This work was supported by the internal fund of the Korea Institute of Science and Technology (2E26180) and by the Next Generation Biomedical Device Platform program, funded by the National Research Foundation of Korea (NRF-2015M3A9E202888).

陽イオン交換膜に統合されたマイクロ流体チップの1製作<ol><li> シリコンマスターの準備 <ol><li>設計シリコンマスターの二種類：陽イオン交換樹脂及びポリジメチルシロキサン（PDMS）を有するマイクロチャネルを構築するための他のパタ​​ーニングのための1つ。 注：詳細ジオメトリは、ステップ1.3.1と1.4.1で説明します。 </li><li>従来のフォトリソグラフィまたはディープ反応性イオンエッチング27のいずれかを用いてシリコンマスターを作ります。 </li><li> 30分間真空瓶にトリクロロシラン（〜30μL）とマイクロパターンシリコンマスターをSilanize。 注意：トリクロロシランは可燃性であり、急性毒性（吸入、経口摂取）を持っている自然発火性液体です。 </li></ol></li><li> PDMS鋳型の調製 <ol><li> 10に硬化剤とシリコーンエラストマーベースを混ぜる：1の比率と、この未硬化のPDMSを有するカップを置きます気泡を除去するために30分間真空瓶中の（4-のシリコンウェハ上に微細構造を複製するための30から40 mL）で。 注：シリコーンベースは、ビニル基と白金系触媒で終わるシロキサンオリゴマーが含まれています。硬化剤は、3個のケイ素-水素結合28を有するオリゴマーを架橋含ま。 </li><li>シリコンマスター上の未硬化PDMSを注ぎ、ブロアーで気泡を除去し、対流式オーブン中で2時間80℃でPDMSを治します。 </li><li>シリコンマスターから硬化PDMSを外し、適切にナイフでPDMSを形作る（ 図2a-Bに示すように、IV、形状を乗）。 </li></ol></li><li> 陽イオン交換膜をパターニング <ol><li>二つの平行なマイクロチャンネルに垂直にPDMSモールドの半分をカットし、2.0 mmの生検パンチとPDMSチャネルの両端に穴をパンチ。 注：カチオン選択性膜をパターニングするためのPDMSモールドは2パーを持っています対立マイクロチャネル（幅：100ミクロン、高さが50μm、チャネル間の距離：100ミクロン; 図1a）。金型の元の形状は、切断線に沿ってスライスした金型をミラーリングすることによって想像することができます。 L字型マイクロチャネルは重複せずに2つの穴を打ち抜くために推奨されています。 </li><li>スライドガラスとPDMSモールドテープで送風機をきれいにし、それらの間の可逆的な添付ファイルを作成するために、スライドガラス上に金型を置きます。 </li><li>マイクロパターニング技術29によれば、ステップにスライスされたチャネルの開放端にカチオン交換樹脂1.3.1のリリース〜10μL（ 図1B）。パンチ穴に注射器ヘッドを置き、プランジャ（ 図1b中の黒矢印）を引き出します。穏やかな負圧は、陽イオン交換樹脂を引っ張るし、樹脂を2つのチャネルを充填します。 注：マイクロチャネルの高さは15以上であることが推奨されます81;メートル、樹脂の高粘度は、チャネルを埋めるために高い圧力を必要とするため。パターン化されたイオン選択性膜が1μmより厚くなりますので、一方、高さが100μmを超えないことが良好です。このような厚い膜は、膜とPDMSチャンネル13との間のギャップを作成することができます。 </li><li>パターン化された樹脂に触れずにPDMSモールドを取り外し、樹脂中の溶媒を蒸発させるために95℃で5分間加熱器のスライドガラスを置きます。 注：パターン化された膜の厚さは、&lt;1ミクロンよりも通常小さいです。金型を静かにオープンエンド側（ 図1bの点線矢印）に金型を蝶番により剥離されます。これは、樹脂を充填した後、金型に1分未満をデタッチするのが最善です。金型は、数分後に取り外された場合には、より厚い膜を得ることができ、それらは毛管作用に凹形状を有するであろう。 </li><li>不要はがしカミソリの刃を持つパターン化膜の一部、分離した2つのラインパターン（ 図1c）を作ります。 注：ここで使用される陽イオン交換材料が強くガラスに接着されていないパターンを意味し、グループをペルフルオロ化しています。したがって、単純なブレーディング法は、簡単に、膜の不要な部分を削除することができます。 </li></ol></li><li> マイクロチャネルの統合と膜パターニング基板 <ol><li>マイクロチャネルの両端にある2つの穴と膜パターンがステップ1.3で作製した膜パターニング基板にPDMSチャネルを接合した後に配置される他の2穴パンチ。 注：PDMSマイクロチャネルは、1チャンネル（：50〜100μmで、高さ、幅10μm）を持っていますが、それは、隣接チャネル（ 図1D）の端部に接合されています。 </li><li> W 100と50ミリトールで40秒間、直ちに酸素プラズマ処理後の膜パターニングされた基板にPDMSマイクロチャネルを結合。 注：マイクロチャネルの中央に垂直にパターン化された膜を配置します。 </li></ol></li></ol> 2. ICP前濃縮<ol><li> 実験の準備 <ol><li> 1-100のKCl、1mMのNaClを含む、種々の試験溶液を調製し（pH約7）、1 mMのNaClおよび0.2mMの塩酸（pH約3.7）、1 mMのNaClおよび0.2mMのNaOHで（pHが混合物の混合物〜 10.3）、および1×リン酸緩衝生理食塩水。 </li><li>試験溶液に負に帯電した蛍光色素（〜1.55μM）を追加します。 注：帯電した染料は、電流30に寄与しないように、追加の色素の濃度は、塩イオン（&lt;10μM）のそれよりもはるかに低くあるべきである、31。 </li><li>チャネルの1リザーバ内の試料溶液をロードし、溶液を用いてチャネルを埋めるために、他の容器に負圧を加えます。 rで流体力学的に2つのリザーバを接続しますチャンネル（ 図2A）に沿った圧力勾配を排除する大きな液滴eleasing。 </li><li>リザーバ内のICP効果を補償するために、シリンジまたはピペットを使用して、緩衝液（1 MのKClまたは1 M​​ NaCl）で、陽イオン交換パターンに接続された2つのリザーバを充填します。 </li><li> 2パターン化膜（右に左リザーバとカソードにアノード）を横切って、貯水池でワイヤを配置し、ソース測定ユニット（ 図2a）とそれらを接続します。 </li></ol></li><li> ICP現象とICPの予備濃縮の可視化 <ol><li>倒立落射蛍光顕微鏡上のICPデバイスをロードします。電圧（0.5100 V）を印加し、ソース測定ユニットと電流応答を測定します。 </li><li>電荷結合素子カメラで蛍光画像をキャプチャし、イメージングソフトウェア32を使用して蛍光強度を解析します。 </li></ol></li></ol>

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S., Kim, B., Lan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+salt+removal+by+unipolar+ion+conduction+in+ion+concentration+polarization+desalination.">Enhanced salt removal by unipolar ion conduction in ion concentration polarization desalination.</a> Sci. Rep. 6, 25349 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

我々は、10,000倍を実現し、製造プロトコルおよび印加電圧（0.5から100 V）、イオン強度（1-100 mM）の、およびpH（3.7から10.3）の範囲内の時空間的に定義されたプレコンセントレータのパフォーマンスを記載しています10分以内に染料やタンパク質の予備濃縮。以前のICPデバイスなど、予備濃縮性能は高い電圧でかつ低いイオン強度で良好となります。ここで検討することができますつの追加のパラメータは、2陽イオン交換膜との間の距離です。我々は、膜間の距離を大きくした場合、電界は、予備濃縮速度26の減少が得られ、同じ印加電圧下で低下します。 この研究で使用されマイクロパターニング技術29は、陽イオン交換樹脂をパターニングするための堅牢な方法であるので、マイクロ流体システムにイオン交換材料を統合するための金の標準的な方法の一つとなっています。 Nevertheless、短い膜間の距離（数百マイクロメートル未満）を有する2つの並置された陽イオン交換膜を製造することが必要です。ステップ1.3.3-1.3.4において、陽イオン交換樹脂は、液相です。したがって、2つのマイクロチャネル中の樹脂が崩壊することができ、チャネルの開放端に残った樹脂ドロップはまた、モールド剥離時にフラッディングすることができる（ステップ1.3.4。）。高いパターン忠実度を持つ2つの陽イオン交換膜を構築するために、我々は比較的高い粘度（溶媒中の陽イオン交換物質の20％）で、樹脂を使用し、慎重に指定された着脱方向に剥離プロセスを設定します。 このプラットフォームの高い動作柔軟性が実証されたとしても、読者は動作ウィンドウ内に広い範囲から最適な条件を決定する心配するかもしれません。一つの代表的なトレードオフは前濃縮速度及びICP効果の安定性との間です。缶として、クァクらの図5に見られます。 26、高印加電圧（&gt; 50 V）がすぐにターゲットを凝縮することができます。しかしながら、これは、サンプルの予備濃縮の安定性を低下させる空乏ゾーン（1ミリモル/ 図7aのpH 7）で強い渦を誘導します。従って、予備濃縮速度が33を予測することが困難となります。現段階では、我々は、安定した予測可能、および時空固定予備濃縮のための比較的低電圧（&lt;30 V）およびイオン強度（&lt;10mMの）との実験条件をお勧めします。このトレードオフの前濃縮速度と予備濃縮プラグの安定性との間には、また、非線形ICP（表面伝導、EOF、及び電気浸透不安定性）のソースに関連しています。比較的小さな電圧（&lt;50 V）での非線形ICPの主な供給源は枯渇領域におけるコヒーレント渦対を作成し、EOFである（ 図3b）、そのル安定した予備濃縮に広告。比較的高い電圧（&gt; 50 V）では、非線形ICPの主な供給源は、予備濃縮の安定性を低下させる混沌複数の渦を生じる、電気浸透不安定に変化します。 近年、紙ベースのICPプラットフォームはファンティエットらによって開発されています。 34、コンら。 19、およびハンら。 21。微孔性構造を有するこれらの紙装置は、電気浸透不安定4、35を抑制し、安定性の問題を緩和することができます。しかし、紙のチャンネルのサイズは、一般的に、従来のマイクロ流体チャネルよりもはるかに大きいです0.5〜5 mmです。ランダムファイバネットワークを持つこの広い紙チャネルは予備濃縮プラグで不規則な動きを引き起こします。これは最低限の機能、紙ベースのICP preconcentratorsに避けられてきましたワックスパターニング紙切断（紙チャネルを構築するため、すなわち、製造方法）の大きさが数百μm程度です。 ICPの予備濃縮は、様々な生体物質をpreconcentratingためbiomicrofluidicプラットフォームの広い範囲で使用されています。種々のアッセイの信号を増幅します。そして、このような治療用タンパク質36、ペプチド37、などの検出ターゲットは、17のアプタマー、および38を酵素。これらの先行研究は、蛍光標識された生体分子を標的に。私たちは、正確な動作条件を指定（ すなわち、電圧および流量）の予備濃縮のサイトを維持するために、私たちは最初の予備濃縮のターゲットのための適切な条件を見つける必要ができないためです。前作から逸脱する、マージされたICP現象は、高い柔軟性を維持しながら、私たちが常に動作条件の広い範囲に予備濃縮プラグを固定することができますICP装置。例えば、我々は、接線方向の流体の流れにマージICPシステムを調節することができる、および連続フローモード39でそれを操作します。これは私たちが今視覚化機器およびトレーサーを使用することなく、ラベルフリー検出技術へのICP preconcentratorsのアプリケーションを拡張することができることを示しています。時空間制御のこのユニークな利点は、そのようなポリメラーゼ連鎖反応機や質量分析計などの一般的なベンチトップ・プラットフォーム、とICPデバイスを統合するための強力な商業機会を提供します。

イオン濃度分極（ICP）は、イオン濃度勾配1、2と追加の電位降下を生じ、選択透過膜にイオン濃縮とイオン減少の間に生じる現象をいいます。この濃度勾配は線形であり、より高い電圧が印加されると、膜上のイオン濃度は、（レジームを限定する）がゼロに近づくまでは（オームレジーム）急になります。この拡散制限条件に、勾配（および対応するイオン流束）を最大化することが知られている/ 1を飽和させました。電圧（または電流）をさらに増加すると、この従来の理解を超えて、overlimiting電流がゾーン境界1,3の平坦空乏領域と非常にシャープな濃度勾配を用いて、観察されます。フラットゾーンは、非常に低いイオン濃度を有するが、表面伝導電気osmoti<html> C流（EOF）、及び/又は電気浸透不安定性は、イオンフラックスを促進しoverlimiting電流3、4、5を誘導します 。 6、7、8、9および/または予備濃縮をフィルタリング静電バリアが、10、11を標的とするように興味深いことに、平坦な空乏ゾーンが働きます。 （電気的中性を満足するための）荷電粒子の表面電荷をスクリーニングするイオンの不十分な量があるので、粒子は、この空乏領域を通過し、従って、その境界で整列することができません。この非線形ICP効果は、膜10、11、12、13の様々なタイプの一般的な現象であります&gt; 14およびジオメトリ6、15、16、17、18、19、20、21。研究者は、濾過6、7、8の種々のタイプを開発することができた理由は、9 非線形ICPを使用して10、11デバイスを予備濃縮。 でも、このような高い柔軟性と堅牢性と、まだ非線形ICPデバイスの動作条件を明確にする実用的な課題です。 ICPの非線形政権はすぐに陽極に向かって移動する陰イオンの変位を引き起こす陽イオン交換膜を介して、陽イオンを除去します。としてその結果は、フラットな空乏ゾーンは、ショックの伝播22を彷彿とさせるその、すぐに伝播します。マニら。このダイナミックな脱イオン（または枯渇）23に衝撃を与えると呼ばれます。指定された検知位置にターゲットを前濃縮するために、イオン欠乏ゾーンの拡大を防止することは、例えば、帯域拡張24に対してEOFまたは圧力駆動流を適用することによって、必要です。 Zangle ら。 図22は、一次元モデルでICP伝播の条件を明確にし、それは非常にように電気泳動移動度17、イオン強度18、pHを25に依存し、。これは、適切な動作条件は、試料条件に応じて変更されることを示しています。 ここでは、spatiotemp内の目標を前濃縮小説ICPプラットフォームのための詳細設計および実験プロトコルを提示します経口位置26を定義しました。イオン欠乏ゾーンの拡大は関係なく、動作時間の、割り当てられた位置に固定予備濃縮プラグを残して、イオン富化ゾーンによって印加される電圧、イオン強度、およびpHが遮断されます。この詳細なビデオプロトコルは、マイクロ流体デバイス内に陽イオン交換膜を統合すると、従来に比べて新しいICPプラットフォームの予備濃縮の性能を実証するために最も簡単な方法を示すことを意図しています。

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichlorosilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175552</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Nafion perfluorinated resin, 20 wt%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>527122</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71394</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60121</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 carboxylic acid, succinimidyl ester</td><td>Invitrogen</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Isothiocyanate-conjugated albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9771</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline, 1x</td><td>Wengene</td><td>LB004-02</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>Charged-coupled device camera</td><td>Hamamtsu Co.</td><td>ImageEM X2</td><td></td></tr><tr><td>Source measurement unit</td><td>Keithley Instruments</td><td>2635A</td><td></td></tr><tr><td>Covance-MP</td><td>Femto Science</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

merging ion concentration polarization between juxtaposed ion exchange membranes to block the propagation of the polarization zone

イオン濃度分極（ICP）現象は、低存在量の生体試料を前濃縮するための最も有力な方法の一つです。 ICPは、荷電した生体分子（ すなわち、イオン欠乏ゾーン）用の非侵襲性の領域を誘導し、ターゲットは、この領域の境界上に予備濃縮することができます。 ICPと高い予備濃縮性能にもかかわらず、非伝播イオン欠乏ゾーンの運転条件を見出すことは困難です。この狭い動作ウィンドウを克服するために、我々は最近、時空間固定予備濃縮のための新しいプラットフォームを開発しました。イオンのみの枯渇を使用する方法を先行するとは異なり、このプラットフォームはまた、イオン欠乏ゾーンの伝播を停止するICP（ すなわち、イオン濃縮）の反対の極性を使用しています。空乏ゾーンで濃縮ゾーンに直面することで、2ゾーンが合流し、停止します。本稿では、この時空定義されたICP platfを構築するための詳細な実験プロトコルを記述しますORMと従来のものとそれらを比較することにより、新しいプラットフォームの前濃縮ダイナミクスを特徴づけます。定性的なイオン濃度プロファイルと、現在の時間応答が正常にマージされたICPおよびスタンドアローンICPとの間の異なるダイナミクスを捕捉します。のみ〜5 Vで予備濃縮の場所を修正することができ、従来とは対照的に、新しいプラットフォームは、運転条件の広い範囲内の特定の場所で目標凝縮プラグを生成することができます：電圧（0.5から100 V）、イオン強度（1-100 mM）の、およびpH（3.7から10.3）。

膜一体型マイクロ流体の予備濃縮の模式的な製造工程は、 図1に示されています。製造の詳細な説明は、プロトコルに記載されています。時空間的に定義プレコンセントレータ26のデザインやデバイスの画像は、従来の予備濃縮11（ 図2）のものと対比されます。時空定義予備濃縮でICP現象は、電流-電圧-時間応答と蛍光強度プロファイル（ 図3-4）の観点から検討しました。単一の膜プレコンセントレータ3、11とICP現象と同様に、三つの異なるレジーム（オーミック、制限、およびoverlimiting）は電流-電圧曲線で観察された：0.5〜1 V（オーミックおよび制限）と5 V（overlimiting） 。しかし、従来にない現在の回復がありました電流 - 時間曲線にイオン濃縮として検知し、イオン欠乏ゾーンがマージ。次に、ICPの予備濃縮は、時空間的に定義予備濃縮（ 図5）と、従来の1膜装置（ 図6）と異なる時間と電圧で試験しました。予備濃縮のダイナミクスは蛍光画像、現在の時間応答、および異なる距離と時間を超える蛍光強度のグラフにより定量しました。 2つのプラットフォームを比較すると、新しいICPプラットフォームは、常に2つの陽イオン選択膜パターン間のターゲット（蛍光色素）を収集することに利点を示しています。加えて、予備濃縮プラグは、動作条件の広い範囲（ 図にマージICPの予備濃縮の高可用性を検証し、異なるイオン強度（1-100 mMの塩化ナトリウム）およびpH値（3.7から10.3）において同じままであることが確認されました7）。 図8では、10,000倍のタンパク質preconcentrエーションも実証されました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55313/55313fig1.jpg" /> 陽イオン交換膜に統合されたマイクロ流体チップの1.製造工程図。 29、膜パターン化ガラス基板を酸素プラズマ処理（D）により、PDMSマイクロチャネルと結合されている- PDMSモールドは、マイクロパターニング技術（C）を用いた陽イオン交換樹脂を充填した後。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55313/55313fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55313/55313fig2.jpg" /> 図時空定義された予備濃縮（a）と、従来の予備濃縮の2回路図（b）に。 （a）は第でE新しいプラットフォームは、二つの膜パターン（I）との間で、イオン欠乏/濃縮ゾーンが開発され、リニアとマージ（オーミックて、限定政権; ii）又は非線形（政権をoverlimiting; iii）の濃度プロファイルを。 3つのすべての現在の体制では、イオン濃縮ゾーンブロック枯渇ゾーンとターゲットの伝播（中空の円は、ⅰ）イオン減少および濃縮ゾーン（;私の湾曲、点線）の界面で予備濃縮されています。 PDMSチャネルの壁は負に帯電し、この電界の下に2つの陽イオン交換膜との間の電気浸透流（EOF）を生成します。 EOFは、継続的に枯渇し、濃縮ゾーンのインターフェースに向けて目標を実現します。 （b）は従来のプラットフォームでのみイオン欠乏ゾーンが線形と膜の近く開発（オーミックと政権を制限すること; ii）されると非線形（政権をoverlimiting; iii）の濃度勾配。 EOFは、目標を実現したように、予備濃縮アルそのように空乏ゾーンの境界で発生しますが、このゾーン（と予備濃縮プラグ）（黒矢印; I）離れた陽イオン交換膜から移動します。イオン富化ゾーン（II-III）なしに、ここでイオン濃度の増加がないことに留意されたいです。 （AB）では、デバイスの画像は（IV）で示されます。 C 0は初期イオン濃度を表します。 V +及びGは、それぞれ、アノードおよびカソードを示します。米国化学会から許可を得て参考26トンから転載。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55313/55313fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55313/55313fig3.jpg" /> 図3. 2陽イオン交換膜との間にICP現象を吸収合併しました。 （a）の電流-電圧曲線は、3つの異なるregimを示しますエス（オーミック、制限、およびoverlimiting）。電流応答は、3回繰り返す0.25 V毎40秒の離散的間隔で電圧をランプアップすることによって測定されます。エラーバーは、現在の応答の標準偏差を示します。 （bはC）を3レジームにおいて、蛍光画像（b）およびチャネル（C）の中央に「AAに沿った強度プロファイルを得ました。イエロー、点線のボックスは、陽イオン選択膜の位置を示します。 1.55μM（を1μg/ mL）で負に帯電した蛍光色素1 mMのKCl溶液を用いました。米国化学会から許可を得て文献26より転載。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55313/55313fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55313/55313fig4.jpg" /> 図4。 <stroNG&gt;イオン欠乏および濃縮ゾーンをマージする過渡ダイナミクス。 （b）は、オーミック制限レジームでは、直線状の濃度勾配は、&lt;陽イオン交換膜の（1S、その後一緒に重なって）成長（&gt; 1秒）。 （c）は overlimiting政権では、2 ICPゾーンが枯渇ショック（0.2 sの黒い矢印）と（&lt;0.6秒）より迅速にマージされます。 （D - f）は電流-時間応答は電流が最初に低い導電率に相当する低濃度の空乏領域の成長に低下していることを示しています。現在のドロップは、2つの膜の間に閉じ込められ渦によって対流輸送による回復です。米国化学会から許可を得て参考にし26から転載。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55313/55313fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> &lt;キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt;：FO Pクラス= &quot;jove_content&quot; <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55313/55313fig5.jpg" /> 図5. 時空5、10で予備濃縮を固定し、20 V.（ - C）合併ICPの蛍光画像と現在の時間応答の（d - f）の時間（0〜100秒）を超えます。黄色、点線は、陽イオン交換膜の位置を示します。 （ グラム ）タイムラプス蛍光強度プロファイルは、マイクロチャネル（AA &#39;）に沿ってプロットされています。ピーク強度は時間が固定された場所で、通過するにつれて増加します。 （h）のピーク強度の倍（ すなわち、初期の蛍光強度よりも何倍も大きいです）。より高い電圧では、より高速なEOFは、イオン減少および濃縮ゾーンのインターフェースに向けて目標を実現するので、予備濃縮速度が速くなります。 20 Vでのスパイクが枯渇ショックによって誘導されます（ <strong&gt;図4c）。それは染料を押すような蛍光色素は衝撃境界上に蓄積します。この初期の蓄積は、次にやや枯渇ショックがピーク強度曲線にスパイクを生成する、イオン富化ゾーンを満たしたときに分散されます。 図4cに見られるように、0.8秒で、ピークは、0.4秒であったよりも広かったです。左ナフィオンパターン（ 図2a）の左側が電気的に浮いた、累積染料が広がる可能性があるためであると考えられます。米国化学会から許可を得て文献26より転載。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55313/55313fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55313/55313fig6.jpg" /> 5、10、および20 Vで、従来のICP予備濃縮で 図6. ICP現象。 （ - c）のイオン枯渇領域の蛍光画像と現在の時間応答の（d - f）は時間をかけて（0〜100秒）。空乏ゾーンと予備濃縮プラグの伝播が明らかに蛍光画像で可視化されます。現在の回復があってもoverlimiting政権では、発生しないのでしたがって、渦は、限定されていません。黄色、点線は、陽イオン交換膜の位置をマークします。 （ グラム ）タイムラプス蛍光強度プロファイルは、マイクロチャネル（AA &#39;）に沿ってプロットされています。時間の経過とともに、ピーク強度が増加するが、位置が膜から離れます。 （h）は 、従来のICPデバイスのピーク強度倍。染料を予備濃縮したような蛍光強度が増加したため、マージされたICP装置（ 図5H）とは対照的に、何の強度スパイクは、ICPゾーンの閉じ込めなしではありません。トンの増加彼は、強度折り畳みは（所与の電圧において）同時にマージICP装置と同様であるピーク。これは、予備濃縮プラグが所定の位置に保持される時間の長さは、前濃縮性能に重要であることを示しています。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55313/55313fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/55313/55313fig7.jpg" /> 図7. 様々なイオン強度（1-100のNaCl）およびpH値における時空定義された予備濃縮（3.7から10.3）。 （A）蛍光画像を見ることができるよう50 Vでの動作100の後に得られた、予備濃縮プラグの位置は、強度が高いイオン下に弱化されていても二つの陽イオン交換膜（イエロー、点線）との間に残っています強さと強い酸性または塩基性で溶液。 （B、C）のピーク強度の位置とその強度の倍（ すなわち 、初期の強度よりも何倍も大きい）、10下にマッピングされた、20、50、及び単一の条件（1、10、100 V.、 100mMのおよび/またはpH 3.7、7、及び10）、4つの電圧条件に対応する4つのデータポイントがあります。より高い電圧では、全ての場合において、倍強化高いピークがあります。 100 Vはピーク強度がすでにピーク強度プロファイルから50 V.で（これはカメラの飽和に）最高値を触れたので、1 mMのNaClを（pHが7）でテストされていなかった、ピーク領域も1で、識別されエラーバー（B、C）で表されるピーク強度、％未満。より高い電圧と強いEOFより高い強度の倍とシャープな前濃縮プラグを、右にピーク位置をずらします。灰色のボックスは、陽イオン交換膜の位置を示します。 0の距離（A）は、x軸（B、C）の原点を表します。左の陽イオン交換膜の右端に。距離の原点は左膜の右端です。米国化学会から許可を得て文献26より転載。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55313/55313fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/55313/55313fig8.jpg" /> 時空固定タンパク質の予備濃縮の8デモンストレーション図。 1×リン酸緩衝生理食塩液中でFITC-アルブミン（1μg/ ml）を用いました。 0.1％ツイーン20は、非特異的結合を防止するために添加しました。予備濃縮はほとんど高いイオン強度（ 図7）で達成されていないので、我々はナフィオンパターン（200ミクロン）の幅を倍増し、より狭いPDMSチャネル（50μm）を使用しました。このようにして、ICPの予備濃縮の性能によって増強されましたイオン経路を拡大し、チャネル中のイオンの絶対量を減少させます。 100 Vの印加電圧、ピーク時には、蛍光強度の平均は2陽イオン交換膜との間の領域である、白、点線のボックスで追跡しました。操作の10分以内に、タンパク質を10mg / mLの（ピーク）まで予備濃縮し、〜0.1 mg / mlで、それぞれ、10,000および100倍preconcentrationsを示す（平均しました）。はめ込み蛍光画像を0、10、および20分で得られました。この作業では、20分間の操作は、標的分子を前濃縮するのに十分だったので、私たちは長い営業時間をカバーしていませんでした。米国化学会から許可を得て文献26より転載。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55313/55313fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

関係なく、動作条件、ICP帯の伝播を停止することができる新規なイオン濃度分極（ICP）プラットフォームのためのプロトコルを説明します。プラットフォームのこのユニークな能力は、ICP現象の2極性があるイオン減少および濃縮を、マージを使用することにあります。

偏光ゾーンの伝播を遮断するように並置されたイオン交換膜との間のイオン濃度分極のマージ

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.4K ビュー.  Korea Institute of Science and Technology. 関係なく、動作条件、ICP帯の伝播を停止することができる新規なイオン濃度分極（ICP）プラットフォームのためのプロトコルを説明します。プラットフォームのこのユニークな能力は、ICP現象の2極性があるイオン減少および濃縮を、マージを使用することにあります。 

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The Preparation of Electrohydrodynamic Bridges from Polar Dielectric Liquids

Horizontal and vertical liquid bridges are simple and powerful tools for exploring the interaction of high intensity electric fields (8-20 kV/cm) and polar dielectric liquids. These bridges are unique from capillary bridges in that they exhibit extensibility beyond a few millimeters, have complex bi-directional mass transfer patterns, and emit non-Planck infrared radiation. A number of common solvents can form such bridges as well as low conductivity solutions and colloidal suspensions. The macroscopic behavior is governed by electrohydrodynamics and provides a means of studying fluid flow phenomena without the presence of rigid walls. Prior to the onset of a liquid bridge several important phenomena can be observed including advancing meniscus height (electrowetting), bulk fluid circulation (the Sumoto effect), and the ejection of charged droplets (electrospray). The interaction between surface, polarization, and displacement forces can be directly examined by varying applied voltage and bridge length. The electric field, assisted by gravity, stabilizes the liquid bridge against Rayleigh-Plateau instabilities. Construction of basic apparatus for both vertical and horizontal orientation along with operational examples, including thermographic images, for three liquids (e.g., water, DMSO, and glycerol) is presented.

Horizontal and vertical electrohydrodynamic liquid bridges are simple and powerful tools for exploring the interaction of high intensity electric fields and polar dielectric liquids. The construction of basic apparatus and operational examples, including thermographic images, for three liquids (e.g., water, DMSO, and glycerol) is presented.

ポーラー液体誘電体から電気流体橋の調製

Horizontal and vertical liquid bridges are simple and powerful tools for exploring the interaction of high intensity electric fields (8-20 kV/cm) and ...

工学

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

イオンの分離及び核酸の精製のためのオンチップ等速電気泳動

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

生物工学

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

電気生理学的実験のための人工二重層の準備

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

生物学

Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to direct the motion of microparticles in a surface marker-independent manner. Traditionally, DEP devices include planar metallic electrodes patterned in the sample channel. This approach can be expensive and requires a specialized cleanroom environment. Recently, a contact-free approach called contactless dielectrophoresis (cDEP) has been developed. This method utilizes the classic principle of DEP while avoiding direct contact between electrodes and sample by patterning fluidic electrodes and a sample channel from a single polydimethylsiloxane (PDMS) substrate, and has application as a rapid microfluidic strategy designed to sort and enrich microparticles. Unique to this method is that the electric field is generated via fluidic electrode channels containing a highly conductive fluid, which are separated from the sample channel by a thin insulating barrier. Because metal electrodes do not directly contact the sample, electrolysis, electrode delamination, and sample contamination are avoided. Additionally, this enables an inexpensive and simple fabrication process.
cDEP is thus well-suited for manipulating sensitive biological particles. The dielectrophoretic force acting upon the particles depends not only upon spatial gradients of the electric field generated by customizable design of the device geometry, but the intrinsic biophysical properties of the cell. As such, cDEP is a label-free technique that avoids depending upon surface-expressed molecular biomarkers that may be variably expressed within a population, while still allowing characterization, enrichment, and sorting of bioparticles.
Here, we demonstrate the basics of fabrication and experimentation using cDEP. We explain the simple preparation of a cDEP chip using soft lithography techniques. We discuss the experimental procedure for characterizing crossover frequency of a particle or cell, the frequency at which the dielectrophoretic force is zero. Finally, we demonstrate the use of this technique for sorting a mixture of ovarian cancer cells and fluorescing microspheres (beads).

Contactless dielectrophoresis (cDEP) achieves sorting and enrichment of particles via their intrinsic dielectric properties. Fluidic electrode channels replace metallic electrodes traditional to DEP, suiting cDEP to non-damaging sterile characterization and sorting of biological particles. We demonstrate how to prepare a cDEP microdevice and conduct cell characterization and sorting experiments.

非接触型誘電泳動によりラベルフリーの単離と細胞の濃縮

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

医学

Generation and Control of Electrohydrodynamic Flows in Aqueous Electrolyte Solutions

To drive electrohydrodynamic (EHD) flows in aqueous solutions, the separation of cation and anion transport pathways is essential because a directed electric body force has to be induced by ionic motions in liquid. On the other hand, positive and negative charges attract each other, and electroneutrality is maintained everywhere in equilibrium conditions. Furthermore, an increase in an applied voltage has to be suppressed to avoid water electrolysis, which causes the solutions to become unstable. Usually, EHD flows can be induced in non-aqueous solutions by applying extremely high voltages, such as tens of kV, to inject electrical charges. In this study, two methods are introduced to generate EHD flows induced by electrical charge separations in aqueous solutions, where two liquid phases are separated by an ion-exchange membrane. Due to a difference in the ionic mobility in the membrane, ion concentration polarization is induced between both sides of the membrane. In this study, we demonstrate two methods. (i) The relaxation of ion concentration gradients occurs via a flow channel that penetrates an ion-exchange membrane, where the transport of the slower species in the membrane selectively becomes dominant in the flow channel. This is a driving force to generate an EHD flow in the liquid. (ii) A long waiting time for the diffusion of ions passing through the ion-exchange membrane enables the generation of an ion-dragged flow by externally applying an electric field. Ions concentrated in a flow channel of a 1 x 1 mm2 cross-section determine the direction of the liquid flow, corresponding to the electrophoretic transport pathways. In both methods, the electric voltage difference required for an EHD flow generation is drastically reduced to near 2 V by rectifying the ion transport pathways.

The rectification of ion transport pathways is an effective method to generate one-directional ion-dragged electrohydrodynamic flows. By setting an ion-exchange membrane in a flow channel, an electrically polarized condition is generated and causes a liquid flow to be driven when an electric field is externally applied.

電解質水溶液中に流れる電気流体力学の発生と制御

To drive electrohydrodynamic (EHD) flows in aqueous solutions, the separation of cation and anion transport pathways is essential because a directed ...

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they contain various parental cell-derived biomolecules such as DNA, mRNA, miRNA, proteins, and lipids, their enrichment and isolation are critical steps for their exploitation as potential biomarkers for clinical applications. However, conventional isolation methods (e.g., ultracentrifugation) cause significant loss and damage to microvesicles and exosomes. These methods also require multiple repetitive steps &#160;of ultracentrifugation, loading, and wasting of reagents. This article describes a detailed method to fabricate an origami-paper-based device (Exo-PAD) designed for the effective enrichment and isolation of microvesicles and exosomes in a simple manner. The unique design of the Exo-PAD, consisting of accordion-like multifolded layers with convergent sample areas, is integrated with the ion concentration polarization technique, thereby enabling fivefold enrichment of the microvesicles and exosomes on specific layers. In addition, the enriched microvesicles and exosomes are isolated by simply unfolding the Exo-PAD.

Presented is a protocol to fabricate a paper-based device for the effective enrichment and isolation of microvesicles and exosomes.

マイクロベシクルとエキソソームのペーパーベースの事前濃縮と分離

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

生化学

Fabrication of Carbon-Based Ionic Electromechanically Active Soft Actuators

Ionic electromechanically active capacitive laminates are a type of smart material that move in response to electrical stimulation. Due to the soft, compliant and biomimetic nature of this deformation, actuators made of the laminate have received increasing interest in soft robotics and (bio)medical applications. However, methods to easily fabricate the active material in large (even industrial) quantities and with a high batch-to-batch and within-batch repeatability are needed to transfer the knowledge from laboratory to industry. This protocol describes a simple, industrially scalable and reproducible method for the fabrication of ionic carbon-based electromechanically active capacitive laminates and the preparation of actuators made thereof. The inclusion of a passive and chemically inert (insoluble) middle layer (e.g., a textile-reinforced polymer network or microporous Teflon) distinguishes the method from others. The protocol is divided into five steps: membrane preparation, electrode preparation, current collector attachment, cutting and shaping, and actuation. Following the protocol results in an active material that can, for example, compliantly grasp and hold a randomly shaped object as demonstrated in the article.

This article describes a fast and simple manufacturing process of ionic electromechanically active composite materials for actuators in biomedical, biomimetic and soft robotics applications. The key fabrication steps, their importance for the actuators&#39; final properties, and some of the main characterization techniques are described in detail.

炭素系イオン電気機械式活性式式式式式式式アクチュエータの製造

Ionic electromechanically active capacitive laminates are a type of smart material that move in response to electrical stimulation. Due to the soft, ...

Ion-Exchange Membranes for the Fabrication of Reverse Electrodialysis Device

Reverse electrodialysis (RED) is an effective way to generate power by mixing two different salt concentrations in water using cation-exchange membranes (CEM) and anion-exchange membranes (AEM). The RED stack is composed of an alternating arrangement of the cation-exchange membrane and anion-exchange membrane. The RED device acts as a potential candidate for fulfilling the universal demand for future energy crises. Here, in this article, we demonstrate a procedure to fabricate a reverse electrodialysis device using laboratory-scale CEM and AEM for power production. The active area of the ion-exchange membrane is 49 cm2. In this article, we provide a step-by-step procedure for synthesizing the membrane, followed by the stack&#39;s assembly and power measurement. The measurement conditions and net power output calculation have also been explained. Furthermore, we describe the fundamental parameters that are taken into consideration for obtaining a reliable outcome. We also provide a theoretical parameter that affects the overall cell performance relating to the membrane and the feed solution. In short, this experiment describes how to assemble and measure RED cells on the same platform. It also contains the working principle and calculation used for estimating the net power output of the RED stack using CEM and AEM membranes.

We demonstrate the fabrication of a reverse electrodialysis device using a cation-exchange membrane (CEM) and anion-exchange membrane (AEM) for power generation.

逆電気透析装置の製造のためのイオン交換膜

Reverse electrodialysis (RED) is an effective way to generate power by mixing two different salt concentrations in water using cation-exchange membranes ...

Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits versus other methods: DIBs are stable and often long-lasting, bilayer area can be reversibly tuned, leaflet asymmetry is readily controlled via droplet compositions, and tissue-like networks of bilayers can be obtained by adjoining many droplets. Forming DIBs requires spontaneous assembly of lipids into high density lipid monolayers at the surfaces of the droplets. While this occurs readily at room temperature for common synthetic lipids, a sufficient monolayer or stable bilayer fails to form at similar conditions for lipids with melting points above room temperature, including some cellular lipid extracts. This behavior has likely limited the compositions&#8212;and perhaps the biological relevance&#8212;of DIBs in model membrane studies. To address this problem, an experimental protocol is presented to carefully heat the oil reservoir hosting DIB droplets and characterize the effects of temperature on the lipid membrane. Specifically, this protocol shows how to use a thermally conductive aluminum fixture and resistive heating elements controlled by a feedback loop to prescribe elevated temperatures, which improves monolayer assembly and bilayer formation for a wider set of lipid types. Structural characteristics of the membrane, as well as the thermotropic phase transitions of the lipids comprising the bilayer, are quantified by measuring the changes in electrical capacitance of the DIB. Together, this procedure can aid in evaluating biophysical phenomena in model membranes over various temperatures, including determining an effective melting temperature (TM) for multi-component lipid mixtures. This capability will thus allow for closer replication of natural phase transitions in model membranes and encourage the formation and use of model membranes from a wider swath of membrane constituents, including those that better capture the heterogeneity of their cellular counterparts.

This protocol details the use of a feedback temperature-controlled heating system to promote lipid monolayer assembly and droplet interface bilayer formation for lipids with elevated melting temperatures, and capacitance measurements to characterize temperature-driven changes in the membrane.

液滴界面二層の温度制御アセンブリと特性

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

電気生理学測定の電気中立運送者の活動を研究への応用

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...