Name: methods and tips for intravenous administration of adeno-associated virus to rats and evaluation of central nervous system transduction
Uploaded: 2017-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
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この作品は、ALS 協会、Karyopharm ・ セラピューティクス社、Meira GTx、感謝しております、トーマス ・ ローソンから ALS 研究慈善寄付によって賄われていた。アドバイスやトレーニング、エリスの果樹園とドナ バーニーに感謝します。JAS が嘘をついた財団によって支えられたし、健康の国民の協会は GM103418 を付与します。

すべてのプロシージャ適切な NIH ガイドラインに従った。すべてのプロシージャは続く動物愛護とシュリーブ ポートにルイジアナ州立大学健康科学センターで使用の委員会によって承認された動物のプロトコルです。この手順で使用された 6 週齢の雌ラット。
 1 です。 必要なベクトルの用量/ボリュームを決定する <ol><li>ラットに注入すると、各動物に必要なウイルスのベクトルの量を決定するベクトル準備の力価 (集中) に基づく計量。以前ラット中枢神経系における効率的な表現に成功しているベクトルの用量を使用 (ジャクソン ら を参照してください 。6). 注: AAV9 TDP-43 または AAV9 GFP、典型的な線量は 3 x 10 13 - 1 x 10 14 ベクトル ゲノム/kg の間。6 週齢の若いラットの重さ約 150 g.</li>
	<li>は、体系的な比較のためのすべての動物の 1 kg あたり等価線量です。ボリュームは標準的なお勧めの注入量 (250 グラムのラットの 250-500 μ L) を超えないことを確認します。典型的な注入量は若いラットに 200 μ l.</li>
</ol> 2。作業ステーションを準備する <ol><li>すべての必要な消耗品を収集: ピペット先端およびマイクロ ピペット動物、動物、ガーゼ (1 頭につき 2-3) あたり 1 つのアルコール準備パッドあたり正方形 (約 5 x 5 cm) の 1 つのパラフィン フィルム</li>。
	<li>は、70% エタノールで表面をクリーニングして作業面を準備します。ダウン (~ 37 ° C) の低に設定温度に加熱パッドを配置します。加熱パッドの上にベンチのパッドを配置します</li>。
	<li>は、ガス麻酔 (イソフルラン) を準備します。十分な酸素とガス麻酔の手順を確認します。70% エタノール誘導商工会議所と麻酔マスクをきれいにし、ベンチのパッドに麻酔マスクを配置します</li>。
</ol> 3。ベクターの準備 <ol><li>室温でベクトルを解凍し、各動物のための 1 つの滅菌遠心チューブのラベルします</li>。
	<li>ピペット AAV のボリュームで決定適切なチューブに 1.1 をステップし、必要な注入量 (ここでは、200 μ l) までボリュームを持って一日リンガー &#39; s ソリューションまたは生理食塩水</li>。
	<li>パルス渦 1 〜 2 秒のためのサンプルとしてパルス 5 遠心管の底に、サンプルを持参して s</li>。
	<li>チューブとパラフィン膜の角にラットの総注入量をピペットで移しなさい</li>。
	<li>1 mL シリンジに 30 ゲージ針を配置します</li>。
	<li>パラフィン フィルムのベクターに下向き傾斜面と針の場所。すべてのウイルスは、針と注射器までシリンジのプランジャーを戻るに引き抜きます。練習すれば簡単になる針の中に空気の泡を描画を避けるために注意してください</li>。
</ol> 4。ラットを準備 <ol><li>1 L/min まで酸素を切りイソフルラン麻酔を 5% に設定します。すべての接続ホースとバルブの向きを確認して誘導室にガス麻酔が流れることを確認します</li>。
	<li>ラットが応答するまで、ガス麻酔誘導室約 3 分でラットを配置します</li>。
	<li>は、つま先をつまんで麻酔の十分な深さを確保します。つま先ピンチ後足または脚の運動ができません</li>。
	<li>イソフルラン麻酔を麻酔の維持のための 2% に削減し、麻酔は麻酔マスクに流れているので、活栓を調整します</li>。
	<li>ラットの場所 &#39; s 麻酔マスクの鼻、それがその側に横たわっているラットを調整します</li>。
	<li>外側尾静脈を識別します 。
	注: 外側尾静脈約 10 と 2 o にある &#39; 12 尾の背の上部に時計 o &#39; 時計。その側に横たわっているラット、外側尾静脈中に直面する必要があります</li>
	<li>は、アルコール パッドで準備注入領域を拭いてください。注射部位は尾の長さを 3 分の 2 です</li>。
</ol> 5。ベクトルを注入 <ol><li>をしっかり尾わずか 1 本指による注入領域の上外側尾静脈経由で直接; これは静脈を拡張します</li>。
	<li>ベベル上向き、同じ方向に見える尾静脈針を合わせます</li>。
	<li>しっぽを押さえて尾静脈を押すと他の手を避けるために偉大な世話ながら尾静脈を皮膚を突き刺し</li>。
	<li>通常血流を許可するように尾静脈からの圧力を解放します</li>。
	<li>は、静脈に針を移動します。針は尾静脈を穿刺するように、少し引きプランジャー。針が静脈の血液が針に流れます。
	<ol><li>針必要に応じて位置を変更します。その後、針を安定させるために注射部位の下に注射部位の上で手を動かすし、尾に対して注射器の端を保持します</li>。
	</ol></li> <li>尾 (約 20 μ L/s) にベクトルをゆっくり挿入します 。
	注: 静脈は、ベクトルの流れるとして色を失う可能性があります。ソリューションが外静脈注入された標識は、ブレブ、ベクトルを注入すると、皮膚、または抵抗のブランチングします。練習では、余分な血管の露出を最小限に抑えることができます</li>。
	<li>ベクターを投与されている後、ラットから針を除去し 30-60 の出血を止めるために注射部位に対してガーゼのパッドを押す</li>
</ol> 6。クリーンアップ <ol><li>オフ、イソフルレン麻酔と酸素。それが意識を取り戻すまでにラットを監視し、そのケージに戻します</li>。
	<li>は、シャープス コンテナーのすべての針を慎重に配置します。可能性のある適切なバイオハザード容器に AAV で汚染されている他のすべてのディスポーザブル材料の処分します。70% エタノール ワーキング ステーションをきれいします</li>。
</ol> 7。後肢エスケープ反射を評価 注: 後肢欠損が生じますベクター投与量に応じて、TDP 43 遺伝子導入後 2 ~ 6 週間。
<ol><li>の破片の平らな面クリアで 2 本の指でつかむラット &#39; s 本体から約 2 cm の尾します。前肢は、ラットの腹部の下側を見ながらぶら下がっているまでにラットをそっと持ち上げます。
	<ol><li>遺伝子導入後の実験経過を通じて毎週プロシージャを実行 (例えば、遺伝子導入後 12 週間まで). 
		注: もこの方法で前肢の赤字をスコアが、後肢欠損は使用されるベクトル量によっては、このモデルで発生する可能性が高いです</li>。
	</ol></li> <li>、10 時に正中線に向かって 1 つまたは両方の後肢を握り締める場合 10 s. メモのため、後肢を観察 s.</li>
	<li>繰り返しこのテストは 30 で 3 回の合計 s トライアルの間。1 つまたは両方の後肢は、3 つの試験のそれぞれの clenched は、ラットは、運動機能障害を示しています。一貫性のあるすべての 3 つの試験で食いしばりがある場合、現在どちらかの片側または両側の後肢の赤字 (ノート) で手動でデータを記録します</li>。
</ol> 8。Rotarod の運動機能を評価 <ol><li>、rotarod を設定する、rotarod の下にあるベンチのパッドを配置し、(~0.3 回転/秒で速度増加) が 2 分間かけて 4 40 回転/分 (rpm) に加速度を設定します。12 週間の時間コース 2、4、8、被験者を実行し、遺伝子の後 12 週間転送します</li>。
	<li>を許可します。20 分テスト部屋に順応するラット</li>
	最初に、rotarod を使用して、まず 4 rpm のスピードで rotarod を起動し、rotarod のラットを配置するラットを訓練するには、<li>。徒歩で 4 回転、1 回転してから加速を開始ラットとそれが落ちるまで、rotarod の上を歩くラットを許可します。ラット 40 少なくとも一貫して歩くことができるまでトレーニングを続ける s。この方法で健康な若いラットに容易に訓練されます。
	<ol><li>顕著な運動障害があるラットの場合、40 の落下にベースライン遅延を達成するからラットを防ぐことができますを s、ラット rotarod 得点を開始する前に 3-5 トレーニングの試みを提供します</li>。
	</ol></li> <li>Rotarod テストを開始する、rotarod のラットを配置し、rotarod の加速を開始。ラットが rotarod; から落ちる時間に注意してください。これは、秋に待ち時間です。ラットは、120 の後、rotarod に残っている場合 s、この時点でのセッションをキャップ、rotarod からラットを削除、120 の秋の遅延時間を記録 s.</li>
	<li>は、3 つの試験の合計 2 回のテストを繰り返します。疲労の影響を最小限に抑えるために離れて試験、少なくとも 5 分をスペースします。3 つの試験の点数の平均値します。健常者のラットは典型的にはの落下に平均待機時間 &#62; 40 s.</li>
	<li>ケージに戻ってラットを置き、rotarod と周辺地域の 70% エタノールをきれいします</li>。
</ol> 9。小脳における GFP 発現定量化 <ol><li>ラットを麻酔し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) とし、4% パラホルムアルデヒドを灌流します。脳と脊髄の解剖し、組織を固定液に一晩浸して、30% ショ糖液に移動します。平衡後、カット ステージ 4 , 5 , 6 を凍結との滑走式ミクロトームで 50 μ m のコロナ セクション</li>。
	<li>は、小脳虫部、小脳の中央の葉には等間隔に配置する小脳の 3-6 セクションを選択します。信号を最大化する GFP の蛍光ラベルします。1: 500 で GFP の一次抗体を使用し、1: 300 4 , 5 , 6 の希釈でアレクサ 488 共役二次抗体を使用します 。
	注: を参照してください 4 , 5 , 6 サンプリングの詳細についてを参照、ステイニングします</li>。
	<li>は、顕微鏡を用いた低倍率レンズで興味の定義された領域内の各セクションを photomicrograph します。使用 2.5 × 対物 (エヌ 0.12) とフィルター設定 10、450-490/515-565 励起/蛍光)。カメラの設定のまま (露出時間、例えば、2 s) 分析するサンプルを横切って同じです。として保存します。TIF ファイル</li>。
	<li>は、広く利用可能なサイオン イメージ プログラムで顕微鏡写真を開く; 2 つのウィンドウが開きます。閉じるウィンドウとして示される &#34; インデック スカラー &#34;.</li>
	<li>選択 &#34; オプション &#34;、その後 &#34; 密度 SliceŔ 色合いの範囲はルックアップ テーブル (LUT) ウィンドウで赤色に表示されます。ウィンドウで特定 GFP ラベルのみを入力するカーソルを使用し、非固有の背景画像でピックアップを開始したときを停止します 。
	注: これを定量化する顕微鏡に蛍光の領域を強調表示します。設定は、具体的にはのすべての目に見えない蛍光セルをキャプチャする最適化必要があります。練習では、このメソッドは正確に特定の蛍光を強調します</li>。
	<li>蛍光領域を測定する前にまず正しい単位 (ピクセル) でテストの測定がされるように。これを行うには、クリックして &#34; 分析 &#34;、その後 &#34; セット ScaleŔ4 行目が言う必要があります &#34; 単位 &#34;。ドロップ ダウン リストから選択をクリックしてピクセル単位で測定するためのピクセル &#34; [ok] &#34;。解析オプションを切り替える &#34; 含めるインテリア穴 &#34; 分析のセルの体全体を含めることを確保するためです</li>。
	蛍光の面積を測定する <li>をクリックして &#34; 分析 &#34; し &#34; メジャー &#34;。この値を表示するをクリックして &#34; 分析 &#34; をクリックして &#34; ショー ResultsŔ結果ウィンドウが表示されます。というラベルの見出しの下での蛍光の面積測定になります &#34; エリア &#34;.</li>
	<li>の測定の間で標準化するように、LUT の] ウィンドウで強調表示されている値を変更しないでください</li>。
	<li>すべての測定値が記録されている、かつては平均各動物 (動物あたり 3-6 節) からの値です。適切な統計テストを使用すると、グループ間導入されたエリアを比較します。 6</li></ol>

<ol>
	<li>Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).</li><li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons.">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li><li>Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+injections+in+neonatal+mice.">Intravenous injections in neonatal mice.</a> J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansive+gene+transfer+in+the+rat+CNS+rapidly+produces+amyotrophic+lateral+sclerosis+relevant+sequelae+when+TDP-43+is+overexpressed.">Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed.</a> Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).</li><li>Dayton, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+forelimb+impairment+in+rats+expressing+a+pathological+TDP-43+25+kDa+C-terminal+fragment+to+mimic+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis.</a> Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).</li><li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV9+supports+wide-scale+transduction+of+the+CNS+and+TDP-43+disease+modeling+in+adult+rats.">AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats.</a> Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036 (2015).</li><li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+paralysis.">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li><li>Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+targeting,+better+efficiency+for+wide-scale+neuronal+transduction+with+the+synapsin+promoter+and+AAV-PHP.B.">Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B.</a> Front. Mol. Neurosci. 9, 116 (2016).</li><li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+respiratory+changes+at+end+stage+in+a+FUS-induced+disease+state+in+adult+rats.">Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats.</a> BMC Neuroscience. 17 (1), 69 (2016).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice.">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li><li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+vector+&amp;#34;magic+bullet&amp;#34;:+targeted+expression+in+the+central+nervous+system+after+peripheral+delivery+using+the+synapsin+promoter.">Gene vector &amp;#34;magic bullet&amp;#34;: targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).</li><li>van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+embolism:+pathophysiology+and+treatment.">Gas embolism: pathophysiology and treatment.</a> Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).</li></ol>

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AAV ベクターの様々 な配送ルートをテストされている: イントラ実質、内 cerebroventricular、内莢膜、静脈内、鼻腔内、筋肉内、等。各ルートは、特定の利点と欠点があります。成人ラット AAV の尾静脈投与は中枢神経系の一貫性のある情報伝達を実現するための信頼性の高い方法です。末梢注入方法注入カニューレの中枢神経組織への導入を回避、低侵襲。このメソッドによって達成することができます効率的な中枢神経系式は、テクニックの最大の利点です。他の実用的な利点は注入法は非常に高速 (開始から終了までの動物につき約 10 分) と、尾静脈注射は高度な技術ではなく、したがってすぐにマスターすることができます。確かに、主な欠点は高価ベクトルの多くが必要ですか、AAV の準備が 1 x 1013ベクトル ゲノム/ml 以下なら可能性の問題となります。ターゲット設定機能ベクトル化と有利な将来は、遺伝子治療臨床研究に与えられた遺伝子デリバリーは、末梢ルートおよびこうして比較的非侵襲的、このアプローチ可能性があります。一方、もっと直接内脳脊髄液注射が有利前臨床および臨床的アプローチの 2 つの理由: より限られたベクトルの広がりとベクトルの低用量の使用。
暗い色素沈着とラットの尾静脈より特定は難しいがあります。だから、レトロな軌道注射や大伏在静脈に静脈注射など管理の代替ルートを使用できます。レトロ軌道注射ターゲットに密な毛細血管と静脈内注入に類似しているため。マウス、ラット用も、レトロ軌道法尾静脈注射よりも簡単かもしれない 3 つの研究はラットの尾静脈注射の偉大な一貫性を示しています。6,8,9この作業のほとんどは、ドライブ遺伝子発現、サイトメガロ ウイルス鶏 β アクチン ハイブリッド プロモーターに強い組換えプロモーターを使用しました。10の場合、実験者は、中枢神経系ニューロンの式を区切るために希望、セル型固有のプロモーターが図れます、たとえば synapsin のプロモーター。8,11
イメージング法に関して伝達効率を推定するためのクイック、半定量的な方法です。正しく行われている場合アッセイによって導入された地域の信頼性の高い推定値が得られます。中枢神経系組織におけるカウント オブジェクトの金本位法ステレオロジーと呼びます。この方法はスケール アップするとき少ない動物ごと、あるいは 20 分で速く脳に関心領域の薬剤プローブを実施する動物あたり約 75 分します。場合はすべての条件を同じにして、同じ領域は正しくサンプリング データの一貫性のステレオロジー、偉大な整合性に近づくし、一斉迅速にサンプルの大規模なグループを分析できます。
さらに議論が必要追加のテクニカル ノートの数があります。トライアル アンド エラーと王らデイトンら、ジャクソンら、用量反応によって決定されたラットにおける効率的な導入遺伝子発現に必要なベクトル量ベクトル用量に関するセクション 1 と同様前投与マウス (・ フォウストらとドゥケet al) で使用されます。1,2,4,5,6確かに重要、および可能性のあるレート制限ステップ生産している実効線量を達成するために高価 AAV preps。
セクション 3 の針、注射液中の気泡の中にベクトルの読み込みについては避けてください可能な限り最高。空気の少量はこれが、肺でフィルター処理できますが、静脈に注入された空気の過剰なボリュームは、死に至るおそれ静脈空気塞栓症を引き起こすことができます問題が発生しないでください。12泡がシリンジ内に存在する場合、注射器から追放されるウイルス、新しい注射器を読み込む必要があります。泡の作成を避けるためには、パラフィルム上下向き傾斜面とベクトルのドロップに近い針を配置することを確認します。ベクトルの大半は、針に使われているとき、非常にゆっくりと残りの溶液を作成します。注射器の後ろに小さな空気のポケットを形成します。これはデッド スペースは、組み込まれません。注射器の後方確保されていることを確実にするには、下向き水平または先の尖った注射器を保つやシリンジの映画を行います。
注射に関するセクション 5 の注射を静脈に針を挿入、静脈を囲むティッシュない行くことにする、少し引き針の先端に否定的な圧力を作成するプランジャー。前述のとおり、針が静脈にある場合も、血は針に戻ってくる必要があり、針の基部に表示されます。静脈に注入しながらは、針が適切に配置されます、少し抵抗を感じられるべきであります。大きな抵抗が発生した場合は、注入起こっている尾の組織に上記のよう可能性があります。また、針のゲージが大きすぎる、静脈針が挿入されている角度が急すぎる場合、または射出速度が速すぎる、静脈にあまりにも多くの圧力をかけて、「本格的な静脈」を引き起こして静脈穿刺することが可能です。本格的な静脈に静脈の初期パンクや注射の際に発生します。注入する際、静脈を穿刺または静脈から外れとなって針を持っていることを避けるためには、前述の尻尾に対して注射器の端を保持することによって、注射器が安定しました。針が外れている、または第 2 の注射は別の理由のため必要な反対側または同じ側の体に近づくほど外側尾静脈のいずれか 2 番目の噴射が作成できます。
セクション 8 の rotarod 試金は実験中に 4 週間の間隔で実行されます。通常、若い (4-6 週古い) より古い年齢で彼ら場合、未処理のラットは良いスコアを持っています。エスケープ反射で赤字は時間の経過とともに肢の機能生存としてプロットされます。生存曲線は、プリズム ソフトウェアに関するログランク検定によって分析されます。
練習するだけで、伝達分析に関するセクション 9 のプロシージャは比較的高速な動物毎以下約 20 分を取ってなります。非導入組織であるために、この試金は高信頼性も基本的には無視できる程度の読書 (プロシージャを汚す GFP で処理図 2 b)、読み出しに広大なダイナミック レンジがあります。GFP 蛍光のほとんどが導入されたプルキンエ細胞から派生し、こうして彼らの偉大な数字が広いダイナミック レンジを提供します。これまでのところ、遺伝子伝達効率を実現が飽和 (プルキンエ細胞のすなわち、100% 伝達) フィールド全体にわたって、少なくともときに測定値を生じないこと遺伝子導入はラットに投与されます。フィールド全体の彩度が問題なら、信号は別の動物に低ベクトル用量を適用またはのみ、弱い、ネイティブ GFP 蛍光測定、汚損プロシージャを取りやめてによって下げることが。確かに、小脳の他の細胞型の伝達も貢献できる信号、しかし何は容易に目に見える、プルキンエ細胞層の細胞体と、分子にその樹状ツリー プログラムによってカウントは明らかに、ほとんど自分の既知の位置と形態に基づく小脳全体層。メソッドの重要な課題をこうして測定を汚染する、空気の泡や蛍光灯の破片がカウントされることです。セクションやノイズのこのフィールドは使用されません。非固有のノイズのきれいなサンプルが必要です。GFP は外国蛋白質なので、特定の蛍光を正確にキャプチャおよび推定できるので、組織内のバック グラウンド ノイズはありません。これらの研究で GFP 顕微鏡写真はカラーで捕獲され、サイオン イメージ以外のイメージング プログラムを使用してグレースケールに変換されます。ただし、サイオンのイメージでその後の分析の最初の場所で白と黒の GFP をキャプチャするより簡単なこと。以前の研究は、gfp 運動ニューロンの比率など、割合的に脊髄下位運動ニューロンの伝達を分析しました。4,6しかし、小脳の分析はより迅速より少ないセクションを必要とするより一貫性と信頼性も (たとえば、評価を行う個々 の観察者間で) にも表示されます。急速な小脳イメージング法、周辺機器、中央への遺伝子導入の成功の良い迅速なインデックスです。王ら、デイトンら、ジャクソンらで脊髄の伝達とラットの神経系の他のサイトの伝達の例の解析が報告されています。4,5,6
要約すると、静脈内投与経路は低侵襲です。中枢神経系は、脳や脊髄に針をかけることがなく末梢投与対象できます。ターゲットのさらなる改良は、あわせて関連する前臨床・臨床遺伝子治療、ラットにおける基本的な機能研究の無数の未来型に多くの探求で広大な伝達によってにとって有益な静脈内の配信を使用する引き続き生体内での遺伝子機能の仮説検定を促進するため。

組換えアデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターでは、あまり生体内でのニューロンの伝達効率がよく、中枢神経系研究のための不可欠なツールです。AAV のベクトルが異なる遺伝子とタンパク質アイソ フォーム、さまざまな組織、別のホスト種、および管理の別の路線を勉強のため非常に汎用性。周辺は、比較的非侵襲、ニューロン中枢神経系全体を最初に変換する静脈注射の記載・ フォウストらとドゥケらによってマウスに AAV を管理ことができますたとえば、(を参照してくださいゼウス紙 Gombash et al.(2014 年))。1,2,3この遺伝子配信アプローチをどちらかの緑色蛍光タンパク質 (GFP) を効率的に表現するラットの使用または ALS 関連タンパク, transactive 応答 43 kDa (TDP-43) 中枢神経系の DNA 結合タンパク質。4,5,6,7,8,9ラットでの作業は、ラットの代謝および生理学的パラメーターはマウスと比べて人間に近い、行動および毒性学的試金のラットのために特別に設計されていますので重要です。さらより多くの遺伝子組み換えラット線が可能になっている AAV 遺伝子伝達研究で利用可能します。
メソッドは、ラットと成果の迅速で信頼性の高い定量広大な中枢神経系遺伝子伝達の詳細です。大規模な中枢神経系の情報伝達は、TDP 43 脊髄全体に表現することによってラットの ALS の症状を模倣する使用されます。メソッドが使用されるジャクソンら若いラットに TDP 43 ベクトルの尾静脈注射6,8,2 つの方法で獲得した TDP 43 による運動障害が数週間後、 9 : 反射と rotarod と、デイトンら・ ジャクソンらとエスケープ5,6,7,9制御 GFP ベクトル、事後分析での小脳の蛍光の面積はジャクソンらにおいて伝達効率の指標として計算は6,8小脳の解析周辺遺伝子デリバリー後中枢神経系伝達性の迅速かつ信頼性の高いインデックスをあると証明したし、さまざまな周辺機器、中央へ遺伝子導入を試みるアプローチを適用する必要があります。

<table><tbody><tr><td>Scale</td><td>Pelouze</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene bucket</td><td>Thermo Scientific</td><td>12014000</td><td>4000 mL</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Lactated Ringer&#039;s Solution</td><td>Baxter Healthcare</td><td>0338-0114-04</td><td></td></tr><tr><td>Mini vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>128101</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22624415</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory film</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>1-mL syringe</td><td>BD</td><td>309626</td><td>Comes with a 25g needle attached.&lt;br/&gt; Replace with 27-30g needle for injection</td></tr><tr><td>30g needle</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>66794-013-25</td><td>Isoflurane USP 250 mL</td></tr><tr><td>Anesthesia mask</td><td>Kopf Instruments</td><td>906</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Henry Schein</td><td>100-2524</td><td>2&quot; x 2&quot; (5cm x 5cm)</td></tr><tr><td>Pipet tips</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0816</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet</td><td>Gilson</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>Gas anesthesia vaporizer</td><td>SurgiVet</td><td>4214322</td><td>Classic T3</td></tr><tr><td>Gas anesthesia scavenger</td><td>SurgiVet</td><td>32373B10</td><td>Enviro-PURE</td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Sears</td><td>17280</td><td></td></tr><tr><td>Bench pad</td><td>VWR</td><td>56617-006</td><td></td></tr><tr><td>Rotarod</td><td>Panlab/Harvard Apparatus</td><td>76-0772</td><td>4 rats/ 4 mice</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2401</td><td>140 proof</td></tr><tr><td>70% Isopropanol</td><td>VWR</td><td>89108-160</td><td></td></tr><tr><td>Scion Image</td><td>Scion Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag Polyclonal Antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>Primary Antibody - 1:500 dilution</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11070</td><td>Secondary Antibody - 1:300 dilution</td></tr><tr><td>Axioskop 40 microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methods and tips for intravenous administration of adeno-associated virus to rats and evaluation of central nervous system transduction

アデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターでは、定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR)、オプトジェネティクス、cre lox ターゲットなどをクラスター化、神経科学の主試薬です。本稿の目的は、AAV の尾静脈注射を介してラットにおける広大な中枢神経系 (CNS) 遺伝子導入を試みている調査官を支援するためにです。広範な病理学の条件に関連する大規模な式をその大きいサイズとマウスと比較された人間に生理学的な類似性のため重要なラット モデル。この例のアプリケーションでは、大規模な神経伝達を使用して、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、脊髄全体に影響を与える神経変性疾患を模倣します。効率的な大規模な中枢神経系の情報伝達は、前臨床試験で治療上の蛋白質の要因を提供する使用できます。数週間の後注入式間隔の後、伝達の効果が評価されます。緑色蛍光タンパク質 (GFP) の制御ベクトルの小脳の GFP の量は基本的なイメージング プログラムによって、迅速かつ確実に推定されます。ALS によって誘導される運動疾患表現型関連タンパク質 transactive 応答 43 kDa (TDP-43) の DNA 結合タンパク質は、赤字脱出反射と rotarod で獲得しています。疾患モデル作製、遺伝子治療以外に、ここで説明した大規模な遺伝子ターゲットの潜在的な用途があります。このメソッドの利用拡大は、神経科学と川和で仮説を迅速に役立ちます。

TDP 43 誘導運動障害が生じれば、AAV tdp-43 使用 (図 1) 投与量に応じて 2-6 週間以内。部分的にまたはない障害; 失敗した尾静脈注射になりますAAV の効果血流に到達する必要があります。AAV GFP の成功した射出脳と脊髄を通じて GFP 発現ベクター投与量依存的になります。ドライブ式に、サイトメガロ ウイルスの鶏 β アクチン ハイブリッド プロモーター CAG プロモーターとしても知られている強力な組換えプロモーターを用いた中枢神経系だけでなく、肝臓や心臓などの他のいくつかの組織での効率的な表現があります。4,5,10内ラット中枢神経系、AAV9 や AAV の PHP を使用する場合。B ベクトル、パターンは主に神経伝達とだけ疎、散発的なグリア伝達です。4,8伝達効率に男女差が認められなかったラットにおける大規模な方法で、以来女性通常転送に使用される静脈内の遺伝子のより低い重量のため。6
説明半定量的イメージング法は、優れた信号対雑音比があると迅速かつ信頼性の高い。非導入のサンプルは、GFP 抗体で染色試料を図 2に導入されたサンプルと比較されます。これらのサンプルから収集された値は無視できると考えられる非導入のサンプル (図 2 bは、Dに掲げる値) から 0.3% のノイズを示します。優れた信号対雑音比を考えると、このメソッドはベクトル型、ベクトル量、性別、年齢などの実験条件の迅速な比較に有効です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55994/55994fig1.jpg"> 
図 1。広域 AAV9 TDP 43 遺伝子導入ラットに進歩的な運動機能に障害を引き起こします。Rotarod 遺伝子後 1-3 週間では、GFP コントロールまたは ALS 関連遺伝子 TDP 43 のいずれかの転送します。被験者は遺伝子導入の前にテストされ、その後の測定ベースライン時点に対する比率として表現しました。通常未処理ラットはこれらの条件下で 60-90 s から rotarod に滞在します。この図は、6から変更されています。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55994/55994fig2.jpg"> 
図 2。ラットに静脈内投与 AAV 後小脳における GFP 陽性蛍光領域の急速な定量化します。GFP 抗体で染色された B) 非導入、サンプルの場合。C, D) 受信 AAV9 GFP ラットからのサンプル。B, D) 赤、蛍光領域を選択的に強調するサイオン イメージ上の密度のスライス ・ オプションを使用し、プログラムによって赤のピクセルをカウントするし。C で見られるように、密度スライス オプションはすべての可視蛍光セルを強調すべきプログラムによって計算された正方形ピクセルで表される赤の領域は B、D に示すように時間のポイントは、1 x 1014ベクトル ゲノム/kg のベクトル量で若いラットに AAV9 GFP の尾静脈注射後 4 週間でした。スケール バーでは 536 μ m;A + で同じ倍率<a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55994/55994fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

メソッドおよびアデノ随伴ウイルス ラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント

ラットにおける広域中枢神経系遺伝子導入法を説明します。この例では目的は脊髄全体に影響を与える疾患を模倣するためです。広範な伝達は一時、周辺の管理からして中枢神経系治療用タンパク質を提供する使用できます。

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

methods-tips-for-intravenous-administration-adeno-associated-virus-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K ビュー.  Louisiana State University Health Sciences Center. ラットにおける広域中枢神経系遺伝子導入法を説明します。この例では目的は脊髄全体に影響を与える疾患を模倣するためです。広範な伝達は一時、周辺の管理からして中枢神経系治療用タンパク質を提供する使用できます。

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Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific subsets of cells in different brain regions both in vivo and in brain sections. Unlike the injection of fluorescent dyes, viral labeling offers targeting of individual cell types and is less expensive and time consuming than establishing transgenic mouse lines. In this technique, an adeno-associated viral (AAV) vector is injected intracranially using stereotaxic coordinates, a micropipette and an automated pump for precise delivery of AAV to the desired area with minimal damage to the surrounding tissue. Injection parameters can be tailored to individual experiments by adjusting the animal age at injection, injection location, volume of injection, rate of injection, AAV serotype and the promoter driving gene expression. Depending on the conditions chosen, virally-induced transgene expression can allow visualization of groups of cells, individual cells or fine cellular processes, down to the level of dendritic spines. The experiment shown here depicts an injection of double-stranded AAV expressing green fluorescent protein for the labeling of neurons and glia in the mouse primary visual cortex.

Here we present the intracranial injection of AAV vectors for fluorescent labeling of neurons and glia in the visual cortex.

アデノ随伴ウイルスベクターの頭蓋内注射

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

神経科学

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

病における網膜障壁を研究するツールとしてアデノ随伴ウイルスを使用して、

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

医学

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの定位注射を介して、パーキンソン病のα-シヌクレインベースのラットモデルの開発

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. Using subpially-placed polyethylene catheters (PE-10 or PE-5) for AAV9 delivery, potent transgene expression through the spinal parenchyma (white and gray matter) in subpially-injected spinal segments has been demonstrated. Because of the wide range of transgenic mouse models of neurodegenerative diseases, there is a strong desire for the development of a potent central nervous system (CNS)-targeted vector delivery technique in adult mice. Accordingly, the present study describes the development of a spinal subpial vector delivery device and technique to permit safe and effective spinal AAV9 delivery in adult C57BL/6J mice. In spinally immobilized and anesthetized mice, the pia mater (cervical 1 and lumbar 1-2 spinal segmental level) was incised with a sharp 34 G needle using an XYZ manipulator. A second XYZ manipulator was then used to advance a blunt 36G needle into the lumbar and/or cervical subpial space. The AAV9 vector (3-5 &#181;L; 1.2 x 1013 genome copies (gc)) encoding green fluorescent protein (GFP) was then injected subpially. After injections, neurological function (motor and sensory) was assessed periodically, and animals were perfusion-fixed 14 days after AAV9 delivery with 4% paraformaldehyde. Analysis of horizontal or transverse spinal cord sections showed transgene expression throughout the entire spinal cord, in both gray and white matter. In addition, intense retrogradely-mediated GFP expression was seen in the descending motor axons and neurons in the motor cortex, nucleus ruber, and formatio reticularis. No neurological dysfunction was noted in any animals. These data show that the subpial vector delivery technique can successfully be used in adult mice, without causing procedure-related spinal cord injury, and is associated with highly potent transgene expression throughout the spinal neuraxis.

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

The goal of the present study was to develop and validate the potency and safety of spinal adeno-associated virus 9 (AAV9)-mediated gene delivery by using a novel subpial gene delivery technique in adult mice.

成体マウスにおける子宮頸部アデノ随伴ウイルス9（AAV9）ベクター送達

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

アデノ随伴ウイルスを介する遺伝子発現により脊髄のニューロンを遺伝的に定義されています。

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, and excellent transduction efficacy in the CNS.&#160;Previous studies have demonstrated the therapeutic potency of AAV-delivered gene therapy in neurodegenerative disorders by IT administration. However, high rates of unpredictable failure due to the technical limitation of IT administration in small animals have been reported. Here, we established a scoring system to indicate the success extent of lumbar puncture in small animals by adding 1% lidocaine hydrochloride into the injection solution. We further show that the extent of transient weakness following injection can predict the transduction efficiency of AAV. Thus, this IT injection method can be used to optimize therapeutic trials in mouse models of CNS diseases that afflict wide regions of the CNS.

Here we present a direct intrathecal injection technique using 1% lidocaine hydrochloride in a viral solution to ensure efficient adeno-associated virus delivery to small animals and establish a scoring system to predict transduction efficiency in the central nervous system according to the degree of transient weakness induced by lidocaine.

成体マウスの遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注入

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

生産・精製・ アデノ随伴ウイルスを用いたベクトルの品質管理

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

CNS遺伝子治療のための幼若ラットにおけるAAV9の腰椎穿刺送達

Intrathecal Vector Delivery in Juvenile Rats via Lumbar Cistern Injection

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a toxic gene, or provide a gene whose product can modulate the biology of the disease. The delivery method for the therapeutic vector can take many forms, ranging from intravenous infusion for systemic delivery to direct injection into the target tissue. For neurodegenerative disorders, it is often desirable to skew transduction towards the brain and/or spinal cord. The least invasive approach to target the entire central nervous system involves injection into the cerebrospinal fluid (CSF), allowing the therapeutic to reach a large fraction of the central nervous system. The safest approach to deliver a vector into the CSF is the lumbar intrathecal injection, where a needle is introduced into the lumbar cistern of the spinal cord. This technique, also known as a lumbar puncture, has been widely used in neonatal and adult rodents and in large animal models. While the technique is similar across species and developmental stages, subtle differences in size, structure, and elasticity of tissues surrounding the intrathecal space require accommodations in the approach. This article describes a method for performing lumbar puncture in juvenile rats to deliver an adeno-associated serotype 9 vector. Here, 25-35 &#181;L of vector were injected into the lumbar cistern, and a green fluorescent protein (GFP) reporter was used to evaluate the transduction profile resulting from each injection. The benefits and challenges of this approach are discussed.

著者スポットライト:若年ラットにおける髄腔内遺伝子治療の有効性の評価

A surgical procedure is described to perform injections into the lumbar cistern of the juvenile rat. This approach has been used for the intrathecal delivery of gene therapy vectors, but it is anticipated that this approach can be used for a variety of therapeutics, including cells and drugs.

腰椎貯水槽注射による幼若ラットの髄腔内ベクター送達

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a ...

メソッドおよびアデノ随伴ウイルスラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント

要約

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アデノ随伴ウイルスベクターの頭蓋内注射

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

病における網膜障壁を研究するツールとしてアデノ随伴ウイルスを使用して、

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの定位注射を介して、パーキンソン病のα-シヌクレインベースのラットモデルの開発

成体マウスにおける子宮頸部アデノ随伴ウイルス9（AAV9）ベクター送達

アデノ随伴ウイルスを介する遺伝子発現により脊髄のニューロンを遺伝的に定義されています。

成体マウスの遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注入

生産・精製・アデノ随伴ウイルスを用いたベクトルの品質管理

腰椎貯水槽注射による幼若ラットの髄腔内ベクター送達

腰椎貯水槽注射による幼若ラットの髄腔内ベクター送達

メソッドおよびアデノ随伴ウイルス ラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント

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アデノ随伴ウイルスベクターの頭蓋内注射

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

病における網膜障壁を研究するツールとしてアデノ随伴ウイルスを使用して、

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの定位注射を介して、パーキンソン病のα-シヌクレインベースのラットモデルの開発

成体マウスにおける子宮頸部アデノ随伴ウイルス9（AAV9）ベクター送達

アデノ随伴ウイルスを介する遺伝子発現により脊髄のニューロンを遺伝的に定義されています。

成体マウスの遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注入

生産・精製・ アデノ随伴ウイルスを用いたベクトルの品質管理

腰椎貯水槽注射による幼若ラットの髄腔内ベクター送達

腰椎貯水槽注射による幼若ラットの髄腔内ベクター送達

メソッドおよびアデノ随伴ウイルスラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント

生産・精製・アデノ随伴ウイルスを用いたベクトルの品質管理