化および均質化手順を合理化する改善されたプロトコルを報告し、GUS のかなり多くのスループットを許可する試金の同じ実験でテストされる処置の多数を許可および/または、統計的に信頼性の高い結果を得るため、それぞれの治療のためより複製の包含。転写因子 TaABF1 および GA, ABA、およびその他の規制の分子によって規制されているHVA1やAmy32bの記者構成要素の式の代表的な結果が表示されます。

<table><tbody><tr><td>GeneElute HP plasmid Maxiprep kit</td><td>Sigma</td><td>NA0310-1KT</td><td></td></tr><tr><td>UV-vis spectrophotometer</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Himalaya barley grains</td><td>/</td><td>/</td><td>A variety of hulless barley (store in the dark at 4&amp;deg; C)</td></tr><tr><td>sodium succinate</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td>Reagent for Imbibing Solution</td></tr><tr><td>calcium chloride (dihydrate)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Reagent for Imbibing Solution</td></tr><tr><td>Imbibing Solution</td><td>home made</td><td>/</td><td>20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.</td></tr><tr><td>chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.</td></tr><tr><td>vermiculite</td><td>Fisher</td><td>NC0430369</td><td>Used for vermiculite plates.</td></tr><tr><td>filter paper circles (90 mm)</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation</td></tr><tr><td>Vermiculite Plates</td><td>home made</td><td>/</td><td>Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.</td></tr><tr><td>forceps (fine pointed)</td><td>Fisher</td><td>13-812-42</td><td>Used for removing seed coat from barley grains.</td></tr><tr><td>forceps (ultra fine point)</td><td>Fisher</td><td>12-000-122</td><td>Used for removing seed coat from barley grains.</td></tr><tr><td>gold microcarriers (1.6 &amp;mu;m)</td><td>BioRad</td><td>1652264</td><td></td></tr><tr><td>macrocarriers</td><td>BioRad</td><td>1652335</td><td></td></tr><tr><td>calcium chloride (dihydrate)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20&amp;deg; C.</td></tr><tr><td>spermidine</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td>Prepare a 100 mM stock solution and store 500 &amp;mu;L aliquots at -20&amp;deg; C (use within 2 months).</td></tr><tr><td>rupture discs (1550 psi)</td><td>BioRad</td><td>1652331</td><td></td></tr><tr><td>stopping screens</td><td>BioRad</td><td>1652336</td><td></td></tr><tr><td>macrocarrier holders</td><td>BioRad</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic particle delivery system</td><td>BioRad</td><td>PDS-1000/He</td><td></td></tr><tr><td>sodium phosphate monobasic monohydrate</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2</td></tr><tr><td>sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma</td><td>S9763</td><td>Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2</td></tr><tr><td>1M sodium phosphate pH 7.2</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.</td></tr><tr><td>dithiothrietol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td>Dissolve in water to 1 M. Store at -20&amp;deg; in 1 mL aliquots.</td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20&amp;deg; C.</td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Prepare a 50% solution in water.</td></tr><tr><td>Grinding Buffer</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 &amp;mu;L of 1 M DTT, 100 &amp;mu;L of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.</td></tr><tr><td>stainlesss steel beads (5 mm)</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.</td></tr><tr><td>bead homogenizer (TissueLyser)</td><td>Qiagen</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>12mm x 75 mm glass test tubes</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>luciferin</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-100</td><td>Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20&amp;deg; C.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td>Prepare a 100 mM stock solution and store 250 &amp;mu;L aliquots at -20&amp;deg;&amp;nbsp;C.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.</td></tr><tr><td>sulfuric acid</td><td>Sigma</td><td>258105</td><td>Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.</td></tr><tr><td>1M Tris sulfate pH 7.7</td><td>home made</td><td>/</td><td>Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.</td></tr><tr><td>magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>M9397</td><td>Dissolve in water to 2 M.</td></tr><tr><td>Luciferase Assay Buffer (LAB)</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 &amp;mu;L of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 &amp;mu;L of 0.5 M EDTA. Add water to 50&amp;nbsp;mL.</td></tr><tr><td>Luciferase Assay Mixture</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 15 mL of LAB, 800 &amp;mu;L of 25 mM luciferin, 200 &amp;mu;L of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20&amp;nbsp;mL) for 100 luciferase assays.</td></tr><tr><td>luminometer (Sirius)</td><td>Berthold</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>4-methylumbelliferyl-&amp;beta;-D-glucuronide (MUG)</td><td>Goldbio</td><td>MUG1</td><td>Dissolve in DMSO to 100 mM.</td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20&amp;deg; C.</td></tr><tr><td>96 well plates (standard)</td><td>Fisher</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>GUS assay buffer</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 &amp;mu;L of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 &amp;mu;L of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.</td></tr><tr><td>TempPlate sealing film</td><td>USA Scientific</td><td>2921-1000</td><td></td></tr><tr><td>96 well plates (black)</td><td>Costar</td><td>3916</td><td></td></tr><tr><td>sodium carbonate</td><td>Sigma</td><td>S7795</td><td>Prepare a 200 mM solution in water.</td></tr><tr><td>4-methylumbelliferone</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>Prepare a 100 &amp;mu;M solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20&amp;deg;&amp;nbsp;C.</td></tr><tr><td>microplate fluouresence reader</td><td>Bio-Tek</td><td>FLX-800</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring gene expression in bombarded barley aleurone layers with increased throughput

大麦糊粉層は、植物におけるホルモン調節遺伝子発現の重要なモデル システムです。アリューロン細胞における遺伝子は発芽に必要なまたはアブシジン酸 (ABA) によるストレス反応に関連する遺伝子が活性化しながら初期苗開発はジベレリン (GA) によってアクティブ化されます。GA と ABA シグナル伝達のメカニズムは、酵素試金を使用して測定結果の一時的な式で粒子衝突によるアリューロン細胞にレポーター遺伝子コンストラクトを導入することで尋問することができます。改良されたプロトコルは部分的に自動化および穀物の均質化ステップと酵素試金が合理化される既存の方法よりもはるかに多くのスループットを許可します。穀物のサンプルの均質化が、自動組織ホモジナイザーを使用して行われ、GUS (β-グルクロニダーゼ) の試金は 96 ウェル プレート システムを使用して実行されます。代表的なプロトコルを使用して示唆されたホスホリパーゼ D の活性が転写因子 TaABF1 を ABA によるHVA1遺伝子発現の活性化に重要な役割を果たす可能性があります。

ここで説明する手法は、大麦アリューロン細胞に任意のテスト遺伝子コンストラクトを導入する使用ことができます。実験遺伝子の表現のレベルがあります便利な測定 (図 2)。ここで大きく説明より高いスループット プロトコルは、研削のシードと酵素試金のステップの効率を高めます。このメソッドは、ABA で誘導される遺伝子HVA1<sup cla...

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Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

粒子衝突の後大麦アリューロン細胞の構造において、記者から一時的な遺伝子発現の測定のため改良されたプロトコルが表示されます。96 ウェル プレート酵素試金研削自動穀物の組み合わせは、プロシージャの高スループットを提供します。

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

6.4K ビュー.  Colby College. 粒子衝突の後大麦アリューロン細胞の構造において、記者から一時的な遺伝子発現の測定のため改良されたプロトコルが表示されます。96 ウェル プレート酵素試金研削自動穀物の組み合わせは、プロシージャの高スループットを提供します。

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Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

S の酵母酵母の低酸素応答中に時間をかけての mRNA のレベルを測定

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

遺伝学

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Isolation of High Purity Tissues from Developing Barley Seeds

Understanding the mechanisms regulating the development of cereal seeds is essential for plant breeding and increasing yield. However, the analysis of cereal seeds is challenging owing to the minute size, the liquid character of some tissues, and the tight inter-tissue connections. Here, we demonstrate a detailed protocol for dissection of the embryo, endosperm, and seed maternal tissues at early, middle, and late stages of barley seed development. The protocol is based on a manual tissue dissection using fine-pointed tools and a binocular microscope, followed by ploidy analysis-based purity control. Seed maternal tissues and embryos are diploid, while the endosperm is triploid tissue. This allows the monitoring of sample purity using flow cytometry. Additional measurements revealed the high quality of RNA isolated from such samples and their usability for high-sensitivity analysis. In conclusion, this protocol describes how to practically dissect pure tissues from developing grains of cultivated barley and potentially also other cereals.

Here we present a protocol for high purity manual isolation and quality control of embryo, endosperm and seed maternal tissues during entire barley seed development.

Understanding the mechanisms regulating the development of cereal seeds is essential for plant breeding and increasing yield. However, the analysis of ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality RNA is often hindered by high starch and sugar content. These compounds can reduce both the yield and the quality of the extracted total RNA. The deterioration in quantity and quality of total RNA can subsequently have a significant impact on the downstream transcriptomic analyses, which may not accurately reflect the spatial and/or temporal variation in the gene expression profile of the samples being tested. In this protocol, we describe an optimized method for extraction of total RNA with sufficient quantity and quality to be used for whole transcriptome analysis of cereal grains. The described method is suitable for several downstream applications used for transcriptomic profiling of developing, germinating, and mature cereal seeds. The method of transcriptome profiling using a microarray platform is shown. This method is specifically designed for gene expression profiling of cereals with described genome sequences. The detailed procedure from microarray handling to final quality control is described. This includes cDNA synthesis, cRNA labelling, microarray hybridization, slide scanning, feature extraction, and data quality validation. The data generated by this method can be used to characterize the transcriptome of cereals during germination, in various stages of grain development, or at different biotic or abiotic stress conditions. The results presented here exemplify high-quality transcriptome data amenable for downstream bioinformatics analyses, such as the determination of differentially expressed genes (DEGs), characterisation of gene regulatory networks, and conducting transcriptome-wide association study (TWAS).

A method for transcriptome profiling of cereals is presented. The microarray-based gene expression profiling starts with the isolation of high-quality total RNA from cereal grains and continues with the generation of cDNA. After cRNA labelling and microarray hybridization, recommendations are given for signal detection and quality control.

遺伝子発現プロファイリングのための修飾法による穀物種子からの高品質なトランスクリプトームデータの取得

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

生化学

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

生物学

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究​​のための動的画像解析

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a fluorescently tagged-protein of interest is transiently expressed in plant tissue following biolistic delivery of its encoding DNA construct. The intra- and intercellular distribution of the tagged protein is then analyzed by confocal microscopy. We describe this technology in detail, providing step-by-step protocols to assay and evaluate the extent of symplastic protein transport in three plant species, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and N. tabacum (tobacco).

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Macromolecular trafficking between plant cells can be assessed by transiently expressing a fluorescently-tagged protein of interest and analyzing its intra- and intercellular distribution by confocal microscopy.

細胞間の高分子輸送アッセイプランタで微粒子銃砲撃を活用

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

液滴ベースのRNAシーケンシングによるハイスループット酵母株フェノタイピング

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

生物工学

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

要約

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S の酵母酵母の低酸素応答中に時間をかけての mRNA のレベルを測定

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

Isolation of High Purity Tissues from Developing Barley Seeds

遺伝子発現プロファイリングのための修飾法による穀物種子からの高品質なトランスクリプトームデータの取得

ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究のための動的画像解析

細胞間の高分子輸送アッセイプランタで微粒子銃砲撃を活用

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

液滴ベースのRNAシーケンシングによるハイスループット酵母株フェノタイピング

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

要約

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酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

Isolation of High Purity Tissues from Developing Barley Seeds

遺伝子発現プロファイリングのための修飾法による穀物種子からの高品質なトランスクリプトームデータの取得

ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究​​のための動的画像解析

細胞間の高分子輸送アッセイプランタで微粒子銃砲撃を活用

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液滴ベースのRNAシーケンシングによるハイスループット酵母株フェノタイピング

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究のための動的画像解析