Name: a novel mammary fat pad transplantation technique to visualize the vessel generation of vascular endothelial stem cells
Uploaded: 2017-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
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この研究は、中国国立科学財団（31530045および31371500、YAZ、31401245からQCY）、中国科学技術省（2014CB964800）、中国科学アカデミー（XDB19000000からYAZ）、および中国細胞生物学会（QCYへの早期キャリアフェローシップ）。

実験手順は、承認されたプロトコールSIBCB-NAF-15-002-S335-003の下で、上海生化学および細胞生物学研究所の中国科学アカデミーのアニマルケアおよび使用委員会によって承認された。 1.マウス乳腺からのVESCの単離<ol><li> 乳腺の収穫および組織消化。 <ol><li>組織ドナーとして、8週齢のアクチン-GFP成熟処女レポーターマウスを使用し、体重範囲は20〜25gです。 注：ドナーから由来する細胞は、GFP発現によって容易に追跡することができる。 </li><li> RPMI1640中の5％ウシ胎仔血清（FBS）、1％ペン/ストレプ、および25mM HEPESからなる組織消化基礎培地を調製する。この混合物を0.22μmのフィルターで濾過し、滅菌し、これを水浴中で37℃に予熱する。 </li><li> CO 2チャンバー内でマウスを犠牲にする。最初に垂直の皮膚を作ることによって、第4の鼠径乳腺の対を解剖する。メスを使用して下腹部の正中線（または外科用ハサミ）でncision。静かに片側に皮を剥がし、鉗子を使って鼠径乳腺を露出させます。両側から4番目の鼠径乳腺を得、はさみを用いて6cmのペトリ皿で細かく切る。 <ol><li>細かい組織の総重量を測定し、それを50 mLチューブに入れます。 注：得られた組織の切れ端が、各部分のサイズが1 mm 3未満であることを確認してください。典型的な収量は、1匹あたり約5,000のVESCである。 </li></ol></li><li> 50mLの蓋をした遠心分離管内の消化基礎培地を組織1g当たり10mLの容量で調製する。消化緩衝液を構成するために、消化ベース培地10mL当たり300単位の濃度でコラゲナーゼタイプ3を添加する。均等に混合し、それを組織ミンスに加える。 </li><li>水平に50 mL遠心チューブをロッキングプラットフォームに置き、速度を100 rpmに、温度を37℃に設定します。かき混ぜる乳房組織を2時間インキュベートする。適切な消化を確実にするためにチューブを20分ごとに点検し、手で振る。 注：FACSに先立つ組織消化の目的は、固形細胞から単一細胞溶液を調製することです。したがって、消化の終わりまでに、内容物は目に見える組織片なしで濃厚な溶液でなければならない。 </li></ol></li><li> 単一細胞溶液調製。 <ol><li>消化後、予め加温した滅菌PBSを含む50mL遠心分離チューブを補充し、均一に混合するようにチューブを逆さにします。チューブを200×gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを得る。 </li><li>上清を除去し、チューブの底を軽くたたいて細胞ペレットを緩めます。 3 mLの赤血球溶解バッファー（材料表を参照）を加え、室温（RT）で組織培養フード内で5分間インキュベートして、赤血球を除去する。 </li><li> 10mLの滅菌PBSを加え、均等に混合するようにチューブを逆さにする。組織の内容物を200 xgで5分間遠心分離し、ディスク上清を回収する。あらかじめ加温した0.05％トリプシン3 mLを添加し、37℃で5分間保存して残りの組織をさらに消化する。 </li><li> 3mLの予熱したIMDMを添加し、次に100μLのDNaseI溶液（1mLのPBSに希釈した0.25mgのDNaseI）を加える。 37℃でチューブを保存してDNAフィラメントを分解する。組織混合物を70μmセルストレーナーに通して細胞溶液を得る。 2 mLのPBS + 5％FBSでストレーナーを2回すすぎ、酵素消化を中和します。 </li><li> 200×gで5分間細胞混合物を遠心分離して細胞をペレット化する。上清を捨て、抗体染色のために1mLのPBS + 5％FBSに細胞ペレットを再懸濁する。 </li></ol></li><li> FACSベースのProcr + VESC分離 <ol><li>公開された慣用のプロトコール8次抗体染色にドナー乳房組織から得られた細胞混合物を供します。 注：以下の抗体を使用した：抗マウス抗マウスCD31（PECAM1）-PECY7、抗マウスCD105-APC（いずれも1μg/ mLの濃度で使用）、抗マウスCD201（Procr） - ビオチン（濃度2.5 μg/ mL）、およびストレプトアビジン-v450（0.5μg/ mLの濃度で使用）。 <ol><li>抗体染色の後、PBS + 5％FBSで細胞を補充し、次いで200gで5分間遠心分離する。上清を捨て、1mLのPBS + 5％FBSで細胞を再懸濁する。 40μmセルストレーナで濾過します。 FACSソーティングまで氷上に置く。 </li></ol></li><li> Procr + VESCを分離するためにFACSベースのソーティングを実行します。 <ol><li>染色されていないサンプルと各単色コントロールを分析して、各色の電圧を決定します。自己蛍光やバックグラウンド染色を避けるために、補正パラメータを計算します。目的の細胞集団の適切なゲーティングおよびソーティングのためのテンプレートを設定する。 </li><li> FACSソーティングの階層を確立するには、まず、全ての事象を検出し、次いで、幅を用いてトリガーすることにより、ダブレットまたは接着性細胞クラスターを廃棄する。細胞をゲートアウトし、CD31 +およびCD105 +を使用して内皮集団を定義する。 注：Procr +細胞は、FMO対照と比較してCD31 + CD105 + ECから単離された。代表的なFACS解析プロットを図1に示します 。 FACSで単離したVESC集団は、IMDM + 50％FBS中に懸濁させ、その後の処理まで氷上に保存しなければならない。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.乳房脂肪パッドを用いたインビボ VESC血管形成アッセイ<ol><li> 一次ECを移植用に準備する。 <ol><li> 10mLのPBS + 5％FBSを含むFACSソート細胞を補充し、200xgで5分間遠心分離して、細胞を底に沈降させる。 </li><li>液体を慎重に吸引し、血球計数器を用いて細胞数を数え、細胞ペレットを基底膜マトリックス混合物で再懸濁する（consi100ng / mL rmVEGFおよび60U / mLヘパリンを補充した50％基底膜マトリックスおよび20％FBSを含むPBSのスティング）を用いて15,000細胞/15μLの作業濃度に到達させた。 注：基底膜マトリックスの混合物は、常に氷上に保存する必要があります。 </li><li>最終的な注入量が合計15μLを超えないように、1.5mLのマイクロチューブで必要な入力濃度に達するように、選別および計数した細胞を連続希釈する。移植中のより良い内容の視覚化のために、各チューブに0.1％トリパンブルーを加える。ピペットで徹底的に混合する。使用するまでチューブを氷上に保管します。 注：船舶の建設が成功するには、最低100 VESCを達成する必要があります。 </li></ol></li><li> 一次ECを乳房脂肪パッドに移植する。 <ol><li>手術器具とベンチトップを消毒する。複数の動物で同じ器具を使用する場合は、ビーズ滅菌器を使用して消毒することができます。 </li><li> 3週齢のBALB / cヌードマイスを麻酔するあなたの施設の獣医師とIACUCによって推奨される麻酔プロトコルを使用してください。各マウスを仰臥位に置き、手術台に背中を置きます。粘着テープを使用して四肢を固定する。 </li><li>綿棒をヨウ素ベースの消毒液に浸す。手術前に皮膚表面を滅菌するために、マウスの腹部全体を完全に拭きます。 </li><li>鉗子でマウスの腹部の皮膚を持ち上げ、持ち上げます。外科用メスを使用して、1cmの垂直切開部を小さくします。後ろ向きにそれぞれ約0.5〜1cmの2つの切れ目を入れて、逆さまのY字型切開を達成します。 <ol><li>鉗子と綿棒を使用して、皮膚を腹部から静かに引き離し、鼠径乳腺を露出させるために皮膚を横にピン止めします。ステレオスコープの下にマウスを置き、倍率を2.0Xに設定します。乳房の脂肪パッドがはっきりと見えるように、フォーカスを調整してください。 </li></ol></li><li> 27G 1/2 &quot;ニードルを置く凍ってから冷やす。前もって基底膜マトリックス混合物を含む1mLシリンジを準備して、針取り付け領域内に捕捉された可能性のある気泡を除去する。 15μLの混合溶液をマイクロ遠心チューブのキャップにピペットで注入し、次に全量をプライミングしたシリンジに吸引します。 </li><li>鼠径リンパ節の前に乳房脂肪パッドを細かいピンセットを用いて持ち、容易に注射できるようにわずかに持ち上げます。脂肪パッドに注射針の約1/4を静かに挿入します。 <ol><li>流しパッドからピンセットを離して、注射針を握って安定させます。液体が漏れないようにゆっくりと溶液を注入してください。針を引き抜くときに漏れを最小限に抑えるために、細胞混合物が凝固していることを確認するために数秒間保持する。 </li></ol></li><li>吸収可能な縫合糸で皮膚フラップを閉じる。サイズ5-0の非反応性モノフィラメント縫合糸を使用して皮膚フラップを縫合し、外科医のスタイルの結び目で創傷を閉じ、各結び目の近似ately 0.3 cm離れている。あるいは、創傷ステープルを用いて皮膚を閉じる。 </li><li>回復のために操作したマウスを別のケージに入れる。麻酔したマウスが低体温に陥るのを防ぐために、ケージの上に加熱ランプを置きます。ケージの底に柔らかい紙と綿を置き、マウスを手術後に暖かく保ちます。 <ol><li>すべての受診者が完全に目を覚ますまで注意深くマウスを観察する。次の数日間は、すべての動物に、または施設の獣医師の指示に従って、術後鎮痛剤を先制的に適用する。創傷感染が起こる場合、承認された動物プロトコールに従って抗生物質を適用する。外科用創傷が創傷ステープルで閉鎖されている場合、創傷が完全に閉鎖した手術の10日後に創傷クリップを除去する。 </li></ol></li></ol></li></ol> 3.顕微鏡観察のための全身組織調製<ol><li> 組織収穫 <ol><li>移植後2〜4週間で、レシピエントBALB / cを麻酔するステップ2.2.2のように、体重20g当たり0.12mLの投与量で2.5％麻酔剤の腹腔内注射を用いて、ヌードマウスに投与した。 注：陽性の血管成長は、細胞移植の2〜4週間後に検出することができます。 </li><li> 50μg/ 25gの体重の用量でisolectin-647色素の尾静脈注射でレシピエント全身循環を標識し、50μLの滅菌PBSに再懸濁する。 5〜10分の休憩を取る。 CO 2を用いてマウスを犠牲にする。 </li><li>ステップ2.2.4の後に細胞が最初に注入された乳房組織の領域を解剖する。外科用ハサミを使用する。手術用ブレードを使用して、組織を6cmのペトリ皿で約3〜4mm 3立方体にチョップします。 </li></ol></li><li> 組織消化および抗体染色のための調製。 <ol><li>コラゲナーゼIIIを補充した予め加温した消化基礎培地（ステップ1.1.2）10mLを満たした15mLの遠心チューブに組織片を消化する（10mLあたり300U）。 </li><li>速度を100rpmに設定し、温度を37℃に約1時間設定したロッキングプラットフォーム上に15mL遠心チューブを水平に置き、組織構造を緩め、過剰な脂肪細胞組織を除去する。 注：脂肪細胞は自己蛍光を生成する傾向があり、その結果、ノイズの多い蛍光バックグラウンドが生じる可能性があります。消化の終わりまでに、組織片は柔らかく曇った外観を有するべきである。最適な消化期間は、切断された組織片のサイズに依存し、従って、最良の結果を得るために調整されるべきである。組織の脈管構造はすでに蛍光標識Isolectinで標識されているため、以下の手順はすべて光から保護する必要があります。 </li><li> RTで10分間PBSで組織片を洗浄する。蛍光を保存するために、4cmのPFA（pH 7.2-7.4）を半分にした6cmのペトリ皿に慎重にピースを置くことによって、全マウント組織を固定する。ペトリ皿を置くロッキングプラットフォーム上に置き、RTで30分間組織を静かに攪拌する。 注：PFAは発癌性物質であり、注意して取り扱う必要があります。 </li><li>残りのPFAを除去し、全洗浄緩衝液（PBS中0.1％トゥイーン）で3回、各洗浄の間に10分間の間隔を置いて固定組織を3回洗浄する。 </li></ol></li><li> 全マウント組織抗体染色。 <ol><li>抗体染色バッファー中の一次抗体を2 mL遠心チューブで希釈する。一次抗体と組織を4℃で一晩インキュベートする。 注：一次抗体としてラット抗CD31（濃度10μg/ mL）またはラット抗VE-カドヘリン（CD144 / Cdh5;濃度2.5μg/ mL）を用いた。 CD31およびVE-カドヘリンの両方は、内皮細胞を認識するために使用される細胞表面マーカーである。 5x抗体染色緩衝液を500mMマレイン酸（pH7.5）で調製する。 750mM NaCl;および0.5％（v / v）トゥイーンをPBSに溶解する。新鮮な1x作業溶液を調製する場合にのみ、適切な血清容量（5％）を加える9 。 </li><li>抗体染色バッファーを取り除き、10分間隔で洗浄バッファーで全マウント組織を3回洗浄する。組織を二次抗体（ 材料表を参照）に加えて、DAPIと室温で4時間、4℃で振とうするか、または4℃で一晩インキュベートする。 注：5μg/ mLの最終濃度でDAPI（4 &#39;、6-diamidino-2-phenylindole）を使用して核を可視化します。 </li><li>洗浄緩衝液で全マウント組織を3回、それぞれ10分間洗浄する。より良い保存のために組織を脱水するために、80％グリセロールまたは80％スクロース中の組織片を一晩インキュベートする。 </li><li>個々の組織片をガラススライド上に置き、過剰な脱水緩衝液を除去する。組織をマウント媒体で覆い、カバースリップを置き、穏やかに組織を絞ってセットします。 </li><li>共焦点顕微鏡画像取得を行う。全身乳腺の場合、NA = 1.3の油性対象物で40倍の画像を取得するve。 1,024×1,024の光学セクション解像度と1.0〜1.2μmのレイヤー分離で、Zスタックのタイルスキャンを取得します。 注：正しい蛍光信号を捕捉するには、フィルタービームスプリッターを3倍ダイクロイック（TD）488/553/638に設定し、ゲイン設定をPMTゲイン600-800に設定する必要があります。以下の励起/放射源を使用すべきである：mGFP、488 / 509nmの励起/発光最大値;励起/発光極大が532 / 588nmのmTomato; Alexa-647、励起/放出極大は594/665; DAPI、励起/発光極大は350/470である。 </li></ol></li></ol>遺伝的に改変されたマウスモデルを用いた系譜の追跡<ol><li> マウスモデルを使用してProcr + VESCを検出します。 <ol><li> Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + （ Procr CreERT2と呼ばれる）ノックインマウス系統を使用する。 注：このマウスモデルでは、 CreERT2-IRES-tdTomatoカセット<sprocr 11の最初のATGコドンの後に挿入される。 <ol><li> Rosa26 mTtomatomGFP （ R26 mTmGと呼ばれる）レポーター株を用いて、内因性Procr + ECのin vivoでの運命を追跡するためのProERT CreERT2マウス11 。 GFP発現を用いて、全ての標識された内因性Procr + ECおよびそれらの子孫を同定する。 </li></ol></li><li>糖尿病の段階（5週間）中に体重25mgの体重で腹腔内に腹腔内にタモキシフェン溶液11 （10mg / mLのピーナッツ油+ 10％エタノールに溶解したタモキシフェン10mgを腹腔内に貯蔵） Procr + ECの発達的な運命を追跡するためのものです。 </li><li>ステップ3で概説した調製ステップに従って、全マウント免疫染色により標識細胞のクローン形成効率を分析する。短期（2日）および延長された期間（10ヶ月まで）。 図3を参照してください。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

血管新生アッセイは、血管動態を研究するための良好な実験的アプローチである。出生後に発症するマウス網膜血管系は、血管新生を研究する魅力的なモデルであることが証明されている12 。それが比較的接近可能であるにもかかわらず、網膜血管床内の実際の操作はむしろ困難である。これまでのところ、最もよく記述されているインビボ移植は、基底膜マ?...

発生およびホメオスタシスの間、血管の成長およびリモデリングは、臓器の成長および修復に従って忠実に起こる。血管新生は、既存の血管か​​らの新しい血管の発生を説明し、これらの動的な血管変化を媒介する主要な力とみなされる。各血管は内皮細胞（EC）の層で内張りされており、血管構造の基礎と思われる。長い間、恒常性の間にECプールが補充されるメカニズムは依然として不明であり、血管代謝回転が成熟EC増殖の結果であるか、または血管幹/前駆細胞活性の寄与であるかについて議論がなされた。直接の生理学的証拠の欠如のために、血管内皮幹細胞（VESC）の存在および細胞の同一性もまた議論の余地があった。 幹細胞の行動を確認するために使用される最も一般的なアプローチの1つは、移植計画推定上の幹細胞のレシピエントマウスへの導入。この方法は、 インビボで候補幹細胞の幹細胞の可能性を測定する。移植は、骨髄幹細胞1の研究に最初に適用され、これは造血系2の階層的特徴の確立に寄与した。内皮の分野では、側面皮膚の下に皮下に挿入された基底膜マトリックス（ 例えば、マトリゲル）プラグは、移植されたECの血管形成能力に対処するために使用される標準的なin vivo血管形成アッセイであった。 3D培養系及び移植におけるコロニー形成を含む、複数の実験方法は、潜在的なEC前駆/ VESC集団3、4、5、6を示唆しています。しかし、基底膜マトリックスに埋め込まれたECは、これは、移植された細胞の血管形成能を完全に探索するのに必要な最適なニッチ環境を提供しない。その結果、マトリックスプラグ内に形成された血管は、主に毛細管様であり、機能的に測定不可能である。 乳腺は出生後に発達し、最も堅牢な成長が思春期および妊娠中に起こる。思春期段階では、乳房上皮は急速に拡大し、周囲の血管構造の効率的なリモデリングを伴う乳房脂肪パッド全体を占有する。したがって、乳腺は、血管新生の研究のための優れたモデルを提供する。これは、成長する乳房上皮からの空間、マトリックス、および豊富な血管新生刺激を提供し、したがって、外因性細胞の血管新生能力を評価するための理想的な移植部位である。さらに、乳房脂肪パッドは、形成された外因性血管を宿主循環系と統合することを可能にし、さらなるf皮下移植に対する優位性を表す。 インビトロ培養および移植アッセイは、細胞集団の再生特性を調べるのに有効な方法であるが、そのようなアッセイは、細胞がそれらの天然生息地から取り除かれるにつれて可塑性を刺激することがあり、細胞が切断されると彼らの生理的環境7 。したがって、細胞運命の直接インビボ証拠を得ることは、内皮集団の行動の現在の理解を進めるための重要なアプローチである。 VESCの同定および身体系におけるそれらの特性の調査のためには、生理学的状況におけるインビボでの幹細胞の挙動を明らかにすることができるため、遺伝的運命マッピング（ すなわち、インビボ系譜の追跡）が不可欠であり、実際の幹細胞は、評価される。リネージュtraci候補VESCの長期持続（ すなわち、自己再生）および起源組織（ すなわち、分化能力）のための細胞型を産生するそれらの能力の直接的な証拠を提供する。 このプロトコルは、VESCの血管発生能力を観察するための新規の乳房脂肪パッド移植技術および系譜追跡方法を記載する。これらの技術は、現在利用可能なアッセイの欠点を克服し、VESCの幹細胞特性を最適に評価する新しい方法を提供する。これらのアプローチは、内皮集団の挙動および血管形成特性を評価し、病理学的環境内の血管細胞効力変化を決定するために使用できる効率的なツールである。

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1x)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25300-062</td><td>0.05% Trypsin</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m Filter Unit</td><td>Merck Millipore Ltd.</td><td>SLGP033RB</td><td>0.22 &amp;micro;m Filter</td></tr><tr><td>2-Methylbutanol-2, ReagentPlus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24, 048-6</td><td>Tert Amyl Alcohol</td></tr><tr><td>222, Tribromethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25g</td><td>222, Tribromethanol</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>BD FAL</td><td>352350</td><td>70 &amp;micro;m Cell Strainer</td></tr><tr><td>Adhesion Microscope Slides</td><td>CITOGLAS</td><td>188105</td><td>Glass slides</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD105 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1051-82, clone MJ7/18</td><td>for FACS analusis use at 1 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD201 Biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-2012-82</td><td>for FACS analusis use at 2.5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7</td><td>eBioscience</td><td>25-0311-82, clone 390</td><td>for FACS analusis use at 1 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>BD FACSJazz Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>655489</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>100190332</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>Collagenase type 3</td><td>Worthington-Biochem</td><td>#LS004183</td><td>Collagenase III</td></tr><tr><td>Confocal microscopy</td><td>Leica</td><td>sp8</td><td>Confocal</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td><td>Sigma</td><td>D2463-5VL</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rat Cy3</td><td>Jackson ImmunResearch</td><td>712-165-150</td><td>Secondary antibody, use at 0.5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Dumont Forceps</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>Froceps</td></tr><tr><td>Dumont Forceps - Micro-Blunted Tips</td><td>FST</td><td>11253-20</td><td>Forceps</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119</td><td>BioLegend</td><td>78022</td><td>Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 &amp;micro;L per test</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>Glycerol</td></tr><tr><td>Iscov&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>12440-053</td><td>IMDM</td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora&amp;nbsp; 647</td><td>Invitrogen</td><td>Z32450</td><td>Isolectin-647</td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp; Matrix (growth factor reduced)</td><td>BD</td><td>356231</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>Mouse strain (Actin-GFP)</td><td>Jax Laboratories</td><td>3773</td><td>Actin-GFP</td></tr><tr><td>Mouse strain (C57BL/6)</td><td>SLAC</td><td>C57BL/6</td><td>C57BL/6</td></tr><tr><td>Mouse strain&amp;nbsp; (BALB/c nude)</td><td>SLAC</td><td>BALB/c nude</td><td>Nude mice</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycin</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>5140-122</td><td>Pen/Strep</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>c20012500BT</td><td>PBS</td></tr><tr><td>PRIM1640</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>c11875500CP</td><td>PRIM1640</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>Mounting Medium</td></tr><tr><td>Rat anti CD144</td><td>BD Biosciences</td><td>550548</td><td>for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Rat anti CD31-biotin</td><td>BD Biosciences</td><td>553371</td><td>for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Red Cell Lysis Buffer</td><td>Sigma</td><td>R7767-100ML</td><td>Red blood cell lysing buffer</td></tr><tr><td>Straight/Sharp-Blunt/10cm</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td>Fine Scissors</td></tr><tr><td>Streptavidin eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>for FACS analysis use at 0.5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>101551374</td><td>TAM</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-250ML</td><td>TritonX</td></tr><tr><td>Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle)</td><td>COVIDIEN</td><td>S1173</td><td>Suture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sterile Disposable Scaplels</td><td>Swann Morton</td><td>#10</td><td>Scalpel</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Yifeng Medical</td><td>20160101</td><td>Antiseptic solution</td></tr></tbody></table>

a novel mammary fat pad transplantation technique to visualize the vessel generation of vascular endothelial stem cells

内皮細胞（EC）は、血管構造の基本的な構築ブロックであり、適切な血管発達およびホメオスタシスを確実にするための血管成長およびリモデリングを媒介する。しかしながら、内皮系統の階層に関する研究は、アクセスを獲得し、インビボでのその行動を直接評価するためのツールがないため、依然として分かり難い。この欠点に対処するために、乳房脂肪パッドを用いて血管新生を研究するための新しい組織モデルが開発されている。乳腺は主に、思春期および妊娠を含む出生後の段階で発症し、その間に堅牢な上皮増殖が広範囲の血管リモデリングを伴う。乳房脂肪パッドは、成長する乳房上皮からの空間、マトリックス、および豊富な血管形成刺激を提供する。さらに、乳房脂肪パッドは、腹膜腔の外側に位置し、外因性細胞の血管新生能を評価するための容易に接近可能な移植部位となる。この作品はまた、効率インビボで血管内皮幹細胞（VESC）の標的とされた集団を特異的に標識するために蛍光レポーターマウスを用いるntトレースアプローチ。この系譜追跡法は、その後の組織全面顕微鏡法と組み合わせて、標的細胞およびその子孫の直接的な可視化を可能にし、増殖能力を定量化し、分化のコミットメントを運命マッピングすることができる。これらの方法を用いて、VESCを発現する二重性プロテインCレセプター（Procr）の集団が最近、複数の血管系において同定されている。新たなECおよび周皮細胞の両方を生じるProcr + VESCは、発生、ホメオスタシス、および傷害修復の間に血管新生に積極的に寄与する。全体として、この原稿は、VESCsの幹細胞特性を評価するために使用することができる新しい乳房脂肪パッド移植およびインビボ系譜追跡技術を記載している。

乳腺VESC単離： その結果の移植アッセイのための内皮集団を単離するために、成熟（8週齢）の未処理マウス乳腺をドナー材料として採取した。内皮細胞は、抗体に基づく細胞選別技術を用いて単離された。 8週齢のC57BL / 6乳腺ECにおけるVESC集団のFACS分析の代表的プロットを図1に示す（図8?...

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A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

この研究は、顕微鏡観察のための全マウント組織調製に続く、乳房脂肪パッド移植による血管内皮幹細胞（VESC）の増殖、分化および血管形成能を評価するための新規アプローチを実証する。 インビボでのVESCの挙動を調べる系統的な追跡戦略も提示される。

血管内皮幹細胞の血管形成を視覚化するための新規乳腺脂肪移植技術

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.2K ビュー.  Chinese Academy of Sciences. この研究は、顕微鏡観察のための全マウント組織調製に続く、乳房脂肪パッド移植による血管内皮幹細胞（VESC）の増殖、分化および血管形成能を評価するための新規アプローチを実証する。 インビボでのVESCの挙動を調べる系統的な追跡戦略も提示される。 

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Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal mammary epithelial cell (NAMEC)-derived extracellular vesicles can be isolated from NAMEC medium via differential ultracentrifugation. Based on their density, EVs can be purified via ultracentrifugation at 110,000 x g. The EV preparation from ultracentrifugation can be further separated using a continuous density gradient to prevent contamination with soluble proteins. The purified EVs can then be further evaluated using nanoparticle-tracking analysis, which measures the size and number of vesicles in the preparation. The extracellular vesicles with a size ranging from 50 to 150 nm are exosomes. The NAMEC-derived EVs/exosomes can be ingested by mammary epithelial cells, which can be measured by flow cytometry and confocal microscopy. Some mammary stem cell properties (e.g., mammary gland-forming ability) can be transferred from the stem-like NAMECs to mammary epithelial cells via the NAMEC-derived EVs/exosomes. Isolated primary EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells cannot form mammary glands after being transplanted into mouse fat pads, while EpCAMlo/CD49fhi basal mammary epithelial cells form mammary glands after transplantation. Uptake of NAMEC-derived EVs/exosomes by EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells allows them to generate mammary glands after being transplanted into fat pads. The EVs/exosomes derived from stem-like mammary epithelial cells transfer mammary gland-forming ability to EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells.

This protocol describes methods for purifying, quantitating, and characterizing extracellular vesicles (EVs)/exosomes from non-adherent/mesenchymal mammary epithelial cells and for using them to transfer mammary gland-forming ability to luminal mammary epithelial cells. EVs/exosomes derived from stem-like mammary epithelial cells can transfer this cell property to cells that ingest the EVs/exosomes.

細胞外小胞/エキソソームを介した乳腺上皮細胞と乳房管腔細胞との間の乳腺形成能の伝達

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

発生生物学

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary epithelium using transplantation techniques takes advantage of the hormonal environment provided by the adolescent rodent host. These studies are ideally suited to explore the impact of various biological manipulations on mammary gland development and dissect many aspects of mammary gland biology. A common, but limiting, feature is that transplanted epithelial cells are strongly influenced by the surrounding stroma and outcompeted by endogenous epithelium; to utilize native mammary tissue, the abdominal-inguinal white fat pad must be cleared to remove host mammary epithelium prior to the transplantation. A major obstacle when using the rat model organism is that clearing the developing mammary tree in post-weaned rats is not efficient. When transplanted into gland-free fat pads, donor epithelial cells can repopulate the cleared host fat pad and form a functional mammary gland. The interscapular fat pad is an alternative location for these grafts. A major advantage is that it lacks ductal structures yet provides the normal stroma that is necessary to promote epithelial outgrowth and is easily accessible in the rat. Another major advantage of this technique is that it is minimally invasive, because it eliminates the need to cauterize and remove the growing endogenous mammary tree. Additionally, the interscapular fat pad contains a medial blood vessel that can be used to separate sites for grafting. Because the endogenous glands remain intact, this technique can also be used for studies comparing the endogenous mammary gland to the transplanted gland. This paper describes the method of mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad of rats.

This article describes a transplantation method to graft donor rat mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of recipient animals. This method can be used to examine host and/or donor effects on mammary epithelium development and eliminates the need for pre-clearing, thereby extending the usefulness of this technique.

間肩甲膜白脂肪パッドへのラット乳腺上皮細胞移植

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

がん研究

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

マウスモデルにおける組織工学血管の生成とグラフト

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

生物工学

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

中に組み込み血管新生による組織工学<em&gt;インビボ</em&gt;ティッシュ・エンジニアリング商工会議所

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

マイクロ流体工学に基づく血管新生ヒト微小腫瘍モデルの準備

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

著者スポットライト:トランスレーショナルがん研究のモデルとしてのヒト血管新生微小腫瘍の作成 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

乳腺上皮移植の手順

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

生物学

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several angiogenic and prevascularization strategies have been established. However, most cell-based approaches include time-consuming in vitro steps for the formation of a microvascular network. Hence, they are not suitable for intraoperative one-step procedures. Adipose tissue-derived microvascular fragments (ad-MVF) represent promising vascularization units. They can be easily isolated from fat tissue and exhibit a functional microvessel morphology. Moreover, they rapidly reassemble into new microvascular networks after in vivo implantation. In addition, ad-MVF have been shown to induce lymphangiogenesis. Finally, they are a rich source of mesenchymal stem cells, which may further contribute to their high vascularization potential. In previous studies we have demonstrated the remarkable vascularization capacity of ad-MVF in engineered bone and skin substitutes. In the present study, we report on a standardized protocol for the enzymatic isolation of ad-MVF from murine fat tissue.

We present a protocol to isolate adipose tissue-derived microvascular fragments that represent promising vascularization units. They can be rapidly isolated, do not require in vitro processing and, thus, may be used for one-step prevascularization in different fields of tissue engineering.

組織工学のための血管新生単位としてマウスの脂肪組織由来の微小血管フラグメントの単離

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

We describe an ovarian fad pad transplantation assay suitable for studies of normal and transformed epithelia of the female reproductive tract. The mouse fat pad allows transplantation of large tissue fragments, is easily accessible for surgery and imaging, and provides the most favorable native environment for tissues of M&#252;llerian origin.

マウスの卵巣脂肪パッドに移植

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

血管内皮幹細胞の血管形成を視覚化するための新規乳腺脂肪移植技術

要約

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細胞外小胞/エキソソームを介した乳腺上皮細胞と乳房管腔細胞との間の乳腺形成能の伝達

間肩甲膜白脂肪パッドへのラット乳腺上皮細胞移植

マウスモデルにおける組織工学血管の生成とグラフト

中に組み込み血管新生による組織工学

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

乳腺上皮移植の手順

組織工学のための血管新生単位としてマウスの脂肪組織由来の微小血管フラグメントの単離

マウスの卵巣脂肪パッドに移植