Name: isolation, characterization, and purification of macrophages from tissues affected by obesity-related inflammation
Uploaded: 2017-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
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ペンシルベニア州立大学ミレニアム科学複雑な流れの Cytometry 中核施設に感謝したいと思います。

<ol>
	<li>Davies, L. C., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages:+Then+and+Now.">Tissue-resident macrophages: Then and Now.</a> Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (12), 840-846 (2006).</li><li>Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. 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W., Heydari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+Flow+Cytometry:+A+Practical+Approach.">Modern Flow Cytometry: A Practical Approach.</a> Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).</li><li>Martinez, F. O., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+and+M2+paradigm+of+macrophage+activation:+time+for+reassessment.">The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment.</a> F1000. 6 (3), 13 (2014).</li><li>Porcheray, F., Viaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+switching:+An+asset+for+the+resolution+of+inflammation.">Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation.</a> Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).</li><li>Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+and+Application+of+Magnetic+Particles+in+Cell+Isolation+and+Enrichment.">Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment.</a> Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).</li></ol>

著者は明らかに利害の衝突があります。

病気の進行の分子メカニズムを理解するアテローム性動脈硬化、単純な脂肪肝、肝炎などの併存を模倣し、タイプ 2 の糖尿病の食事誘発代謝性疾患モデルが採用されます。コラゲナーゼの消化力依存は細胞外マトリックス (ECM)16,27から細胞を解放するために組織を分離するによく使用されます。コラゲナーゼなどの酵素は、隣接する細胞の構造的なサポートを提供するコラーゲンを混乱させます。組織の構造指示組織マトリックス剛性 (変形抵抗)、成功した ECM 混乱28を確保する上で最も効率的な粗コラゲナーゼ製品です。「ソフト ・ マトリックス」で構成されているワットはしばしば同時にセル表面のインスリン受容体29の整合性を維持しながら脂肪細胞と免疫細胞を解放するために II 型コラゲナーゼで消化されます。大動脈の線維成分のマイクロ アーキテクチャは、「硬いマトリックス」、その他酵素との組み合わせで使用する (最も高いコラゲナーゼ活性のある) XI 型コラゲナーゼと効果的な大動脈の消化力に貢献します。大動脈とは異なり、肝臓消化はマトリックスを混乱させると実行可能な実質および非実質細胞30を解放する弱い酵素活性、タイプ IV コラゲナーゼと、コラゲナーゼを使用します。慢性的な炎症を起こした組織は、適切な酵素の消化力を防ぐことができる背景は多くの場合改造を受ける C57BL6 のマウス野生型の食事供給またはアポリポ蛋白 E 欠損 (アポ島) から派生します。このセクションは、最小化および/または不適切な組織解離と低細胞回復の可能性を排除するための戦略について説明します。
肥満、動脈硬化症、および/または非アルコール性脂肪性肝疾患を模倣する食事供給のモデルマウス由来組織の共通の特徴は、異常組織の改造です。白色脂肪組織、大動脈および肝臓、コラーゲンなどの繊維成分の過剰沈着に ECM の構成は変更されます。野生型 C57BL6 マウス 18 週間高脂肪の食事を維持拡張白色脂肪組織などの組織固有の異常が発生して脂肪肝 (単純な脂肪肝) を拡大します。しばしばこれらの代謝機能は組織解離過程中に克服するために厄介な障害物です。その一方より悪化させた表現型をミラー化する他の食事誘発性モデルで組織の大規模な改造問題を提起できる組織消化中。アポ KO マウスを供給 HFHCD が頻繁に使用されるモデル アテローム性動脈硬化、肝炎。高度な肝炎に関連付けられている共通の特徴は、肝臓 (または線維症) の ECM の過度の沈着です。線維肝酵素組織解離中にかなり問題があることが示されているし、しばしば低細胞収量31が生成されます。細胞収率を高めるためには、偏りなく消化力のプロトコルに従う必要です。消化バッファーによる血液灌流が肝臓の細胞外マトリックスとコラゲナーゼ溶液との接触を最大化正常な肝臓をみじん切り、解離を達成するために、消化バッファーに浸漬することができます、・したがってこの方法は、強くお勧めします。さらに、20-30 mL の消化バッファーはしばしば; 正常な肝臓の正常な解離の十分なボリュームただし、肝臓の肥大や線維化を開発マウス モデルに関しては、細胞死を最小限に抑えながら適切な消化力を確保するための消化バッファーの 50 mL による血液灌流を好んだ。1.5 g を大幅に超えることの重みと肝臓、消化バッファーのボリュームを増やすことが正常な消化を保証する推奨されます。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>組織</td>
			<td>問題</td>
			<td>可能な理由</td>
			<td>ソリューション</td>
		</tr>
<tr>
<td>白色脂肪組織 (WAT)</td>
			<td>貧困層の細胞解離</td>
			<td>消化不良</td>
			<td>消化バッファーが 37 で確認° C</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>細胞死</td>
			<td>過度のコラゲナーゼの消化力</td>
			<td>消化の時間を短縮します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>消化バッファーの量を減らす</td>
		</tr>
<tr>
<td>大動脈</td>
			<td>貧困層の細胞解離</td>
			<td>消化不良</td>
			<td>消化バッファーが 37 ° C であることを確認します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>消化バッファーの大動脈部分が大きすぎます。</td>
			<td>大動脈は約 1 mm の部分にカットを確認してください。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>大動脈部分がない潜伏中に解離バッファーで揺れていた</td>
			<td>消化ソリューションで揺れている大動脈部分を必ず</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>細胞死</td>
			<td>過度のコラゲナーゼの消化力</td>
			<td>消化の時間を短縮します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>消化バッファーの量を減らす</td>
		</tr>
<tr>
<td>肝臓</td>
			<td>貧困層の細胞解離</td>
			<td>消化不良</td>
			<td>消化バッファーが 37 ° C であることを確認します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>消化バッファーの増加量</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>IVC (下大静脈周囲に発生します組織の腫れ) の不適切なカニュレーション</td>
			<td>下大静脈に針が正しく挿入されていることを必ず</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>破裂下大静脈</td>
			<td>灌流前に下大静脈に針を適切に保護します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>血流の速度を減らす</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>破裂の組織</td>
			<td>血流の速度を減らす</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>細胞死</td>
			<td>不適切なリリース、グリソン鞘の細胞の</td>
			<td>前述メソッドをなでるカプセルを使用してから細胞を分離することを確認します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>過度のコラゲナーゼの消化力</td>
			<td>消化の時間を短縮します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>消化バッファーの量を減らす</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 3: トラブルシューティング失敗した組織解離します。フローサイトメトリーによる細胞選別フローまたは FACS が細胞集団を隔離するための強力な技術高純度が必要であります。ときにセルを並べ替えることにより細胞を浄化、細胞の高も高純度の並べ替えを実現する適切な並べ替え方法を使用して必要があります。このセクションでマルチ蛍光体を改善する方法は、フローサイトメトリーを用いた細胞組織食飼育マウスから派生した居住者のマクロファージは、説明の並べ替えをフローします。異なる組織常駐マクロファージ分離表面マーカーの選択は重要なステップです。マクロファージに由来するワット、大動脈および肝臓がしばしば区別、CD45 を使用して+、CD11b+、F4/80+戦略をゲートします。追加のフロー フローサイト メーター パネルは、常在型マクロファージ組織を識別するために使用できます。これらのパネルは、マクロファージ特定の糖蛋白質 (CD64、CD68、および CD14)、主要組織適合性複合体 (動的) の発現を検出する抗体とアポトーシス細胞のチロシンのキナーゼ受容体 (MerTK) の32, 33. 特定の大食細胞の表現型は M2 の選択的な発現の調査によって、線引きできます (CD163、CD209、および CD206) または M1 マーカー (CD38、CD40、CD80、CD86)34,35。自動蛍光脂質荷を積んだ大食細胞によって生成されるは、集団をゲーティングといくつかの問題を提示できます。(PE、PE/Cy5 PE/Cy7 など) 黄緑色のレーザーで励起される蛍光色素が付いた抗体を使用してまたは (など APC の, APC Cy7) 赤色レーザー自動蛍光よりも著しく明るいは、放出される蛍光の結果、このように改善することができます。結果36。このような高い染色インデックスと潜在的な発光スペクトルの重複と共役 fluorophore を選択、適切なコントロールを含めることが重要です。単一染色 (SS) コントロールおよびアイソタイプ コントロールを含めることは、正/負の集団の描写とそれぞれ一次抗体によって引き起こされる非固有バック グラウンド信号の測定ゲートの境界を識別するとき37。 セルが不足している状況の SS およびアイソタイプ コントロールの補償粒子を使用してお勧めします。補償粒子は、通常生物学的コントロールよりも明るい信号を発する、また蛍光バック グラウンドで以下の差異があります。さらに、マイナス 1 つ (FMO) コントロールの蛍光は、ゲートの境界の輪郭を描くに最適です。FMO コントロールを含めるには、その特定の蛍光チャネルの螢光色素付き抗体が除外された38最大蛍光染色のサブセットに対する期待はチャンネルにで明らかにしました。単一の染色補正粒子コントロールに加えて、我々 の経験で無染色の生物学的比較制御をより正確な正/負の境界を設定するため記載します。
細胞残渣およびゲートの戦略で細胞凝集塊を除く自己蛍光を最小限に抑えるために使用される追加アプローチしています。実行可能な細胞集団から細胞の残骸を区別するには、前方散乱 (FSC) と側方散乱 (SSC) を使用して、最も一般的なゲート戦略です。記事並べ替え解析に使用する、DNA ・ RNA の抽出の高い生存率を必要とする隔離されたセルの固定および/または透過操作性汚れを使用しないことをお勧めします。ホルムアルデヒド固定細胞の核酸-タンパク質架橋による核酸の整合性を妥協でき、分離効率、検出、および正確な数量が制限されます。細胞凝集塊の前に述べたようにことはできません生成された自動蛍光信号に貢献するだけがまた「偶然を中止」.一種の高純度を維持するためにこのようなアクションが発生しますが、並べ替えられた細胞収量を減らす場合はあまりにも頻繁に。並べ替えバッファー (FACS) 細胞染色中に DNAse と MgCl2を添加した細胞凝集を最小化できます。それは酵素の活性を阻害すると、DNAse との組み合わせで EDTA を使用しないことをお勧めします。並べ替えの前に 70 μ m セル ストレーナーを介して単一細胞懸濁液をフィルタ リングも集計から細胞を解放できます。集計を抑える細胞懸濁液が最小限の量 0.4 mL の mL あたり 500 万セルの濃度にする必要があります注意してくださいすることが不可欠です。脂質荷を積んだ組織から分離した細胞は集計になりやすい傾向があり、この結果は偶然、中止され、低い収量。サンプルをさらに希釈する集計が解決しない場合は、それをお勧めします。並べ替えられた大食細胞は、細胞回復を最大化する胎児の牛の豊富な媒体を含んでいるポリプロピレンの丸底コレクション チューブで収集できます。濃度は、最終的に各ソートされた液滴と希釈になりますので、初期の高 FBS 濃度は細胞回復を保証します。DNA または RNA の解析に使用する細胞を採取、RNAse の混入を防ぐために適切な抽出試薬を (例えばTriZol) に直接セルを並べ替えることができます。高ボリュームをソートするには、セルを並べ替え最初政府短期証券のより低い集中を添加した培地にお勧めします。すぐに次の並べ替え、セル、ペレット、DNA ・ RNA 抽出分離します。遺伝子発現変化の分離の遺伝物質のプロファイルをすることができます。Tnf α など IL1 β、il-6、IL 12, 1 L 23、肝腎、Nos2、MCP1 プロ炎症性遺伝子 (CCL2) 出展古典的活性化 (M1) 表現型39マクロファージで亢進が多い。その一方で、表現型 (M2) または活性化マクロファージは頻繁に Chi3l3 をコードする遺伝子の誘導によりマーク (Ym1)、Fizz1、アルギナーゼ 1、CD206、CD163、CD209 1 L-10、および TGFβ34,40。最近、CD38、Fpr2 と Gpr18 は、M1 固有遺伝子 C-myc と M2 固有遺伝子34として Egr2 として検証されています。
マルチカラー フロー フローサイトメトリーを用いた細胞選別高純度でマクロファージを隔離するための貴重なツールですが、この方法は高価なことができます。FACS による並べ替えの強力な利点に加えて、細胞選別機メンテナンス用試薬の高費用のセルソーターを操縦できる運用担当者に依存しています。代替的なアプローチは、高価な流れフローサイトメトリーによる細胞選別の代わりに使用できます。磁気活性化細胞 (MAC) を並べ替えまたは密度勾配遠心法が含まれます。並べ替え方法を述べた最初の代替セル包含磁気および/または血または固体ティッシュ41から興味のセルを分離するマイクロ ビーズ列分離キット。アプローチを並べ替える 2 番目のセルは、密度と遠心力に基づく異種細胞懸濁液を分離します。残念ながら、密度を介した遠心分離は大動脈またはワットに派生した単一細胞懸濁液からの大食細胞を分離するため実用的ではありません。多くの場合、差動遠心分離から得られる製品が汚染されているし、低収量します。その結果、最初酵素の消化力の後いくつかのセルの結果 (大動脈またはワット) などより小さい組織は差動遠心分離のための理想的な候補者ではありません。一方、解離肝臓由来細胞懸濁液は、記事並べ替え実験と文化の刺激、qPCR、または西部のしみが付く分析などの解析で使用することができます並べ替えられた大食細胞の適切な数を作り出すことができます。これらの代替アプローチは、FACS、クリーナーのソートを可能にする前に人口を豊かにも使用できます。注記のうち、組織マクロファージは、ワット、肝臓、大動脈全体のセル人口の小さい割合を構成します。FACS 並べ替えする前に細胞の濃縮がそれほど頻繁にセルの人口を隔離するときに使用されるアプローチをされています。小集団に分離するが一般的である 1 つの問題は、大規模なセル番号は、その後の分析のための十分なセルを取得する処理が必要です。濃縮または事前の並べ替えは、このような問題を解決する使用できます。このメソッドは、正と負の選択をセルのより簡潔な人口を得ることでエイズが、FACS 並べ替え肝臓などの密なティッシュ ソースに永続的なプロセスをすることができます、それはまた時間の保全をことができます。
炎症の生物学の最近の進歩は、慢性的な炎症を調節するこれらの免疫細胞の複雑な役割の理解を促進するマクロファージの多様性の表現型および機能特性の重要性を強調表示します。簡単に言えば、この包括的なプロトコルは、マクロファージ組織 3 つの特徴から確立された食事誘発性肥満および炎症モデルで検討組織を特徴づけるに多次元的なアプローチを提供します。さらに重要なこの議定書、難易度を考慮ときれいな隔離措置単一細胞懸濁液調節不全からワット、大動脈のプラークや脂肪肝などの組織の炎症します。プロトコルでは、cytometry 流れと組織マクロファージ、肥満の主調整装置を特徴付けるための革新的な次元で FACS 並べ替えツールを適用する研究者をことができます。マクロファージの動態の詳細な特性評価は、単球の炎症を起こした組織に人身売買に洞察力を提供でき、ソートされたマクロファージに対する実験的アプローチの多くを継続的な機械論的評価を可能にします。マクロファージの個体群の更なる特性は、健康と病気におけるマクロファージの不均一性を規制する生物的基盤に重要な洞察力を提供できます。

マウス モデルは、人間の病気の研究に広く使用されています。病気の状態のマウスから常駐細胞の適切な分離は、病1の病態を分子・細胞の貢献を理解するためのプラットフォームを提供できます。重要です 1 つの障害は、肥満です。肥満の発生率は、インスリン抵抗性と並行世界的に上昇、タイプ 2 の糖尿病、心血管疾患、脂肪肝疾患2,3を継続します。過剰栄養摂取はさらに減らされた身体活動4大動脈および肝臓などの末梢組織の細胞環境を変更することができます脂肪組織から発せられる変更された信号をトリガーによって偏っています。代謝恒常性のような混乱は、慢性低学年全身性炎症5の結果します。
古典的活性化マクロファージの白色脂肪組織 (WAT) の募集と同様に大動脈および肝臓に居住者だけでなく代謝シグナルの調節不全を開始、また炎症6,7を維持する示されています。大食細胞の表現型および機能の多様性は肥満の病因に強く関連付けられている関連する併存7。マクロファージ偏波の動的塑性進行を調整するアクティブ化された表現型の範囲と炎症8の解像度を展示するこれらの細胞が可能です。一方、古典的活性化 (M1) マクロファージは炎症の進展に関与している、あるいはマクロファージ (M2) が解像度と組織修復9,10に関連付けられています。
体は代謝ストレスを受けると白色脂肪組織が異常蓄積されます。拡張の脂肪組織を引き付ける、インスリン抵抗性、高血糖、最終的に 2 型糖尿病、インスリン抵抗性や高血糖11を促進するために通常の脂肪細胞機能を深く変更炎症細胞を保持 12。並行して、白色脂肪組織改造によって解放の炎症性反応では古典的活性化 (M1) 脂肪組織マクロファージ (Atm)13,14を浸透させた。この多細胞器官は肝4大動脈などの他の臓器の正常な機能を derails シグナルのカスケードを発揮します。
肝臓は、近くの調節不全ワット15発刺激への応答の適応代謝パワーハウスです。肝マクロファージまたは代謝の変化に対応した、クッパー細胞実質の両方を変換する炎症性サイトカインと非実質細胞表現型を分泌して組織リモデリングを促進します。肝臓への脂肪蓄積、炎症、過剰な細胞外マトリックス預金、壊死、肝臓障害の広い範囲に貢献して炎症性の侮辱は、非アルコール性脂肪性肝疾患に関連付けられている最終的な関数の損失次のよう16,17,18。
並行して侵害されたワットと肝機能、太い動脈累積動脈壁内の脂質、体は慢性的な代謝ストレス19を受けます。動脈の脂質の蓄積は、活性化された血管内皮細胞によるケモカイン分泌および単球20の後の採用をトリガーします。募集、一度単球増殖を区別するため、リポ蛋白を摂取、泡沫細胞になります。粥状動脈硬化を開始され、プロ炎症性活動による持続的な募集と組織マクロファージ脂質荷を積んだ。この動脈硬化の微小環境の中継細胞外と細胞内ストレス信号に屈して、これらマクロファージは、アポトーシスのシグナル伝達カスケードに従事しています。これらの泡の細胞が死ぬと、プラーク破裂、心筋梗塞や脳卒中につながる病巣の壊死性コアに満たされた脂質内容を貢献します。
総称して、マクロファージの表現型の多様性は一部ワット、肝臓、大動脈8,21などの調節不全組織における炎症性変化による肥満を調整します。特性の採用し、組織マクロファージは、大食細胞の表現型の1を操作する分子標的の可能性への洞察を提供すること。効果的に炎症を起こした組織の肥満によるマクロファージを特徴付ける、酵素消化による単一細胞懸濁液が得られます。このような分離のプロトコルは免疫細胞死を最小限に抑えながら、最適な細胞収率を提供する結合組織を十分に分解に効果的である必要があります。酵素の混合、組織とその構造のメイクアップの種類に依存します。大動脈など弾力性のある組織では、肝組織の解離を達成するためにワットと比較してより強力な酵素活性を必要があります。単一細胞懸濁液から組織マクロファージが明確に特徴するまたは、転写プロファイリングなどさらに下流解析の分離します。
ここで組織固有のプロトコルは説明を効果的に分離し、伝統的な食生活による肥満、住民組織マクロファージを特徴付けるコラゲナーゼ依存組織消化と多色フローサイトメトリーを使用します。アテローム性動脈硬化、単純な脂肪肝と肝炎マウス モデル。同時白血球 - (CD45 や CD11b) やマクロファージに対する抗体と細胞表面のマーカーの染色 (F4/80) 特定の抗原は、しばしばマクロファージ人口22を識別するために使用されます。蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えは、高純度でこれらの特定の集団を並べ替えるために使用する強力な戦略です。並べ替えられた人口は、表現型特異的遺伝子プロファイル (量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応) などの下流の分子分析23を使用して評価できます。標準フローサイトメトリー ・ フロー フローサイトメトリーを用いた細胞のソーティングは非常に異種細胞懸濁液内マクロファージを区別する強力なツールであるが、正常な出力を確保するため元のプロトコルを最適化する必要があります。本研究では効果的に分離し、実行可能なティッシュ特定の大食細胞を特徴付けるプロトコルを説明します。もっと重要なは、この研究は、しばしば発生を防ぐおよび/またはそれらを解決するプロアクティブとトラブルシューティング戦略だけでなく、技術的な問題に重要な洞察を提供します。

<table><tbody><tr><td>26 G x 5/8 in Needles</td><td>BD</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set</td><td>BD</td><td>367297</td><td>Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 in. Needles</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe with rubber stops</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Syringes</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 PE</td><td>Biolegend</td><td>123110</td><td></td></tr><tr><td>CD11c PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE/Cy5</td><td>eBioscience</td><td>15-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/32 Fc Block&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Pacific Blue</td><td>Biolegend</td><td>103126</td><td></td></tr><tr><td>PE Rat IgG2a</td><td>Biolegend</td><td>400508</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 Armenian Hamster IgG</td><td>Biolegend</td><td>400922</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 Rat IgG2b</td><td>Biolegend</td><td>400610</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue Rat IgG2c</td><td>Biolegend</td><td>400717</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m cell strainers</td><td>Corning, Inc.</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL microcentrifuge tube&amp;nbsp;</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>CAS #30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp&amp;nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>52132-10P</td><td>Used for general dissecting purposes</td></tr><tr><td>Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm</td><td>Stoelting</td><td>52102-37P&amp;nbsp;</td><td>Used for general dissecting purposes</td></tr><tr><td>Spring dissection scissors &amp;ndash; 3 mm Cutting edge&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tool</td><td>15000-10</td><td>Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Curved 0.07 mm x 0.04&amp;nbsp;mm Tip Forceps</td><td>Fine Science Tool</td><td>11297-10</td><td>Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Hemostatic Forceps (Curved)</td><td>Fine Science Tool</td><td>13021-12</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Salt</td><td>Fischer Scientific</td><td>9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Cell Culture/Petri Dishes</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Centrifuge Tubes&amp;nbsp;(Polypropylene)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes&amp;nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous)</td><td>Millipore</td><td>EX0285-1</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasse Type XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>500 mL beaker&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>02-540M</td><td></td></tr><tr><td>4 cm Hemostatic clamp</td><td>Stoelting</td><td>52120-40</td><td></td></tr><tr><td>Toothed forceps</td><td>Stoelting</td><td>52104-33P</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;m Disposable filters</td><td>Systemex</td><td>04-0042-2317</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Chloride Potassium (ACK)</td><td>ThermoFischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Razors (0.22 mm (0.009&quot;))</td><td>VWR International</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red Live/Dead stain</td><td></td><td></td><td>Red viability stain (in &lt;strong&gt;Figure 1A&lt;/strong&gt;)</td></tr></tbody></table>

isolation, characterization, and purification of macrophages from tissues affected by obesity-related inflammation

肥満は、主として単球由来マクロファージと同様に、住民組織マクロファージによる慢性的な炎症状態を促進します。食餌誘導性肥満 (DIO) はマクロファージの多様性; の役割を勉強の貴重なモデルただし、分離十分なマクロファージは炎症を起こした組織から取得する困難です。このプロトコルでは、私達は分離手順と必要なトラブルシューティングのガイドライン 18 週間の高脂肪 (HFD) または高脂肪高コレステロール (マウスから住民組織マクロファージの適切な人口を得るため私たちの研究から派生した輪郭を描くHFHCD) 食事介入。このプロトコルは、肥満や動脈硬化、肝、白色脂肪組織 (WAT)、大動脈などで学んだ 3 つのホールマーク組織に焦点を当てください。我々 はどのように二元的な使用を強調流れの cytometry 分離の新しいディメンションと住民組織マクロファージの性質を達成できます。このプロトコルの基本的なセクションは、フローサイトメトリーによる解析の染色後の細胞表面抗体とマクロファージの分離、組織固有の酵素の消化力の基になる複雑さを扱います。このプロトコルは、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えの基になる既存の複雑さに対処し、適切に並べ替えられた細胞集団から幅広い評価を得られるようにこれらの複雑さへの明確化を提案します。豊かな代替メソッドは、並べ替え FACS を操作するときの柔軟性と時間の管理を可能にする高密度の肝臓などの細胞に含まれています。簡単に言えば、このプロトコルを特定の研究では炎症を起こした組織の多数のマクロファージの不均一性を評価する研究者を助けるし、良好な細胞の単離と解析の成功している洞察力のトラブルシューティングのヒントを提供しますDIO を介した炎症における免疫細胞。

アポリポ蛋白 E 欠損 (アポ島) C57BL/6 (BL6) マウス 18 週間、1 x 10 の4 - 2 × 104 CD45 (HCHFD または HCD) 高脂肪高コレステロール食で維持を使用する場合+F4/80+ 2 つのサンプルは、大動脈マクロファージが分離することができますプール。HFHCD 給電アポ KO マウスの胃から肝臓生産 (これは、使用可能な並べ替え時間異なります) 5 x 105並べ替えクッパー細胞より大きかった。うんざりした野生型 (WT) c57bl/6 マウスの高脂肪食 (HFD) を使用して、間質血管の分画 (SVF) 5 x 105 1 x 106居住者の脂肪組織マクロファージ (Atm) を並べ替えることができます。指定された組織から並べ替えることができますマクロファージの述べられた合計数は量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) を用いた遺伝子発現解析を実行するため十分なだった、大動脈など、マクロファージの人口のより少ない数字が回復の組織は、これらの解析で必要な RNA を隔離する場合共同沈殿 (たとえばグリコーゲン) と一晩沈殿物を使用することをお勧めします。
ここでは、基本的なを使用してマクロファージの表現型に及ぼす食事誘発代謝異常フロー フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞分別 (FACS) とダウン ストリーム ポスト並べ替え分析が表示されます。これらの調査結果は、マウスでは管内大動脈 (図 1 b) などの影響を受けたティッシュの古典的活性化 (M1) マクロファージの HFD または HFHCD 増加展示浸透以前に発行された観察を裏付けます。フローサイトメトリー、FACS、および遺伝子発現解析の活用 (量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) ロン受容体チロシンのキナーゼ - CD45 を表現するための支配的な表現型を経由+ F4/80+マクロファージに由来します。食事与えられたマウスから分離した組織が観察されました。ロン受容体発現大動脈マクロファージ炎症表現型を示したが (図 1とD) HFHCD 給電マウスで減少した.並べ替えられたロン受容体を発現したマクロファージ由来消化大動脈実証増加アルギナーゼ (図 1E) 確立された M2 マクロファージ マーカー 1 (Arg1) 遺伝子発現しています。CD45 として特徴付けられたプロ炎症性マクロファージ+ F4/80+ CD11c+ HFHCD 給電マウス (図 1 bとD) から分離された大動脈に増加しました。ロン受容体発現集団 (図 2 a) の支配的な表現型を解明さらに肝臓居住者マクロファージを特徴付けます。CD11c + プロ炎症性マクロファージ集団は、Arg1 とロン (図 2 b) などの抗炎症 (M2) 表現型に強く関連付けられている遺伝子発現減少を示した。同様の傾向は、消化の白色脂肪組織 (図 3) から分離されたマクロファージ集団で観察されました。マクロファージ炎症性のシグネチャを持つ人口は、ロンの受容体 (図 3) の表面発現の低下を示した。アプローチ、基本的なフローサイトメトリー、FACS を組み合わせ、さらにロン受容体を活性化マクロファージ32(M2) 代替のレギュレータとして検証する決定的なデータで起因しました。抗炎症 (M2) 表現に向かってこのようなバイアスは、開発と肥満、動脈硬化、肝炎の31の進行で保護の役割を果たすことに示されています。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55445/55445fig1.jpg"> 図 1:解離大動脈由来マクロファージの特性が、HCD の 18 週間維持アポ KO マウスから削除します。(A) セルされた CD45 のゲート最初+白血球、細胞残屑を除きます。(B) CD45 マクロファージと推定される二重肯定的な集団を描くため F4/80 と一緒に染色します。CD11c の割合を示すために使用した追加ゲート+CD45+F4/80+ (M1) と (C) ロン+CD45+F4/80+ (潜在的な m 2) 大動脈由来のマウスにおけるマクロファージがいずれかの供給、通常の食事や、18 週間高コレステロール食。(D) CD11c の割合を増加した+CD45+F4/80+ (M1) ロン+CD45+F4/80+ (潜在的な m 2) の減少割合と同様に大食細胞、マクロファージを認めた大動脈通常食事飼料飼育マウスに比べて HCD を飼育マウスから派生します。(E) の遺伝子発現解析並べ替えられたロン+CD45+F4/80+マクロファージは、アルギナーゼ活性の発現の増加を示した私 (よく知られているマウス M2 マーカー)。< 0.05 を有意と考えられた学生の t テスト分析統計解析ソフトウェアを使用して実行、± SEM. P を意味として表されるを使用して得られた値 (* P < 0.05、* * * P < 0.001)。図は、ゆうらから変更されています。(2016)31.<a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55445/55445fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55445/55445fig2.jpg"> 図 2: 18 週間、HCD の維持アポ KO マウスから解剖消化肝臓からソート クッパー細胞集団の遺伝子転写プロファイリングします。(A) 特性およびクッパー細胞集団をソート用の一般的なゲート方式。(B) の並べ替えられたロン (Ron+) を表現して非発現 (Ron-) CD45 遺伝子発現解析+F4/80+定量的 RT-PCR によるマクロファージ。学生の t テスト分析を行った統計ソフトウェアを使用して、値が ± 0.05 < は、統計的に有意と考えられていた SEM. P を意味として表された (* P < 0.05、* * * P < 0.001)。図は、ゆうらから変更されています。(2016)31.<a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55445/55445fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/55445/55445fig3.jpg"> 図 3:特性の Atm WT BL6 マウスから解剖白色脂肪組織より分離した飼育 18 週間、HFD 。(A) 一般的なゲート方式の特性および脂肪組織をソート用派生マクロファージ集団 (B) 割合のロン + CD45 の細胞+F4/80+CD11c-と CD45+F4/80+CD11c+ワットからソート マクロファージ集団。図は、ゆうらから変更されています。(2016)31.<a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55445/55445fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

このプロトコルにより、研究者を分離し、特徴付ける組織居住者様々 なマクロファージ ホールマーク食事誘発代謝疾患モデルから抽出された組織の炎症。

肥満に関連する炎症によって影響を受ける組織のマクロファージの精製と性質、分離

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

isolation-characterization-purification-macrophages-from-tissues

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

25.1K ビュー.  The Pennsylvania State University. このプロトコルにより、研究者を分離し、特徴付ける組織居住者様々 なマクロファージ ホールマーク食事誘発代謝疾患モデルから抽出された組織の炎症。

ビデオ: Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

成人肝細胞の混合初代培養からマクロファージを分離するためにシンプルかつ効率的な方法

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

免疫・感染学

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

生化学

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

脂肪組織の免疫細胞の単離

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Toll様受容体刺激時の遺伝子発現解析を行うためにマウス腹腔マクロファージの単離

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a variety of particles. Normally, BMDMs are restricted from the central nervous system (CNS), but following an injury, they can readily infiltrate. Once within the injured CNS tissue, BMDMs are the primary cell type responsible for the clearance of injury-derived cellular debris, including large quantities of lipid rich myelin debris. The neuropathological ramifications of BMDM infiltration and myelin debris phagocytosis within the CNS are complex and not well understood. The protocols described here, allow for the direct in vitro study of BMDMs in the context of CNS injury. We cover murine BMDM isolation and culture, myelin debris preparation, and assays to assess BMDM myelin debris phagocytosis. These techniques produce robust quantifiable results without the need for significant specialized equipment or materials, yet can be easily customized to meet the needs of researchers.

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

We present methods to assess the phagocytic capacity of primary murine bone marrow-derived macrophages using fluorescently labeled myelin debris and intracellular lipid droplet staining.

体外骨髄由来マクロファージによって髄鞘の残骸の貪食

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

神経科学

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

フローサイトメトリーを用いたひと脂肪組織での免疫細胞のキャラクタリゼーション

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

医学

A Comprehensive High-Efficiency Protocol for Isolation, Culture, Polarization, and Glycolytic Characterization of Bone Marrow-Derived Macrophages

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. Macrophages are commonly classified as M1-like (inflammatory) and M2-like (anti-inflammatory) subtypes. M1-like macrophages are pro-inflammatory macrophages that get activated by LPS and/or pro-inflammatory cytokines such as INF-&#947;, IL-12 &#38; IL-2. M1-like polarized macrophages are involved in various diseases by mediating the host&#39;s defense to a variety of bacteria and viruses. That is very important to study LPS induced M1-like macrophages and their metabolic states in inflammatory diseases. M2-like macrophages are considered anti-inflammatory macrophages, activated by anti-inflammatory cytokines and stimulators. Under the pro-inflammatory state, macrophages show increased glycolysis in glycolytic function. The glycolytic function has been actively investigated in the context of glycolysis, glycolytic capacity, glycolytic reserve, compensatory glycolysis, or non-glycolytic acidification using extracellular flux (XF) analyzers.
This paper demonstrates how to assess the glycolytic states in real-time with easy-to-follow steps when the bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are respiring, consuming, and producing energy. Using specific inhibitors and activators of glycolysis in this protocol, we show how to obtain a systemic and complete view of glycolytic metabolic processes in the cells and provide more accurate and realistic results. To be able to measure multiple glycolytic phenotypes, we provide an easy, sensitive, DNA-based normalization method for polarization assessment of BMDMs. Culturing, activation/polarization and identification of the phenotype and metabolic state of the BMDMs are crucial techniques that can help to investigate many different types of diseases.
In this paper, we polarized the na&#239;ve M0 macrophages to M1-like and M2-like macrophages with LPS and IL4, respectively, and measured a comprehensive set of glycolytic parameters in BMDMs in real-time and longitudinally over time, using extracellular flux analysis and glycolytic activators and inhibitors.

This protocol provides detailed and comprehensive methods for the isolation, culture, polarization, and measurement of the glycolytic metabolic state of live bone marrow-derived macrophages (BMDMs). This paper provides step-by-step instructions with realistic visual illustrations for workflow and glycolytic assessment of BMDMs in real-time.

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

RNA解析およびマクロファージ表現型解析に適したヒト内臓脂肪組織からの生存脂肪細胞および間質血管画分の単離

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...