この研究は、NIH P20 GM109005（ARA）およびTranslational Neuroscience IDeAプログラム賞P30 GM110702のセンターのパイロット助成金によって支えられました。

実験は、UAMSの機関動物管理および使用委員会によって承認された倫理基準に従って行われた。 1.動物および5-Fu注射パラダイム<ol><li> 6ヵ月齢のオスのC57Bl6 / J野生型マウスを購入し、それらが1歳に達するまで一定の12時間の明/暗サイクル下にそれらを収容する。 </li><li> 5％Fuを0.9％滅菌生理食塩水で希釈する。マウス1匹あたり必要な用量として60 mg / kgを使用する。 </li><li> 5-Fuの腹腔内注射を行う（週に3回、3週間）。 <ol><li>毎日同じ時間に腹腔内注射を行う。例えば、0900-1200時間の間。 </li></ol></li><li>動物を安楽死させ、最終注射の30日後に脳を抽出する。 </li></ol> 2.安楽死処置および脳抽出<ol><li>齧歯類を拘束し、尾の基部をつかむ。一方、親指または第1の指をthげっ歯類の首の根元。齧歯類の首にすばやく圧力を加え、尾をつかんでいるもう一方の手が後ろに引っ張っている間、前に押します。 </li><li>一方の手でげっ歯類を、他方の手で大きな手術用はさみを持ちます。齧歯類の首を2枚の刃の間に置き、頭をすばやく断頭します。 </li><li>切断されたマウスの頭部を取って、細かいはさみを使って、目の上まで頭骨の上の毛皮を整える。次に、はさみの先端を各アイソケットに置き、わずかな力でハサミを閉じます。 </li><li>春のはさみを使用して、頭蓋骨を小脳の左右に切断します。 </li><li>小脳の周りの頭蓋骨の部分を直接持ち上げて持ち上げるために鉗子を使用してください。 </li><li>春のハサミを使用して、頭蓋骨の中心窩に沿って切断します。 </li><li>鉗子を使用して頭蓋骨の残りの部分を脳から持ち上げます。 </li><li>スパチュラとプローブを使用して、脳を目的の容器にすくい取ってください。ステンレスを使用してティエルブレードは、各脳を正中面に沿って切断します。右半球について以下のゴルジ - コックス法を実行する。 </li></ol> Golgi染色および組織の調製<ol><li>新しく採取した半分の脳を、10mLコニカルチューブ内の5mLの塩化水銀ベースの溶液（キットの溶液A）に浸します。塩化第二水銀溶液は感光性である。ホイルでチューブを覆う。サンプルを室温で暗所に保管してください。 注：キットには、材料表に記載されているソリューションAが提供されています。あぶない！溶液A（塩化水銀溶液とも呼ばれる）には、重クロム酸カリウム、塩化水銀、クロム酸カリウムなどの有毒な試薬が含まれています。保護手袋を着用し、ヒュームフードで作業してください。 </li><li> 1日後、溶液をゆっくりと一時的な容器（大型の計量ボートなど）に落として、バイオハザードの廃棄容器に処分する。脳（元の10 mLコニカルチューブに依然として）を5 mLの塩化水銀溶液を添加し、サンプルを暗室に室温でさらに13日間戻す。 </li><li> 90gの蒸留水または脱イオン水（dH 2 O）に30gの含浸後緩衝液を加える。 6ウェルプレートの各ウェルに、6.5mLの含浸後緩衝液（1頭あたり1ウェル）を充填する 注記：ポスト含浸緩衝液は、材料表に記載されているキットに含まれています。 <ol><li>塩化水銀溶液中で（合計で）14日後、組織をdH 2 Oですすぎ、その後、含浸緩衝液を入れた6ウェルプレートに移す。箔でプレートを覆い、暗所で室温で保管します。 </li></ol></li><li>浸漬1日後に含浸後緩衝液をピペットで取り出し、新鮮な含浸後含浸緩衝液で更新する;室温で暗所に1日間保存する。必要に応じて、4℃で1ヶ月まで保存してください。22 。 </li></ol> 4.セクショニング<ol><li>蓋の12ウェルプレートに左から右、上から下へ昇順に番号を付けます。 </li><li> 脳全体を切断する場合は、1つの脳につき2つまたは3つの12ウェルプレートを準備する。 <ol><li>各12ウェルプレートの蓋の上部に、切断された脳の識別番号をラベルする。 </li><li>各プレートの各ウェルに1×PBS 2mLをピペットで入れる。 </li></ol></li><li> ステージを設定し、ビブラトームをオンにします。組織を覆う十分な1x PBSが容器に入っていることを確認してください。 <ol><li>プラスチックパラフィンフィルムを2枚切り、2回折り重ねます。 1x PBSがカウンターに漏れるのを防ぐために、検体ホルダーノブの穴の上にそれらを置きます。 </li><li>試験片ホルダーのティッシュブロックにテープを貼り、シアノアクリレート粘着剤（材料表参照）を貼ります。 </li></ol></li><li> 6ウェルプレートから脳を取り出し、それをプラスチックまたはガラス皿に置きます。ステンレスを使用小脳の約半分を切断するためにスチールの両刃ブレード。 <ol><li>小脳を尾を切る。残っている小脳の部分が均一であることを確認してください。 </li></ol></li><li> 直ちに残りの小脳の平らな表面を接着剤の上に置きます。 注：組織の背部（大脳皮質）は、ブレードに対して左右に向いている必要があります。以前に嗅球が付着していた吻側は、上向きになるはずです。 <ol><li>接着剤が完全に乾燥していることを確認するために、少なくとも数分間待ちます。 </li></ol></li><li> 脳を所定の位置に保持している接着剤が乾燥している間に、1×PBSを検体浴に注ぎます。接着剤が乾燥した後、組織が入った標本ホルダーを標本浴に置きます。 <ol><li>組織サンプルが完全に覆われていない場合は、1倍のPBSを検体浴に注ぎます。 </li></ol></li><li>ビブラトームのブレードホルダーにブレードを取り付け、ゆっくりとl1×PBSに完全に浸すまで、ブレードを試料バスに入れます。それが組織の上部のわずかに下になるまでブレードを下げ続けます。 </li><li> ビブラトームの速度を7、振幅を6、切断角度を12°に設定します（ビブラトームモデルの材料表を参照）。振動を開始し、200μmの部分を切断する23 。 <ol><li>大きなペイントブラシを使用して、組織切片を検体浴から12ウェルプレートの指定されたウェルのそれぞれに移動させます。 </li></ol></li><li>所望の数の組織切片に達するまで、組織を切断し続ける。 </li></ol> 5.後染色<ol><li>以下の染色工程およびリンスのそれぞれについて、1ウェルにつき示された溶液2 mLを使用する。溶液をウェルに移すには電動ピペットフィラー（材料表を参照）を使用してください。溶液を適切な廃棄物に移すために移送ピペット（材料表を参照）を使用するコンテナ。 </li><li>切片を0.01M PBS-Tの1回30分洗浄で洗浄する（3.0mLの界面活性剤（材料の表参照）を0.01MのPBS1000mLに加える）。 </li><li> 使用直前にdH 2 Oで3：5の容量の水酸化アンモニウム溶液（注意）を希釈する。希釈した水酸化アンモニウム溶液中の切片を19〜21分間染色する。 <ol><li>光感受性水酸化アンモニウム溶液をホイルで保護する。 注：溶液中の水酸化アンモニウムの濃度は約10％であり、それは「有害」と分類される。水酸化アンモニウム溶液は、皮膚に接触すると火傷を起こすことがあります。吸入すると呼吸器の刺激を引き起こすことがある。保護手袋を着用し、ヒュームフードで作業してください。 </li></ol></li><li>ポスト染色バッファー（500mLのdH 2 O中に90gの試薬Dを加える）中の切片を19〜21分間染色する。ポスト染色バッファーは感光性です。フォイル22で保護してください。 </li><li> 3つのセクションをすすいでください0.01M PBS-Tを5〜10分間洗浄した。 </li></ol> 6.取り付け、クリーニング、およびカバー<ol><li>大きなペイントブラシで1％ゼラチンコートスライドのセクションをマウントします。それらを室温で20〜30分間乾燥させ、その後Coplinジャーに一晩置いてください。 </li><li>コプリンジャーから手袋をしたスライドをスライドから取り出し、プラスチックラックに置きます（材料の表を参照）。 100％エタノールを含有する染色皿（材料表参照）にプラスチックラックを置きます。 5分間3回洗浄して脱水する。 </li><li>スライドを99％キシレンで5分間ずつ2回洗浄する。スライドをガラスラックに置き、金属ハンドル付きのキシレンを含むガラス染色皿にラックを下ろします（材料の表を参照）。 注：キシレンは吸入すると有害であり、皮膚に触れると刺激を引き起こすことがあります。それは液体および蒸気状態で非常に可燃性である。保護手袋を着用し、ヒュームフードで作業してください。 </li><li> キシルからスライドを除去する一度に1つずつ取り出し、組織を約0.25 mLのマウントメディアですばやくカバーします（材料表を参照）。次に、スライドカバーを取り、メディアの上に置きます。 <ol><li>スライドカバーの下に閉じ込められた気泡を、ペイントブラシの端などの鈍いオブジェクトで端まで押します。 </li></ol></li><li>太陽光から離れた場所にスライドを置き、2〜3日間乾燥させる。 </li><li>顕微鏡を使用して画像を取得し、適切なソフトウェアで分析することに進みます。 </li></ol> 7.イメージスタックを取得する<ol><li>イメージングプログラムを開きます（ 材料表を参照）。スライドを顕微鏡のステージに置きます。プログラムの上部にあるメニューで、[取得]をクリックし、[ライブ画像]をクリックします。 </li><li>顕微鏡を10倍に設定します。好みのニューロンを特定してから、赤いXのように見えるカーソルをソーマの中心に持って行きます。左クリックして基準点を設定します。 </li><li>顕微鏡を40倍に設定します。プログラムの上部にあるメニューから「移動」をクリックし、「参照先に」をクリックします。 </li><li> 組織の上の細かい対物レンズを手動でスクロールして、わずかに焦点が外れるまで、画像スタックの作成を開始します。 <ol><li>プログラムの右下にある[画像の取得]という見出しの下にある[Set Top]をクリックします。 </li><li>組織の下をわずかにスクロールして、焦点がわずかに外れるようにしてから、「Image Acquisition」の下の「Set Bottom」をクリックします。次に、「画像スタックの取得」をクリックします。 </li></ol></li><li> イメージスタックを取得した後、表示されるウィンドウにイメージファイルの名前を入力します。 「MBF Asciiファイル」として保存します。 <ol><li>メッセージが表示されたら、ファイル形式を「MBF JPEG2000スタックファイル」として選択し、「保存」をクリックします。 </li></ol></li></ol> 8.ニューロンのトレース<ol><li>ツールバでrメニューの下にある「Contour Name」という名前のボックスをクリックします。ドロップダウンメニューから「Soma」を選択します。 </li><li>手動で体細胞を追跡します。トレースが完了したら、右クリックして[セルボディの終了]を選択します。 </li><li> 「AutoNeuron」を選択すると、「AutoNeuron Workflow」という別のタブが表示されます。 </li><li> [設定タイプ]で[新規]を選択します。パラメータを設定し、 &quot;次のステップ&quot;をクリックして &quot;Soma Detection&quot;小見出しを表示します。 <ol><li>パラメータを設定するには、「Brightfield」を選択します。次に、 &quot;Max Process Diameter&quot;で &quot;Start Measuring&quot;をクリックします。カーソルを使用して、デンドライトの底に移動し、手動で直径を設定します。 </li></ol></li><li>ユーザーに画像全体をトレースするよう要求するウィンドウで[はい]をクリックします。手動で体細胞を追跡します。 「次のステップ」をクリックして、「シードプレースメント」小見出しを表示させます。 </li><li> [Validate Seed]をクリックします。&quot;次のステップ&quot;をクリックして &quot;Neuron Reconstruction&quot;小見出しを表示させます。 </li><li> &quot;Neuron&quot;で、 &quot;Interactive&quot;をクリックします。樹状突起のプログラムからの指示に従い、プログラムでトレースされた強調表示された領域を完成させるために右クリックして、インタラクティブなトレースを実行します。すべての樹状突起をトレースした後、「次のステップ」をクリックします。 </li><li>新しいウィンドウが表示されたら、希望のタイトルで新しい構成を保存します。 [保存]をクリックします。 </li></ol> 9.分析<ol><li>分析プログラムを開きます（材料の表を参照）。 </li><li>トップメニューから「ファイル」をクリックし、「データファイルを開く」をクリックします。対象のファイルを選択します。 </li><li>分析小見出しの下で、「Sholl Analysis」を選択します。 </li><li> 「Sholl Analysis」ウィンドウで、開始半径を10μmに設定します。 [分析]の下にある[Dendrites]と[Branch Orders]のボックスをクリックします。 </li><li>右のcl新しく開いたウィンドウをクリックし、「Excelエクスポート」をクリックします。 [保存]をクリックします。 </li><li>分析の下で、「分枝構造分析」をクリックします。 「すべての可能な分析」を選択します。 </li><li>新しく開いたウィンドウを右クリックし、「Excelエクスポート」をクリックします。 </li></ol>

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著者らは競合する金銭的利益がないと宣言している。

より現代的な技術と比較して、Golgi-Cox法は、スパイン形態を検査するための好ましい方法であるいくつかの利点を有する：1）本質的に任意の組織に染色を用いることができ、2）基本的な光学顕微鏡のセットアップは、 3）Golgi-Coxイメージングは​​、共焦点イメージングよりも速く、4）ゴルジ染色された切片は、蛍光標識されたサンプルより数ヶ月から数年長い間生存可能である。これらの利点があるとしても、Golgi-Cox法には依然として一定の限界がある。第1に、プロセス全体が非常に時間がかかり、数週間の染色が必要であり、続いて画像を分析する必要がある。このプロトコルで見られるように、セクションAが開始される前に、溶液Aでは14日、溶液Bでは1日かかる。さらに、セクショニング、ポスト染色、およびマウントの実行には、1脳あたり2〜3時間かかります。それぞれのスライドは、清掃してカバーする前に1日乾燥させる必要があります。その後、時間の量セクションをイメージし分析するのは個人によって異なります。第2に、背骨の分類の違いによるアナリストのデータ間に一貫性の問題がある可能性があります。このため、各実験の画像解析部分を1人で行うことをお勧めします。これにより、プロジェクト完了までの時間がさらに延長されます。 正確なタイミングと注意を必要とするGolgi-Cox法のいくつかの重要なステップがあります。切片を水酸化アンモニウム溶液で染色する場合、切片が溶液中に少なくとも19分間、ただし21分を超えてはならないことが不可欠である。セクションが十分な時間水酸化アンモニウム溶液に入っていない場合、それらは適切に染色されない。すなわち、画像化の際にニューロンがあまり定義されないように見えるので、分析がより困難になる。切片が水酸化アンモニウム溶液中に21分を超えて存在する場合、これらの切片は、er染色され、個々のニューロンを同定することが困難になる。したがって、ソリューションを切り替えるときは、研究者はすばやく移動する必要があります。もう一つの重要なステップは、セクションをスライドに移すことです。大きなペイントブラシでセクションを移動する前に、最初に少量のPBS-Tをスライドに追加することをお勧めします。これにより、セクションを簡単にスライド上に置くことができ、破壊することなく容易に操作することができます。もう1つの重要なステップは、セクションがスライド上に置かれた後の乾燥ステップである。スライドが室温で少なくとも20分間乾燥しない場合、脱水工程中に特定のセクションが脱落する可能性が最も高い。スライドが30分以上乾燥すると、脱水工程中に脆くなり破損する可能性が高くなります。 この手順を実行する際には、面倒な手順があります。例えば、脳をスペックに置く前に小脳全体が切断されている場合DGが完全に切断される前に脳が裂けて、それ以上の部分を使用できなくなる可能性があります。したがって、小脳の約半分だけを尾状に切ることが重要です。セクションに悪影響を及ぼし得る別のステップは、ビブラトームの速度および振幅である。推奨設定はそれぞれ7と6ですが、切断すると特定のセクションがPBSで崩壊するか不均一に見えることがあります。これを補正するには、ビブラトームのスピードまたは振幅を、セクションがタクトで偶数になるまで1回ずつ、6-8の間で細かく調整します。 ゴルジ染色用の市販キットが入手可能であるにもかかわらず、個々のステップごとに正確な詳細が不足することがよくあります。このプロトコルでは、他のラボが最小限のトラブルシューティングで高品質で組織を確実に染色できるようにするために使用されたすべてのステップを詳細に報告します。使用される材料は、ほとんどの神経科学ラボで利用可能です。樹状突起群の異常樹状突起棘の数の変化と変化は、数多くの神経障害に関連している31 。さらに、樹状突起形成のこれらの摂動は、脳における化学療法誘発損傷の重要な形態学的特徴を表している可能性がある32 。将来、我々は、5-Fuによって誘導される構造的変化が、行動、細胞、および分子の変化とどのように関連しているかを調べる。

<html>デンドライトは、シナプス入力1を受け取り、処理するニューロンの中で最大の部分です。それらの樹状突起は複雑な幾何学的形状を有し、近位枝は遠位枝よりも大きな直径を有する。樹状突起が発達すると、それらは樹状突起形成と呼ばれる過程で他のニューロンといくつかのつながりを形成する。この分枝の程度とパターンは、樹状突起が適切に処理できるシナプス入力の量を決定する2 。 樹状突起形成は、活性依存性可塑性およびニューロン回路の適切な発達のために必要なプロセスである。伸長、収縮、分枝およびシナプス形成は、固有の遺伝的プログラムおよび外因性因子からの影響を含む複雑なプロセスである。海馬内のニューロン樹状突起の形態学的および分枝的な変化は、認知および記憶形成に関与している樹状突起の複雑さの変化は、病態生理学的および行動的変化に関連する5.異常は、脆弱X症候群およびダウン症候群6を含むいくつかの疾患状態に関連する。 樹状突起突起は、中枢神経系内に興奮性の入力を受ける樹状突起の特殊な細胞内区画である。樹状突起の3つの形態学的クラスがあり、その大きさと形状に基づいてそれぞれのクラスの名前があります：1）キノコの背骨は複雑なシナプス後の密度を持ち、他の突起よりもグルタミン酸受容体が多い7 。 2）茎が欠けているぼんやりした棘。 3）細長い棘は、伸長した細い幹と球状頭部からなる8 。樹状突起棘の容積は、それらを規定するために部分的に使用され、薄い棘は一般的により小さい（0.01μm3 </sup&gt;）、マッシュルームスパイン（0.8μm3）と比較して9,10 。背骨は成熟とともに安定する。例えば、細い棘は数日後に収縮するか、キノコの棘に成長する。あるいは、マッシュルームの棘は比較的安定であり、長期間生存することができる。ニューロンの結合の強さは、棘の数および/またはその体積に基づいていると考えられる11,12,13 。 古典的なゴルジ染色方法およびそのより現代的なバリエーションはすべて、樹状突起の形態および密度を調べるために有用であった。ゴルジ染色の1つの独特な局面は、全ニューロンの約5％を無作為に染色することであり、個々のニューロンの追跡を可能にする14,15 。ゴルジ体の正確なメカニズム個々のニューロン染色は未知であるが、この方法の原理はクロム酸銀（Ag 2 CrO 4 ） 16,17の結晶化に基づく。ゴルジ法の主な3つのタイプがあります：急速ゴルジ、ゴルジ - コックス、ゴルジ - コプシュ18 。 3つの方法はすべてクロム塩の初期インキュベーション段階から数日から数ヶ月間に始まりますが、それらの間にはいくつかの重要な違いがあります。急速ゴルジ体は第一段階で四酸化オスミウムを使用し、ゴルジ - コプシュはパラホルムアルデヒドを含む。迅速ゴルジおよびゴルジ - コプシュの両方の染色の後に、約7日間、1〜2％硝酸銀溶液中でのインキュベーションを行う。 Golgi-Cox法は、硝酸銀の代わりに塩化第二水銀および重クロム酸カリウムを使用し、2〜4週間の含浸時間を有する。次いで、組織を切片化し、希釈したアンモニアその後、塩を除去するための写真定着液を使用した。 3つのタイプのうち、ゴルジ - コックス（Golgi-Cox）法は、部分的には干渉を伴わずに樹状突起を染色するのに最も良いと考えられているが、その理由は、結晶アーチファクトが組織の表面上に起こらないからである17,20,21 。 本方法は、市販のゴルジ染色キットを備えたプロトコルのわずかな変形であり、5-Fuの比較的低い用量が樹状の形態学的特徴および背骨密度にどのように影響するかを評価するために設計された。取得されたデータは、化学療法による治療がニューロン回路にどのように影響するかについてのさらなる洞察を提供することができる。

<table><tbody><tr><td>superGolgi Kit&amp;nbsp;</td><td>Bioenno Lifesciences</td><td>30100</td><td>&amp;nbsp;Contains hazardous materials.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 10x powder concentrate</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Permount&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>SP 15-100</td><td></td></tr><tr><td>Slide cover&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>12-546-14</td><td></td></tr><tr><td>7 mL Transfer pipette&amp;nbsp;</td><td>Globe Scientific&amp;nbsp;</td><td>135030</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Falcon tubes&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Foil&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>200 proof Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Xylene&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics&amp;nbsp;</td><td>1330-20-7</td><td>Hazardous.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Permabond 200</td><td>Permabond LLC</td><td>GF2492</td><td></td></tr><tr><td>25 mL serological pipette</td><td>Sigma</td><td>SIAL1489</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Midsci</td><td>HS234526C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>NVSLM1</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 Male Mice&amp;nbsp;</td><td>The Jackson Laboratory&amp;nbsp;</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>ZEISS</td><td>Multiple components, see website for details.&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRc Camera</td><td>ZEISS</td><td>426508-9902-000</td><td></td></tr><tr><td>Staining Dish , Green</td><td>Tissue-Tek</td><td>62541-12</td><td></td></tr><tr><td>Staining Dish Set&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences&amp;nbsp;</td><td>70312-20</td><td></td></tr><tr><td>Motorized Pipet Filler&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>03-692-168</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida&amp;nbsp;</td><td>mbf Bioscience&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida Explorer&amp;nbsp;</td><td>mbf Bioscience&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism&amp;nbsp;</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of hippocampal dendritic complexity in aged mice using the golgi-cox method

樹状突起棘は、興奮性シナプスを含むニューロンの樹状突起軸からの隆起である。海馬内のニューロン樹状突起の形態学的および分枝的な変化は、認知および記憶形成に関係している。ゴルジ染色にはいくつかのアプローチがあり、これらのすべてが樹状突起の形態学的特徴を決定し、明確なバックグラウンドを生成するのに有用であった。現在のゴルジ - コックス法（市販のゴルジ染色キットで提供されるプロトコルのわずかな変形）は、化学療法薬5-フルオロウラシル（5-Fu）の比較的低用量が樹状形態にどのように影響するかを評価するために設計された、脊髄の数、および海馬内での血管収縮の複雑さが含まれる。 5-Fuは、樹状突起の複雑さを有意に調節し、領域特異的様式で海馬全体の背骨密度を減少させた。示されたデータは、ゴルジ体染色法ef海馬のCA1、CA3、および歯状回（Dentate gyrus、Dentate gyrus）における成熟ニューロンを強く染色した。このプロトコルは、各ステップの詳細を報告し、他の研究者が高品質の結果と最小のトラブルシューティングで脳全体の組織を確実に染色できるようにします。

市販のイメージングソフトウェアを使用して、ゴルジ染色された脳切片の樹状突起形成および海馬の複雑さに対する5-Fu処置の効果を定量し、追跡した。追跡後、Sholl分析および樹状複雑性指数（DCI）を用いて、樹状突起形成、背骨密度、および脊椎形態を分析した。ショール分析は、樹状突起の形態を決定するために使用できる定量的分析方法である25 。体細胞から出発して、互いに10μm離れた円は、樹状突起の上に重なっている。樹状突起の長さは、樹状突起が交差する円の数によって決定される。樹状突起の複雑さを確認する方法である分岐点解析は、分岐点の総数と順序に基づいています。 分岐点は、ブランチは2つのサブブランチに分割されます。分岐順序は、分岐が分割される回数に基づいて複雑さの尺度です。例えば、1次分岐点は元の樹状突起であり、2次分岐点は2つのサブ分岐に分かれる点である。分岐点と分岐順序の両方を調べることで、樹状突起の複雑さ（分岐点の数に基づいて）と分岐がどの点で起こるか（小規模な分岐順序は細胞に近い。さらに体細胞から）を決定することができる。これらのパラメータはDCIに適用されました。 CA1およびCA3を頂端および基底部分に分割し、独立して分析した（ 26,27 ） 。 DG中のCA1およびCA3ピラミッドニューロンおよび顆粒ニューロンの樹状突起を分析した。すべてのニューロンがfoそれぞれの実験群は以下の基準を満たした：1）樹状突起は、その全長にわたって暗くて一貫したゴルジ染色を有し、2）樹状突起は目に見えて触れており、3）各ニューロンは、 28 。 図1は、上記の基準を満たすニューロンを示す。データは平均±SEMとして表した。偽群と5-Fu群との間の統計的相違を決定するために、対になった両側t検定を用いた。すべての統計的分析は、分析ソフトウェア（材料の表を参照）を用いて実施し、 p &lt;0.5を有意であるとみなした。 5-Fu治療およびショール半径の効果を評価するために、混合因子分析分散（ANOVA）を使用した。フィッシャーLSDポストホック試験は、適切な場合にANOVA 29の後に使用した。 両方のCA<html> 5-Fu処理後の棘の有意な全体的な減少があった（ 図 7A 、 t = 7.68、 p &lt;0.01; 図 2A ）およびCA3（ t = 7.54、 p &lt;0.01; 図3A ）。 5-Fu治療はCA1の基底背骨密度に有意に影響しなかったが（ t = 1.79、 p = 0.15; 図 2B ）、CA3基底錐体突起棘を有意に減少させた（ t = 5.57、 p &lt;0.05; 図3 B ）。さらに、Fisher LSD post-hoc試験は、40-100μm（フィッシャーのLSD、 p &lt;0.001; 図 2C ）および130-160μm（フィッシャーのLSD、 p &lt;0.05）におけるCA1頂端ピラミッド樹状突起の樹状突起樹状化の減少を明らかにした0.05;（フィッシャーのLSD、 p &lt;0.001; 図 2D ）および70-110（図2C ）のCA1基底頂端樹状突起においても同様の現象が見られたμm2（フィッシャーのLSD、 p &lt;0.05; 図 2D ）。 CA3頂端ピラミッド樹状突起に関して、5-Fu処理後のセグメント樹状突起長の有意差は、生理食塩水処置対照（ F （28,87）= 0.91; p = 0.59; 図 3C ）と比較して有意差はなかった。しかし、CA3基底ピラミッド型樹状突起では、5-Fu処理と食塩水処理対照との間に有意差があった（ F （25,78）=1.85; p &lt;0.05; 図3（ D ））。フィッシャーのLSDは、5-Fu処置が、90-100μm（ p &lt;0.01; 図 3D ）、70-80μmおよび110-120μm（フィッシャーのLSD、 p &lt;0.05; 図 3D ）の樹状突起形成を減少させ、ソーマ29から離れている。 樹状突起の複雑さを決定するために、分枝順序分析を使用して、5-Fu処理対照および生理食塩水処理対照群を比較した。 DG内で、支流順序分析は、各処理と分岐順序の間に有意差を示した（ F （8,36）= 25.61、 p &lt;0.001; 図4 ）。これをフィッシャーのLSDを用いてさらに分析したところ、 第 4および第 6の時点で長さが減少していることが示された5-Fu治療（ p &lt;0.001; 図4 ） 29に続くオーダー。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55696/55696fig1.jpg" /> 図1 ：イメージングとさらなる分析の基準を表すゴルジ染色されたニューロン。ゴルジ染色の後、3つの背骨型はすべて簡単に見ることができます。染色は樹状突起の全長にわたって一貫しており、樹状突起は他のニューロンから隔離されている。スケールバー、5μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55696/55696fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55696/55696fig2.jpg" /> 図2 ：ゴルジ染色したn<html>エウロンは、頂部CA1の5-Fu処置群と生理食塩水処置群との間の背骨密度の有意差を示したが、基礎CA1では有意差を示さなかった。頂端および基底CA1の両方における5-Fu処置群と生理食塩水処置群との間の背骨の長さに有意差があった。 （ a ）CA1頂端ピラミッド型樹状突起において、5-Fuは背骨密度を有意に減少させた。 （ b ）基底樹状突起において、背骨全体の密度に有意な変化はなかった。 （ c ）ショール分析は、5-Fu処置が、CA1頂角錐形樹状突起における体細胞から40-100μmおよび130-160μmの樹状突起樹状化を有意に減少させることを明らかにした。 （ d ）基底樹状突起において、5-Fu処理は、30〜60μmおよび樹状細胞樹状細胞から70〜110μm離れた樹状突起形成を減少させた。平均±SEM（n = 6）。 * p &lt;0.05; ** p &lt;0.01、ANOVA 29 。= &quot;https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55696/55696fig3.jpg" /> 図3 ：ゴルジ染色されたニューロンは、先端CA3および基底CA3の両方における5-Fu処置群と生理食塩水処置群との間の背骨密度の有意差を示した。頂端CA3では5-Fu処置群と生理食塩水処置群との間に背骨長さに有意差があったが、基底CA3では有意差はなかった。 （ a ）CA3頂端ピラミッド樹状突起において、5-Fuは背骨密度を有意に減少させた。 （ b ）基底樹状突起において、5-Fuは棘の全体密度を有意に減少させた。 （ c ）CA3先端領域における5-Fu治療の有意な効果はなかった。 （ d ）基底樹状突起において、5-Fu treaソーマから70-120μm離れた樹状突起形成を減少させた。平均±SEM（n = 6）。 *、 p &lt;0.05; **、 p &lt;0.01、ANOVA 29 。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55696/55696fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55696/55696fig4.jpg" /> 図4 ：DG内のゴルジ染色されたニューロンは、生理食塩水処置群と比較して、5-Fu処置後の4および6 次の長さの減少を示した。 CA1海馬領域のピラミッドニューロンにおける分枝順の長さ。平均±SEM（n = 6）。 * p &lt;0.05; ** p &lt;0.01、ANOVA 29 。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55696/55696fig4large.jpg" target="_blank">歓喜</a>この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。

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Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

ここでは、Golgi-Coxプロトコルを詳細に紹介します。この信頼性の高い組織染色法は、最小のトラブルシューティングで、海馬の脳構造の全面的な評価を可能にします。

Golgi-Cox法を用いた老齢マウスにおける海馬の樹状突起の複雑さの評価

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

assessment-hippocampal-dendritic-complexity-aged-mice-using-golgi-cox

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.0K ビュー.  University of Arkansas for Medical Sciences. ここでは、Golgi-Coxプロトコルを詳細に紹介します。この信頼性の高い組織染色法は、最小のトラブルシューティングで、海馬の脳構造の全面的な評価を可能にします。 

ビデオ: Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

老化とアミロイド病理の間にシナプス変化の研究のためのラットおよびトランスジェニックマウスからの急性海馬スライスの準備

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

神経科学

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile stimulation is a positive early experience that mimics maternal licking and grooming in the rat. Exposing rat pups to this positive experience can be completed easily and cost-effectively by using highly accessible materials such as a household duster. Using a cross-litter design, pups are either stroked or left undisturbed, for 15 min, three times per day throughout the perinatal period. To measure the neuroplastic changes related to this positive early experience, Golgi-Cox staining of brain tissue is utilized. Owing to the fact that Golgi-Cox impregnation stains a discrete number of neurons rather than all of the cells, staining of the rodent brain with Golgi-Cox solution permits the visualization of entire neuronal elements, including the cell body, dendrites, axons, and dendritic spines. The staining procedure is carried out over several days and requires that the researcher pay close attention to detail. However, once staining is completed, the entire brain has been impregnated and can be preserved indefinitely for ongoing analysis. Therefore, Golgi-Cox staining is a valuable resource for studying experience-dependent plasticity.

This paper describes the procedures for tactile stimulation of rat pups and subsequent Golgi-Cox staining of neuronal morphology. Tactile stimulation is a positive experience that is administered in the perinatal period by stroking pups with a household duster. Golgi-cox staining is a reliable procedure permitting the visualization of entire neurons.

ゴルジコックス染色で樹状形態とシナプス接続に関するポジティブ初期の経験、触覚刺激の効果を可視化する

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

成体マウスから海馬歯状回の解剖

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

生物学

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

マウスの海馬領域の歯状回における樹状樹枝状分岐の評価

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we describe a pERK immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. Specifically, we used pERK immunostaining to study neuronal activation following Morris water maze (MWM, a classical hippocampal-dependent learning task) in Engrailed-2 knockout (En2-/-) mice, a model of autism spectrum disorders (ASD). As compared to wild-type (WT) controls, En2-/- mice showed significant spatial learning deficits in the MWM. After MWM, significant differences in the number of pERK-positive neurons were detected in specific hippocampal subfields of En2-/- mice, as compared to WT animals. Thus, our protocol can robustly detect differences in pERK-positive neurons associated to hippocampal-dependent learning impairment in a mouse model of ASD. More generally, our protocol can be applied to investigate the profile of hippocampal neuron activation in both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

We describe an immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. This protocol can be applied to both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

神経発達障害のマウスモデルにおける空間学習した後、海馬ニューロン活動の免疫組織化学的可視化

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within histological brain samples. While it is preferable from a practical perspective to prepare brain sections at the greatest thickness possible, in order to increase the probability of identifying stained neurons that are fully contained within single sections, this approach is limited from a technical perspective by the working distance of high-magnification microscope objectives. We report here a protocol to stain neurons using the Golgi-Cox method in mouse brain sections that are cut at 500 &#956;m thickness, and to visualize neurons throughout the depth of these sections using an upright microscope fitted with a high-resolution 30X 1.05 N.A. silicone oil-immersion objective that has an 800 &#956;m working distance. We also report two useful variants of this protocol that may be employed to counterstain the surface of mounted brain sections with the cresyl violet Nissl stain, or to freeze whole brains for long-term storage prior to sectioning and final processing. The main protocol and its two variants produce stained thick brain sections, throughout which full neuron dendritic&#160;trees and dendrite spines may be reliably visualized and quantified.

We present a protocol for using the Golgi-Cox staining method in thick brain sections, in order to visualize neurons with long dendritic&#160;trees contained within single tissue samples. Two variants of this protocol are also presented that involve cresyl violet counterstaining, and the freezing of unprocessed brains for long-term storage.

ゴルジ - コックス法を用いた太い脳切片内のイメージングニューロン

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate new neurons, which integrate into an existing neural circuit and contribute to specific hippocampal functions. Importantly, adult neurogenesis is highly susceptible to environmental stimuli, which allows for activity-dependent regulation of various cognitive functions. A vast range of neural circuits from various brain regions orchestrates these complex cognitive functions. It is therefore important to understand how specific neural circuits regulate adult neurogenesis. Here, we describe a protocol to manipulate neural circuit activity using designer receptor exclusively activated by designer drugs (DREADDs) technology that regulates NSCs and newborn progeny in rodents. This comprehensive protocol includes stereotaxic injection of viral particles, chemogenetic stimulation of specific neural circuits, thymidine analog administration, tissue processing, immunofluorescence labeling, confocal imaging, and imaging analysis of various stages of neural precursor cells. This protocol provides detailed instructions on antigen retrieval techniques used to visualize NSCs and their progeny and describes a simple, yet effective way to modulate brain circuits using clozapine N-oxide (CNO) or CNO-containing drinking water and DREADDs-expressing viruses. The strength of this protocol lies in its adaptability to study a diverse range of neural circuits that influence adult neurogenesis derived from NSCs.

The goal of this protocol is to describe an approach for analyzing behavior of adult neural stem/progenitor cells in response to chemogenetic manipulation of a specific local neural circuit.

成人海馬神経前駆細胞のアッセイ回路特異的調節

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

成虫マウスおよび老化マウスからの海馬スライスにおける低酸素症の最小化

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

成体マウスのデンテート・ジラスにおける全細胞記録と神経再建のための、逆海馬からの急性スライスの作製

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial prefrontal cortex. This technique is a marked improvement over previous methods of Golgi impregnation because the premixed chemicals are safer to use, neurons are consistently well impregnated, there is far less background debris, and for a given region, there are extremely small deviations in spine density between experiments. Moreover, brains can be accumulated after a certain point and kept frozen until further processing. Using this method any brain region of interest can be studied. Once stained and cover slipped, dendritic spine density is determined by counting the number of spines for a length of dendrite and expressed as spine density per 10 &#181;m dendrite.

The protocol describes a modification of the rapid Golgi method, which can be adapted to any part of the nervous system, for staining neurons in the hippocampus and medial prefrontal cortex of the rat.