Name: experimental models to study the neuroprotection of acidic postconditioning against cerebral ischemia
Uploaded: 2017-07-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
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この研究は、中国国立自然科学財団（81573406,81373393,81273506,81221003,81473186および81402907）、浙江省自然科学財団（LR15H310001）およびS＆Tイノベーションチームの浙江省主導チーム（2011R50014）の資金提供を受けて行われました。

すべての実験は、浙江大学動物実験委員会の倫理指針に従って承認され、実施され、実験動物の管理と使用のための国立衛生研究所ガイドラインに完全に準拠していた。痛みや不快感を最小限に抑えるための努力がなされ、最低限の動物数が使用された。 コルチコステリアスライスのOGD <ol><li> ソリューションの準備： <ol><li>準備した1000mLのR-ACSF（124ミリモル/ LのNaCl、5ミリモル/ LのKCl、1.25ミリモル/ L KH 2 PO 4、2ミリモル/ LのMgSO 4、26ミリモル/ LのNaHCO 3、2モル/ LのCaCl 2、グルコース10mmol / L、最終pH7.4）。実験を通して、5％CO 2および95％O 2を有するバブル。 </li><li> 5％CO 2と95％N 2でバブリングしたグルコースを除いて、上記のようにグルコースを含まない200mlのACSF（gf-ACSF）を調製する。 brに適用する前に30分間ガスをバブリングする溶液中の酸素含有量を減少させる。 OGD手順が終了するまでバブリングを続ける。 </li><li> 20％CO 2および80％O 2を含む 200mL r-ACSFを平衡化することによって酸性ACSF（a-ACSF）を調製する。脳のスライスに適用する前に30分間ガスを泡立てて、溶液のpHをpH6.8に下げ、APC手順が終了するまでバブリングを続ける。 </li><li> 3つの組織ホルダーをそれぞれr-ACSF、gf-ACSF、a-ACSFに入れる。 </li></ol></li><li> 脳スライス調製： 注：8週齢のオスC57Bl / 6Jマウスをこの研究で使用した。動物を制御された温度（22±2℃）で12時間の明暗サイクル期間およびペレット状の食物および水に接近させて収容した。 <ol><li>誘導チャンバー内でイソフルラン過剰用量でマウスを犠牲にする。マウスを断つ。小さなはさみと鉗子を使って脳を解剖する。薄いスパチュラで脳を取り出し、注意深くガラスビーカーに落とす5％CO 2および95％O 2で平衡化した氷冷r-ACSFを補充した。 注：これらの手順は、できるだけ迅速かつ細心の注意を払って行う必要があります。 </li><li>氷冷r-ACSF中に脳を5分間保持する。脳の動きを避けるためにガス圧を調整します。 </li><li> 2つのストリップでビブラトームプレートに寒冷沈降糊を置きます。脳を支えるために刃から離れて接着ストリップの上に3％アガロースの片を入れてください。 </li><li>氷上で10cmのペトリ皿を逆さまにして、ろ紙にろ紙をのせます。氷冷したr-ACSFを滴下して濾紙を湿らせます。 </li><li>鉗子で脳を濾紙に移す。前頭と小脳を刃と鉗子で切断する。 注：横断面は可能な限り滑らかで、矢状面に垂直でなければなりません。 </li><li>残りの脳組織を垂直に接着剤の他のストリップ上に置き、脳をアガロースに対して傾けたままにしておきます。切断用リザーバーに氷冷r-ACSFを加えて脳を水没させ、氷を氷ホルダーに加える。リザーバー内のr-ACSFを5％CO 2と95％O 2でバブリングしたままにしておきます。 </li><li>リザーバーを上げ、カミソリの位置を調節して、できるだけ脳の近くに、そして脳のすぐ上にカミソリを置きます。 </li><li>脳の切片を連続的にスライスするには、「連続」モードを選択します。切断厚さを400μm、振動周波数を6〜8、速度を3〜4に設定します。「開始/停止」ボタンを押して自動切断を開始します。 </li><li> 3mLのパスツールピペットの先端を切り、脳スライスの大きさに合った開口部を作ります。 注：開口部は、脳スライスへのさらなる損傷を回避するのに十分な大きさでなければなりません。 </li><li> tip-cutPasteurピペットで5つの脳スライスを1つずつ引き出し、5％CO 2および95％O 2で泡立てた氷冷r-ACSF中に組織ホルダーに入れる。作成された最初のスライスを収集しないでください。ガス圧力を調整する脳スライスの動き。 注：脳スライスはお互いに覆われてはいけません。 </li><li>脳スライスをr-ACSFと共に室温で30分間、次いで水浴中で37℃でさらに10分間置いてシナプス機能を回復させる。 </li></ol></li><li> OGDとAPC： <ol><li> gf-ACSFとa-ACSFを37℃の水浴中に置き、上記の1.1.2と1.1.3の対応するガスでバッファーを30分間バブリングする。 </li><li>コントロールとしてr-ACSFに1つのスライスを残す。他の4つの脳スライスを、予熱したgf-ACSFを慎重に組織ホルダーに移し、15分間インキュベートする。 r-ACSFの組織ホルダーにスライスを戻して再灌流を達成する。 </li><li> APCの時間枠を調べるには、gf-ACSFからa-ACSFに直接1つのスライスを転送します。他の3つのスライスを最初にr-ACSFに移し、その後再灌流の5分後および15分後にACSFで2つを組織ホルダーに移す。 </li><li> Incubata-ACSF内の2つのスライスを3分間抽出し、r-ACSFに戻します。 r-ACSF中の3つのスライスをさらに1時間インキュベートする。 r-ACSFの残りのスライスをOGDグループとして設定します。 </li><li>用量応答試験のために、OGD後最初にr-ACSF中の4つの切片を組織ホルダーに移し、5分間インキュベートする。次に、1つのスライスをOGDグループとしてr-ACSFに残し、他の3つのスライスをa-ACSFに転送します。 a-ACSFのスライスをそれぞれ1分、3分および5分インキュベートし、それらをr-ACSFに戻す。 r-ACSF中の3つのスライスをさらに1時間インキュベートする。 </li></ol></li><li> スライス生存度判定： <ol><li> 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩酸塩（TTC）0.25％生理食塩水を0.25％調製する。 500mLの生理食塩水に1.25gのTTC粉末を加える。 注：粉末が完全に溶解した後、溶液を24穴プレート（1ウェルあたり500μL）に移し、4℃で保存します。 TTCおよびTTCで染色された組織は軽い味方。 </li><li>スライスをTTC溶液を含む24ウェルプレート（ウェルあたり1スライス）に移し、溶液中のスライスを引き伸ばします。切片をTTC溶液中で37℃で浅い水浴中で30分間インキュベートする。 </li><li>箔で覆われた清潔な1.5 mL遠心チューブにスライスを移し、スライスの乾燥重量を測定する。 </li><li>遠心分離管（v：w = 10：1）にエタノール/ジメチルスルホキシド（1：1）を加えてホルマザンを抽出する。 24時間、室温からエタノール/ジメチルスルホキシド中の薄片を光から離してインキュベートする。 </li><li>チューブ中のすべてのエタノール/ジメチルスルホキシドを96ウェルプレートに加え、プレートリーダーで490nmでの吸光度を測定する。 </li><li>吸光度をスライスの乾燥重量に正規化し、生存率を対照スライスのパーセンテージとして表す。 </li></ol></li></ol> 2. MCAO <ol><li> 準備： <ol><li>作業台、レーザードップラーフローメーターの表面を消毒するy（LDF）機器と70％エチルアルコールを含むアクセサリを使用してください。 </li><li>オートクレーブされた器具を準備する：2本のはさみ、10cm; 2つの鉗子、10cm; 1つの眼科用鉗子、11cm; 1つのマイクロ眼科はさみ、9cm; 1つの微小血管クランプ、1.8cm; oneneedle drive、r 12.5 cm;いくつかの外科用縫合糸（△1/2 4×10）;綿棒。 </li><li>塩水でシリンジ（針なし）を準備し、水和された手術領域を維持する。 </li><li>麻酔ガス（100％O 2 +イソフルラン）を準備する。 </li></ol></li><li> 脳血流の検出： <ol><li> LDF装置をセットアップします。 </li><li>鎮痛薬をマウスに腹腔内注射する：metamizol 200mg / kg、carprofen 4mg / kgおよびbuprenorphin 0.1mg / kg。 </li><li> 4％イソフルランを酸素に入れた誘導チャンバーにマウスを乗せ、麻酔をかけて体の動きを止め、静脈瘤を止める。 </li><li>マウスを腹を立てた位置に置き、次の手順のためにイソフルランを1.5％に維持する。 </li><li>両眼にデクスパンテノール眼軟膏を塗布する。 </li><li> 70％エチルアルコールでヘッドを消毒する。 </li><li>ブレグマを暴露するためにメスを使用して、目と耳の間に適切なパラメディア皮膚切開を行います。 </li><li>滅菌綿で頭蓋骨をこする。 </li><li>頭蓋骨の表面に1〜2滴の外科用接着剤を塗布する。 </li><li>ブレグマに5 mmの尾側に光ファイバプローブの先端を置き、正中線に6 mmの横方向に配置する。 </li><li>血流をコンピュータソフトウェアに記録し始める。安定した血流のベースラインが得られるまで待ってから、接着剤に20μLの触媒を塗布してプローブを固定します。 注：理想的なベースラインは500以上のフラックスでなければなりません。 </li><li>ベースラインが200フラックス未満の場合は、適切なベースラインを得るために細かく位置を調整します。実験の間、プローブを頭蓋骨に取り付けたままにしておきます。 </li><li>ヨードフォアで頭部を消毒する光ファイバープローブが取り付けられています。 </li></ol></li><li> MCAO： <ol><li>麻酔したマウス（その頭蓋骨に取り付けられたLDFプローブ付き）を仰臥位に置き、固定し、外科手術中に加熱ランプを用いて体温を維持する。 70％エチルアルコールで首を消毒する。 </li><li>メスを使って首にパラミードの皮膚を切開する。柔らかい組織を鉗子で切開して血管を露出させる。 1滴の生理食塩水を曝露された組織に加えて、それらを水和させておく。 </li><li>眼の鉗子を使用して周囲の組織および迷走神経から総頸動脈を解剖する。迷走神経を損傷しないように注意してください。総頚動脈を露出させた後、ヨードフォアで再度首の皮膚を消毒する。 </li><li>総頸動脈の遠位端に微小血管クランプを置き、近位端に6-0の絹の縫合糸を用いて死んだ結び目を結ぶ。後続の操作のためにクランプをできるだけ近位に配置する。長さクランプとデッドノットとの間の容器は、その後の操作のためにできるだけ長い。 </li><li>緩い結び目を結ぶことで、クランプの近位に一時的な縫合を行います。モノフィラメントを挿入するために、2つの節の間に十分なスペースがあることを確認します。 </li><li>マイクロ眼科はさみで2つの結び目の間で縦方向の切開を行います。切開部が後続の操作のためにできるだけデッドノットに近づいていることを確認する。船を切らないように注意してください。 </li><li>切開を通して12mmの先端が鈍くなったモノフィラメントを挿入して、動脈内腔に入り、数mm前進させる。モノフィラメントの先端付近の緩い結び目を締め、クランプを取り外します。 </li><li> LDFソフトウェアが血流の急激な減少（ベースライン血流からの&gt; 80％の減少）を示すまで、眼科用鉗子でフィラメントを内頸動脈（中大脳動脈を塞ぐために10mm）に前進させる。オクルージョンの開始時刻を記録します。 注：LDF計測器のセットアップは次のとおりです。セクション2.2で説明します。 </li><li>中大脳動脈を1時間閉塞する。 LDFプローブを切断し、オクルージョンの持続時間の間、マウスを30℃のインキュベーターに入れる。 </li></ol></li><li> 再灌流およびAPC： <ol><li>閉塞の開始の55分後に上記のようにイソフルランで動物を再麻酔する。マウスを仰臥位に置き、固定する。首の切開を開き、総頸動脈を再度露出させる。 </li><li>閉塞後に眼科用鉗子でフィラメントを静かに引き出して再灌流を行い、結び目を締めて一時的縫合糸を永久縫合糸に変えます。 </li><li>アシドーシスの治療のために、再灌流後5、50、または100分で20％5分間、CO 2、20％O 2及び60％N 2を含む混合ガスにノーズコーンに吸入ガスを変更します。切断された外科用縫合糸で切開部を閉じる。 </li><li>マウスが意識を回復するまで30℃の熱ケージにマウスを置くマウスを清潔な個々のケージに戻します。水と湿った食物のペトリ皿をマウスに提供する。過度の痛みと死亡の手術後にマウスを注意深く監視する。 </li></ol></li><li> 脳梗塞体積測定： <ol><li>再灌流の24時間後にTTC染色を用いて脳梗塞体積を測定する。 </li><li>指定された犠牲の時間の前に、ステップ1.4.1で述べたように0.25％TTC溶液を調製する。箔で覆われた24ウェルプレート（1ウェルあたり1 mL）に溶液を移し、4℃で保存する。 注：TTCおよびTTCで染色された組織は光感受性である。 </li><li>再灌流の24時間後、誘導チャンバー内でイソフルラン過剰投与動物を屠殺する。マウスを断つ。小さなはさみと鉗子を使って脳を解剖する。 Willis Circleでくも膜下出血を起こしたマウスを除外するために、脳の肥厚点を調べる。 </li><li> -20°の清潔なガラススライド上に脳を置きます<html> ; C氷パック。脳とスライスを-20℃の冷蔵庫に5分間置き、脳のスライスを容易にします。 </li><li>脳とスライドガラスを-20℃から取り出し、-20℃の氷上に戻します。前頭極と小脳を刃と鉗子で解剖する。 </li><li>脳切片を水平にスライスして1mmの厚さにし、刃で5枚のスライスを作ります。スライスをTTC溶液（1ウェルあたり1スライス）を含む24ウェルプレートに鉗子で移し、溶液中のスライスを引き伸ばす。切片をTTC溶液中で37℃で浅い水浴中で30分間インキュベートする。 </li><li> TTC溶液を吸引する。 10％ホルムアルデヒド（ウェルあたり1mL）を添加し、室温で30分間インキュベートする。セロファンシート上に切断された順番にスライスを置き、セグメントを写真プレートイメージャにスキャンする。 </li><li> ImageJ解析ソフトウェアを使用して脳全体のスライスのパーセンテージとして梗塞サイズを分析するlass = &quot;xref&quot;&gt; 8である。 図2 （左）を参照してください。 </li></ol></li></ol>

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著者は何も開示することはない。

ここでは、脳虚血に対するAPCの神経保護を研究するための2つの実験モデルを提示する。脳切片において、APCは、再灌流後に20％CO 2で泡立てた酸性緩衝液中でマウスの皮質層をスライスすることによって達成されるが、MCAOモデルでは、再灌流後に20％CO 2を吸入することによってAPCが達成される。両方のモデルは、脳虚血に対するAPCの神経保護を反映する。保護は、虚血後事後調整によって達成されたものと同等であったが、より広い時間枠を有していた。 MCAOモデルでは、再灌流後50分、虚血後事後調整10分と比較して時間窓が長くなる可能性がある15 。さらに、APCの手順はより簡単で安全です。 皮質層スライスモデルでは、脳スライスの生存率を最大限に保証するために、穏やかで迅速な操作が重要です。 MCAOの性能については、脳血流モニタリングは、中大脳動脈の閉塞を確実にするために血流の急激な低下を観察しなければならない。脳をTTC染色のために解剖した後、クモ膜下出血を排除するためには、脳の注意深い検査が必要である。 アシドーシスの延長および期間は、APCの神経保護を達成するために重要である。アシドーシス治療の持続期間は、皮質層スライスモデルにおいて有益ではない（ 図 1A ）。さらに、我々の以前の研究は、30％のCO 2吸入よりも10％および20％のCO 2吸入がマウスの神経保護を与えることを示した8 。これらは、軽度のアシドーシスがAPCの神経保護に重要であることを示唆しているため、アシドーシスの神経保護にはCO 2の濃度およびAPCの持続時間が不可欠です。 TTC染色に加えて、多くの技術をs多様な研究ニーズを満足させる。例えば、細胞外電気記録を最終ステップに加えて、虚血およびアシドーシスが神経電位にどのように影響するかを観察することができる16 。脳スライスの灌流溶液を回収して、APC後のアミノ酸の神経伝達物質の濃度変化をHPLCで測定することもできる17 。特定の脳領域のスライスは、虚血およびAPCに対する特定の領域の応答を研究するために準備することができる。全体として、虚血およびアシドーシスの影響を明らかにするために、多くの選択肢を導入することができる。

脳卒中は世界中の死亡および障害の主要な原因の1つです。過去数十年間に脳卒中の有効な治療法を見出すために大きな努力がなされてきたが、達成は非常に不十分である。ポストコンディショニングは、虚血性エピソードに続く亜毒性ストレスによって操作されるプロセスである。ポストコンディショニングは、虚血、低酸素、低血糖およびリモート虚血ポストコンディショニングを含め、内因性の適応メカニズムをトリガーし、脳虚血1、2、3、4に対する治療を有望であることが証明されてきました。しかし、虚血後事後調整は、さらなる損傷を導入する可能性がある。同側または両側後肢5、6、7日に20分間閉塞および再灌流-通常5の数サイクルを必要とするリモート虚血ポストコンディショニングを四肢。 Thそのため、これらの事後条件付け操作は臨床的に危険であり実用的ではありません。これらの欠点を克服するために、我々はマウスにおける局所脳虚血の治療薬としてAPCを開発した8 。単に20％CO 2を吸入することによって誘発されるAPCは、虚血性脳損傷をより現実的かつより安全な方法で有意に低減する。最近、我々は、APCが再灌流ウインドウを拡張し、脳卒中治療9に対するAPCの意義を強調していることを証明した。 ここでは、脳虚血に対するAPCの神経保護を研究するための2つの実験モデルを提示する。最初のものは、マウスの皮質層スライスの酸素 - グルコース欠乏（OGD）モデルである。人工脳脊髄液（ASCF）のような人工環境への脳スライスの迅速な調製および伝達は、細胞生存能力およびニューロン回路を維持することができ、インビトロで脳機能を研究することを可能にする10 &lt;11 。 ASCF模倣におけるOGD脳虚血及び虚血性傷害12、13、14を誘導します。 OGDの後、脳スライスを通常のASCF（r-ASCF）で再灌流して再灌流を行い、次いで20％CO 2で泡立てた酸性ASCFを用いてAPCで処置する。皮質層スライスは、初代培養細胞と比較して無傷の組織学的特徴付けを維持する。 インビボで脳機能を研究するために、マウス中大脳動脈閉塞（MCAO）モデルを使用する。中大脳動脈は、総頸動脈を介して火炎平滑モノフィラメントを挿入することによって閉塞される。最も広く使用される脳卒中モデルの1つとして、MCAOモデルは臨床的関連性を示し、モノフィラメントの適用は再灌流をより容易に達成する。再灌流開始後に20％CO 2を含む酸素正常混合ガスを吸入するだけでAPCは、脳梗塞容積の減少によって示される脳虚血に対して有意な保護効果を示した。

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol</td><td>Aladdin Industrial Corporation</td><td>E111993</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Laser Doppler Flowmetry</td><td>Moor Instruments Ltd</td><td>Model Moor VMS-LDF2</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether anhydrous</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Corporation</td><td>80059618</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetaldehycle hydrate</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Corporation</td><td>30037517</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin</td><td>Aladdin Industrial Corporation</td><td>F111936</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Jet Biofil</td><td>TCP-010-024</td><td></td></tr></tbody></table>

experimental models to study the neuroprotection of acidic postconditioning against cerebral ischemia

脳卒中は限られた治療法を用いて世界中の死亡および障害の主要な原因の1つです。神経保護のための内因性戦略として、事後コンディショニング治療は、脳虚血に対する有望な治療法であることが証明されている。しかしながら、複雑な処置および潜在的な安全性の問題は、それらの臨床適用を制限する。これらの欠点を克服するために、我々は、実験的局所脳虚血の治療法として、酸性後条件付け（APC）を開発した。 APCは、虚血後の再灌流中にCO 2を吸入することによる軽度のアシドーシス治療を指す。ここでは、APC をインビトロおよびインビボで実行するための2つのモデルをそれぞれ示します。マウスの酸素グルコース欠乏（OGD）処置およびマウスの皮質層の閉塞および中大脳動脈閉塞（MCAO）を用いて、脳虚血を模倣した。 APCは、脳スライスを20％CO 2で泡立てた酸性緩衝液に移すことによって簡単に達成することができる20％CO 2をマウスに吸入させる。組織生存率および脳梗塞容積に反映されるように、APCは脳虚血に対して有意な保護効果を示した。

上記の皮質層スライスモデルにおいて、皮質層のスライス生存率を、再灌流1時間後のTTCアッセイによって定量化した。 TTC変換は、490nmでの吸収を対照スライスに正規化することによって計算した。 TTC変換によれば、APCは、発症時間および持続時間依存的様式で、OGD誘発再灌流損傷に対して保護した。詳細には、1分および3分のアシドーシス治療は、15分のOGD後5分で生存率を有意に改善したが、5分は認めなかった（OGD：0.609±0.029,5 / 1：0.758±0.034,5 / 3：0.821±0.041、 5/5：0.672±0.053、データは平均±SEMとして報告された）（ 図 1A ）。アシドーシス治療による神経保護は、再灌流後5分以内に保護されたままであったが、15分（OGD：0.584±0.044,0/3：0.762±0.036,5/3：0.833±0.062,15/3：0.627±0.038）（ 図1 </strong&gt; B ）。 MCAOモデルでは、再灌流発症5分後に開始した5分間のアシドーシス治療は、梗塞容積（MCAO：33.4±4.4％、5/5：16.6±2.7％、50 / 5：19.5±2.1％、100/5：37±2.1％）。発症時間が再灌流後50分に遅れた場合でさえ、神経保護は依然として頑強であった。しかし、100分で開始したアシドーシス治療は、虚血性傷害をブロックしなかった（ 図2 ）。 すべてのデータを収集し、盲目的に分析した。データは、平均±SEMとして示す。皮質層スライスモデルでは、各グループは6〜8個のサンプルを有する。 MCAOモデルでは、各グループに9〜10のサンプルがあります。最も有意差のない一元配置分散分析を多重比較に適用した。 図1 。コルチコステロイドスライスにおけるOGD誘発再灌流障害に対するAPCの防御。コルチコステリアスライスを、示された期間（A）のアシドーシス（pH6.8）で処置し、OGD後の回復期間（B）を示した。再灌流後24時間で3- [4,5-ジメチルチアゾール-2-イル] -2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイドアッセイにより細胞生存率を評価し、再灌流1時間後のTTCアッセイによりコルチコスト生存率を定量した。値は平均±SEMを示す。各グループについてn = 6〜8; *片側分散分析によってp &lt;0.05および** p &lt;0.01; R、再灌流。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55931/55931fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt= &quot;図2&quot; class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55931 / 55931fig2.jpg&quot; /&gt; 図2。 APCはマウスにおけるMCAO誘発傷害に対して保護する。動物に60分間のMCAOを施し、再灌流の5,50、または100分後に20％CO 2を5分間吸入することによって処置した。梗塞容量は、再潅流24時間後の2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩酸塩染色によって定量した（左パネルに黒い点線で示す）。値は平均±SEMを示す。各グループについてn = 8~10; *片側分散分析によってp &lt;0.05および** p &lt;0.01; R、再灌流。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55931/55931fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

酸性ポストコンディショニングは、脳虚血を防ぐ。ここでは、APCを実行する2つのモデルを示します。それらはインビトロで酸素 - グルコース欠乏後に皮質層スライスを酸性緩衝液に移し、インビボで中大脳動脈閉塞後に20％CO 2を吸入することによってそれぞれ達成される 。

脳虚血に対する酸性ポストコンディショニングの神経保護を研究するための実験モデル

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.4K ビュー.  Zhejiang University. 酸性ポストコンディショニングは、脳虚血を防ぐ。ここでは、APCを実行する2つのモデルを示します。それらはインビトロで酸素 - グルコース欠乏後に皮質層スライスを酸性緩衝液に移し、インビボで中大脳動脈閉塞後に20％CO 2を吸入することによってそれぞれ達成される 。 

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Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by development of effective, easy to administer and safe preconditioning treatments. We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. Low-level pro-inflammatory mediator signaling changes over time are essential for cold-preconditioning neuroprotection. This signaling is consistent with the basic tenets of physiological conditioning hormesis, which require that irritative stimuli reach a threshold magnitude with sufficient time for adaptation to the stimuli for protection to become evident.
Accordingly, delineation of the immune signaling involved in cold-preconditioning neuroprotection requires that biological systems and experimental manipulations plus technical capacities are highly reproducible and sensitive. Our approach is to use hippocampal slice cultures as an in vitro model that closely reflects their in vivo counterparts with multi-synaptic neural networks influenced by mature and quiescent macroglia / microglia. This glial state is particularly important for microglia since they are the principal source of cytokines, which are operative in the femtomolar range. Also, slice cultures can be maintained in vitro for several weeks, which is sufficient time to evoke activating stimuli and assess adaptive responses. Finally, environmental conditions can be accurately controlled using slice cultures so that cytokine signaling of cold-preconditioning can be measured, mimicked, and modulated to dissect the critical node aspects. Cytokine signaling system analyses require the use of sensitive and reproducible multiplexed techniques. We use quantitative PCR for TNF-&alpha; to screen for microglial activation followed by quantitative real-time qPCR array screening to assess tissue-wide cytokine changes. The latter is a most sensitive and reproducible means to measure multiple cytokine system signaling changes simultaneously. Significant changes are confirmed with targeted qPCR and then protein detection. We probe for tissue-based cytokine protein changes using multiplexed microsphere flow cytometric assays using Luminex technology. Cell-specific cytokine production is determined with double-label immunohistochemistry. Taken together, this brain tissue preparation and style of use, coupled to the suggested investigative strategies, may be an optimal approach for identifying potential targets for the development of novel therapeutics that could mimic the advantages of cold-preconditioning.

We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. We present strategies for such work that require biological systems, experimental manipulations plus technical capacities that are highly reproducible and sensitive.

コー​​ルド - プレコンディショニングによる神経保護の研究のための戦略

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by ...

神経科学

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

マウスの永久中大脳動脈結紮の応用

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

医学

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

局所脳虚血への早期虚血耐性を誘導するために適切な前処理刺激として二国間の総頚動脈閉塞

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

2血管閉塞/低血圧：グローバル脳虚血のラットモデル

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats

Post-stroke depression (PSD) is the most recurrent of all psychiatric complications resulting from an ischemic stroke. A greater majority (about 60%) of all ischemic stroke patients suffer from PSD, a disorder considered to be an ischemic stroke-related precursor for increased death and degradation in health. The pathophysiology of PSD is still obscure. To study the mechanism of development and occurrence of PSD further, and to find out a therapy, we attempted to develop a new protocol that requires occluding the middle cerebral artery (MCA) via the internal carotid artery (ICA) in rats. This protocol describes a model of PSD induced in rats through the middle cerebral artery occlusion (MCAO). Also used in the experiment are the Porsolt forced swim test and the sucrose preference test to confirm and evaluate the depressive mood of the rats under investigation. Rather than inserting the catheter through the external carotid artery (ECA), as stipulated for the original procedure, this MCAO technique has the monofilament passing directly through the ICA. This MCAO technique was developed a few years ago and leads to a reduction in mortality and variability. It is generally accepted that the criteria used are preferred in the selection of biological models. The data obtained with this protocol show that this model of MCAO could be a way of inducing PSD in rats and could potentially lead to the understanding of the pathophysiology and the future development of new drugs and other neuroprotective agents.

Here we present a protocol to induce post-stroke depression in rats by occluding the middle cerebral artery via the internal carotid artery. We use the Porsolt forced swim test and the sucrose preference test to confirm and evaluate induced depressive moods.

ラットの脳卒中後うつ病を誘導するための中大脳動脈閉塞技術

Post-stroke depression (PSD) is the most recurrent of all psychiatric complications resulting from an ischemic stroke. A greater majority (about 60%) of ...

行動学

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

脳Microslicesの興奮毒性刺激<em&gt;インビトロ</em&gt;脳卒中のモデル

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

マウスにおける反復低酸素プレコンディショニングと過渡中大脳動脈閉塞後に神経血管保護の定量

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of motor and cognitive disabilities. Its high prevalence poses a serious health burden, as stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide1. Recovery of neuronal function is, in most cases, only partial. So far, treatment options are very limited, in particular due to the narrow time window for thrombolysis2,3. Determining methods to accelerate recovery from stroke remains a prime medical goal; however, this has been hampered by insufficient mechanistic insights into the recovery process. Experimental stroke researchers frequently employ rodent models of focal cerebral ischemia. Beyond the acute phase, stroke research is increasingly focused on the sub-acute and chronic phase following cerebral ischemia. Most stroke researchers apply permanent or transient occlusion of the MCA in mice or rats. In patients, occlusions of the MCA are among the most frequent causes of ischemic stroke4. Besides proximal occlusion of the MCA using the filament model, surgical occlusion of the distal MCA is probably the most frequently used model in experimental stroke research5. Occlusion of a distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA branch typically spares the striatum and primarily affects the neocortex. Vessel occlusion can be permanent or transient. High reproducibility of lesion volume and very low mortality rates with respect to the long-term outcome are the main advantages of this model. Here, we demonstrate how to perform a chronic cranial window (CW) preparation lateral to the sagittal sinus, and afterwards how to surgically induce a distal stroke underneath the window using a craniotomy approach. This approach can be applied for sequential imaging of acute and chronic changes following ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Surgical occlusion of a distal middle cerebral artery branch (MCAo) is a frequently used model in experimental stroke research. This manuscript describes the basic technique of permanent MCAo, combined with the insertion of a lateral cranial window, which offers the opportunity for longitudinal intravital microscopy in mice.

横慢性頭蓋窓の準備を有効<em&gt;インビボ</em&gt;マウスの遠位中大脳動脈閉塞後に観測

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

ラットの急性脳卒中後の脳回復を評価する前臨床モデル

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

ECAが保存された修正MCAO/Rモデルにより、再灌流と安定性が向上

A Modified Model Preparation for Middle Cerebral Artery Occlusion Reperfusion

The middle cerebral artery occlusion reperfusion (MCAO/R) model is crucial for understanding the pathological mechanisms of stroke and for drug development.However, among the commonly used modeling methods, the Koizumi method often faces scrutiny due to its ligation of the common carotid artery (CCA) and its inability to achieve adequate reperfusion. Similarly, the Longa method has been criticized for disconnecting and ligating the external carotid artery (ECA). This study aims to introduce a modified model preparation method that preserves the integrity of the ECA, involves inserting a monofilament nylon suture through the CCA, repairing the ligated CCA incision, and maintaining reperfusion from the CCA. Reperfusion of blood flow was confirmed using laser speckle flow imaging. Evaluation methods such as the Longa scale, Modified Neurological Severity Score, triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining, and immunofluorescence labeling of neurons demonstrated that this approach could induce stable ischemic nerve damage. This modified MCAO/R model protocol is simple and stable, providing valuable guidance for practitioners in the field of cerebral ischemia.

著者スポットライト:脳虚血モデリングへの新しいアプローチ–再灌流の強化と手順の簡素化

This protocol describes the process of preparing for middle cerebral artery occlusion reperfusion via the common carotid artery.

脳虚血に対する酸性ポストコンディショニングの神経保護を研究するための実験モデル

要約

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コールド - プレコンディショニングによる神経保護の研究のための戦略

マウスの永久中大脳動脈結紮の応用

局所脳虚血への早期虚血耐性を誘導するために適切な前処理刺激として二国間の総頚動脈閉塞

2血管閉塞/低血圧：グローバル脳虚血のラットモデル

ラットの脳卒中後うつ病を誘導するための中大脳動脈閉塞技術

脳Microslicesの興奮毒性刺激

マウスにおける反復低酸素プレコンディショニングと過渡中大脳動脈閉塞後に神経血管保護の定量

横慢性頭蓋窓の準備を有効

ラットの急性脳卒中後の脳回復を評価する前臨床モデル

中大脳動脈閉塞再灌流のための修正モデル調製

脳虚血に対する酸性ポストコンディショニングの神経保護を研究するための実験モデル

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コー​​ルド - プレコンディショニングによる神経保護の研究のための戦略

マウスの永久中大脳動脈結紮の応用

局所脳虚血への早期虚血耐性を誘導するために適切な前処理刺激として二国間の総頚動脈閉塞

2血管閉塞/低血圧：グローバル脳虚血のラットモデル

ラットの脳卒中後うつ病を誘導するための中大脳動脈閉塞技術

脳Microslicesの興奮毒性刺激

マウスにおける反復低酸素プレコンディショニングと過渡中大脳動脈閉塞後に神経血管保護の定量

横慢性頭蓋窓の準備を有効

ラットの急性脳卒中後の脳回復を評価する前臨床モデル

中大脳動脈閉塞再灌流のための修正モデル調製

コールド - プレコンディショニングによる神経保護の研究のための戦略