Name: isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta
Uploaded: 2017-04-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
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研究は、OU-WB ISCRM、オークランド大学とミシガン頭と背骨研究所によってサポートされていました。 N・ベアーラボルとC・マッキーオークランド大学から学長大学院研究賞を受賞しました。私たちは、原稿を見直すためS.バクシを感謝しています。

サンプル（N = 3）IRB＃820662-（ボーモント病院バイオバンク、ロイヤルオーク、MI及びプロビデンス病院、サウスフィールド、MI HIC-下（HIC番号2012から101）とIRB-を通じて同意、健康なドナーから得ました。 3）、それぞれのプロトコルを承認し、オークランド大学、ロチェスター、MIのIBC（＃2858）によって承認されたとして処理します。 1.処理ヒト臍帯、臍帯胎盤ジャンクション、および胎児胎盤および細胞を単離<ol><li> CPJに接続された6センチメートル及び3 - - FPの4センチメートル無菌的には、UCのサンプル5を含む、長さが約10cmを集めます。それにより研究室に搬送されるまで、直ちに4℃で培地（4,500ミリグラム/ mLのグルコース及び抗生物質溶液を含むDMEM（0.1％ゲンタマイシン、0.2％ストレプトマイシン、および0.12％のペニシリン））とストアを含むコレクションカップに各試料を置き発泡スチロールの箱に氷の上に置きます。収集の4時間 - 2内に4℃でサンプルを処理します。 </li><li> 150 mmのペトリ皿に試料を置きに保っバイオセーフティキャビネット内の氷。針およびシリンジを用いて、血餅を除去するために、氷冷PBSでそれを複数回リンス。サンプルは、処理中にPBSで濡れ保たれていると、それを乾燥させないようにしてください。無菌性を維持するために、サンプル処理全体のオートクレーブ処理PBSおよび外科ツールを使用して無菌的にサンプルを処理します。 </li><li> UC、CPJ、およびFP：慎重に異なる解剖学的領域を識別するためのサンプルを調べます。まず、UCを分析。ピンセットでUCの胎児の端を持ち、慎重にハサミを使用してちょうどCPJの上部にある最初のカットを作ります。 FPから - （2.0センチメートル1.5）CPJ以下第二カットCPJを分離することを可能にします。さらなる処理のために別々のペトリ皿に分離UC、CPJ、及びFPを配置します。 </li><li>完全に血管を露出し、上皮を乱すことなくWJを取り囲む、はさみと鉗子の助けを借りて、長手方向にUCを切ります。 </li><li>血管やsubamnionの内側の上皮から離れWJをこすりメスを使用して、血管を削除します。下の血管の周りに残っている血管周囲のWJを収集し、別のペトリ皿に収集したWJを配置するようにしてください。 </li><li>別々のペトリ皿に、残りの組織、臍帯ライニング（CL）を集めます。 </li><li> CL、WJ、CPJ、及びFPを表す組織を分離した後、3を含むPBSを置き換える - 商業トリプシン溶液5mLと別々にハサミを使用して、1〜2mmの断片に組織のそれぞれを切断しました。 </li><li>サンプルの部分消化のための5％CO 2インキュベーター内で37℃で30分間商業トリプシン溶液中に組織片をインキュベートします。位相差顕微鏡を用いて細胞の放出を可視化することにより部分消化を観察します。 </li><li> 10％ヒト血清/ FBSおよび抗生物質溶液（0.1％ゲンタマイシン、0.2％ストレプトマイシンを補充した4,500ミリグラム/ mLのグルコースおよび2mMのL-グルタミンを含むDMEM;部分的に消化した試料に、培養培地（CMの等量を追加、及び0.12％Penicillin））、市販のトリプシン溶液を中和します。 50mLの遠心分離管にコンテンツを転送し、部分的に消化された組織片を3分間沈降させ。 </li><li>注意深く単一細胞（それらは効率的に展開していない）を含む、上清を吸引し、15プレート- 75-cm 2の組織培養フラスコに20部分的に消化された組織片とCMの9 mLを加え。 37℃でインキュベートし、2培養フラスコを妨げない - 組織片の付着を可能にするために3日間。 注：部分的に消化された組織サンプルの残りの部分は、細胞の将来の単離のために凍結保存することができます。 </li><li>インキュベーションの3日後、CMを変更し、日常的に外植片からの細胞の成長の様子を探して。それぞれ、CPJ、CL / WJ、及びFPのインキュベーションの14日 - 4日、7 - - 10日、及び11細胞増殖は、3後に接着外植片から明らかです。この時点以降、3日ごとに後、またはとしてCMを変更必要に応じて。 注： - 10日植片からの最初の細胞成長後に細胞増殖は7 70％コンフルエンスに達しました。彼らはプラスチックに付着するまで、非付着性組織片は、任意の細胞成長を生じさせないことに注意してください。フラスコに付着組織片の剥離を避けるために邪魔されないように注意しなければなりません。培養の最初の3日後に任意の浮動部分がある場合は、それらを取り付けるための新しいフラスコにそれらを転送することによって救出することができます。 注：組織外植片から細胞増殖を70％コンフルエンスに達したとき、彼らは継代培養されなければなりません。それぞれ、24日 - 14日、14 - - 20日、および17以上のように、CL / WJ、FP、CPJからMSCは10でコンフルエンスに到達します。 </li><li>外植片から脱却する細胞を継代培養するために、1使用して細胞を解離-商業トリプシン溶液/ 75-cm 2の培養フラスコの2ミリリットルを、3分間37℃でインキュベートします。 3分間CM遠心1500×gでの2mLの - 1で中和します。作りますでも全体に拡散するため、トリプシンを添加しながら、フラスコを回転させるようにしてください。 </li><li>注：ペレット化した細胞は、継代0（P0）と見なされると、CM中に懸濁し、計数し、そして増幅、特徴付け、および凍結保存のために1×10 4個 / cm 2の播種密度で継代培養します。過剰の細胞は、P0で凍結保存することができます。 </li></ol> 2.単離された細胞の特徴付け<ol><li> コロニー形成効率（CFE）アッセイ <ol><li> 30分間、0.1％ゼラチンでコート100 mmのペトリ皿（60センチメートル2の表面積）と37℃でCO 2インキュベーターに置きます。 注：必要ではないが、ゼラチンコート細胞接着を向上させることができます。 </li><li>過剰のゼラチンを除去及び/ cm 2で1.63個の細胞の濃度で、P0細胞で被覆したプレートに播種。 CMの3 mLを加え、37℃でCO 2インキュベーター中でインキュベートします。 </li><li>クローンの成長のために播種したプレートを監視光学顕微鏡（LM）によると、3日ごとに培地を変更します。 </li><li> 10後 - 細胞増殖の14日間、PBSで2回ペトリ皿を洗浄し、室温で30分間、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。 注：パラホルムアルデヒドは有毒です。使用中に手袋やメガネを身に着けていることによって、注意を練習してください。 </li><li>室温で1時間、0.1％クリスタルバイオレットで固定した細胞を染色し、結合していない青色染色がなくなるまで水道水でプレートをすすぎます。 </li><li> LMを用いて、少なくとも50個の細胞で構成されるコロニーの数を数えます。 </li></ol></li><li> 細胞表面マーカーの発現 <ol><li> 70％のコンフルエンスまで培養単離された細胞を、商業的なトリプシン溶液を用いて解離し、そして3分間、1500×gで遠心分離することにより洗浄し、ペレット。 （2％FBSおよび0.1％アジ化ナトリウムを含む1×PBS）FACS緩衝液で細胞を停止します。 注：アジ化ナトリウムは有毒です。使用中に手袋やメガネを身に着けていることによって、注意を練習してください。 </li><li30分間、FACS緩衝液中（CD29、CD73、およびCD105：に対するCD44およびCD90またはAPC結合抗体に対するFITC結合抗体）&gt; FITC-またはAPC標識MSC特異的抗体を用いて細胞（約10 6）染色暗所で4℃。 </li><li> 、5分間670×gで染色された細胞を遠心分離し、上清を吸引し、FACS緩衝液500μLに細胞を再懸濁。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってFACSを用いて抗体染色細胞を分析します。 </li></ol></li></ol> 3.分化能<ol><li> 脂肪細胞への分化 <ol><li> 70％のコンフルエンスまで培養単離された細胞を、商業的なトリプシン溶液を用いて解離し、そして3分間、1500×gで遠心分離することにより洗浄し、ペレット。 </li><li> 37℃でCO 2インキュベーター中で、培養100,000細胞の濃度で細胞/ウェルのCMの2 mLを含む6ウェルプレート。 </li><li> 24時間後、adipogでCMを置き換えますENIC分化培地（0.5μMイソブチル - メチルキサンチン、1μMのデキサメタゾン、10μMのインスリン、および200μMインドメタシン）とインキュベートします。 3日ごとに分化培地を変更するか、できるだけ頻繁に必要としていました。 </li><li>インキュベーションの3週間後、脂肪細胞への分化のために分析するために、脂質滴の産生を検出するためにオイルレッドOを用いて室温と染色で30分間、ウェル当たり4％パラホルムアルデヒド2mLで細胞を固定。 注：パラホルムアルデヒドは有毒です。使用中に手袋やメガネを身に着けていることによって、注意を練習してください。 </li><li> 5分間、60％イソプロパノール（6ウェルプレートの2ミリリットル/ウェル）で固定した細胞を治療します。 </li><li>オイルレッドO染色の2mLの（フィルタ3部のオイルレッドO染色および2部の蒸留水）とイソプロパノールを交換し、室温で15-30分間インキュベートし、そして3洗浄 - 未結合の汚れを除去するために、水道水で4回。 </li><li>脂肪生成細胞系譜を示す赤に染色された脂肪滴を、可視化、ULMを歌います。 </li></ol></li><li> 軟骨形成分化 <ol><li> 70％のコンフルエンスまで培養単離された細胞は、商業的なトリプシン溶液を用いて解離し、そしてPBSで洗浄します。 </li><li> 8分間、11,000×gで軟骨誘導、遠心機CMの2 mlを15 mL遠心管中250,000細胞のための細胞をペレット化します。 37°Cで一晩ペレットをインキュベートします。 </li><li> 24時間後、穏やかにペレットを乱すことなく、軟骨形成分化培地（20 ngのTGFβ1、10ngのインスリン、100nMのデキサメタゾン、および100μMアスコルビン酸）を用いてCMを交換し、インキュベーションを続けます。 3日ごとに分化培地を変更するか、できるだけ頻繁に必要としていました。 </li><li>インキュベーションの3週間後、室温で30分間、ウェル当たり4％パラホルムアルデヒド2mLで細胞を固定。 1％トルイジンブルーで染色凍結切片とは、軟骨形成分化を決定するために、細胞外マトリックスの存在または生産を調べました。 注：Paのraformaldehydeは有毒です。使用中に手袋やメガネを身に着けていることによって、注意を練習してください。 </li><li>凍結切片化のために、穏やかにPBSで2回採取し、細胞ペレットを洗浄し、室温で30分間、4％パラホルムアルデヒド1mLで固定します。 注：パラホルムアルデヒドは有毒です。使用中に手袋、目の摩耗を身に着けていることによって、注意を練習してください。 </li><li>パラホルムアルデヒドを除去し、スクロース/ octの溶液に転送するためにPBSで2回ペレットを洗浄（1：2、20％スクロース：OCT）。溶液が完全に細胞ペレットに浸透することを可能にするために室温で24時間インキュベートします。これは、スムーズな区分けが可能になります。 </li><li> 10月の金型にペレットを転送します。 6時間および凍結切片約10 - - トルイジンブルー染色のためにクライオスタットを用いて細胞ペレットの12ミクロン厚の切片4 -20℃で金型を凍結します。 </li><li> PBSで穏やかに凍結切片を洗浄します。完全スライド上ペレットセクションを覆う、1％トルイジンブルー染色の数滴を加えます。そして、株式会社室温で1時間ubate。 </li><li>脱色するPBS複数回スライドを洗浄します。 （95％のHClのアルコール+ 0.5 mL）に複数回結合していない青色がなくなるまでHClをベースアルコール溶液中にスライドを浸漬することにより、過剰な汚れを取り除きます。スライドの長期保存のための取付溶液の100μLを用いて染色した切片をマウント。 注：セクションの青い染色は、グリコサミノグリカンおよび糖タンパク質の存在を示すとLMを用いて観察可能であろう。 </li></ol></li><li> 骨形成分化 <ol><li>再び、70％コンフルエンスまで培養単離された細胞を、商業的なトリプシン溶液を用いて解離し、そして3分間、1500×gで遠心分離することにより洗浄し、ペレット。 </li><li> 100,000細胞/ウェルの37℃でCO 2インキュベーター内でCMの2 mLを含む6ウェルプレートの濃度で細胞を継代培養。 </li><li> 24時間後に、骨形成分化培地でCMを交換（0.1μ; Mデキサメタゾン、βグリセロリン酸10μM、及び50μMアスコルビン酸リン酸）とのインキュベーションを続けます。 3日ごとに分化培地を変更するか、できるだけ頻繁に必要としていました。 </li><li>インキュベーションの3週間後に、骨形成分化を決定するために、カルシウム沈着の存在を検出する室温とアリザリンレッドで染色で30分間、ウェルあたり2mLの4％のパラホルムアルデヒドで細胞を固定します。 注：パラホルムアルデヒドは有毒です。使用中に手袋やメガネを身に着けていることによって、注意を練習してください。 </li><li>穏やかに蒸留水で2回固定した細胞を洗浄し、暗所で室温で1時間2％のアリザリンレッド染色（6ウェルプレート中の2 mLの/ウェル）を用いて治療します。 </li><li>カルシウム堆積物が剥がれないように穏やかに水道水で洗浄することにより過剰の染色を除去。 </li><li> LMを用いて赤色に染色されたカルシウム沈着を可視化します。 </li></ol></li></ol> 4.定量的逆転写酵素ポリメラーゼチャ反応（QRT-PCR）分析に<ol><li>培養70％コンフルエンスに単離された細胞は、全細胞RNAを単離するために3分間1500×gで遠心分離することによって商業トリプシン溶液、洗浄、及びペレットと解離します。 </li><li> FBSの痕跡を除去し、次いで製造業者の指示に従って、商業RNA精製キットを用いてRNA単離に進むためにPBSで細胞を洗浄します。 </li><li>サーモサイクラーを用いて37℃で30分間DNaseで処理することによって単離された全RNAを精製します。製造業者の指示に従って市販のキットを用いてcDNAを合成します。 </li><li> SYBRグリーンPCRスーパーミックスの5μLを含む各反応を、96ウェルプレートに三重10μLPCR反応を準備します。二重蒸留水の3μL;各プライマーの0.5μL、フォワードおよびリバース。希釈（1:10）cDNAの1μL。 </li><li>以下のパラメータの下でPCRを行う：30秒毎の44サイクル、続いて98℃で10分間、98＆に＃176; C、60°Cで20秒、及び72℃で30秒。 </li><li>参照遺伝子、GAPDH、およびβアクチンに対する標的遺伝子の増幅を正規化します。プライマー配列を表1に列挙されています。 </li></ol> 5.統計解析<ol><li>統計ソフトウェアを使用してすべての分析を行います。平均±SEMとしてデータを提示します。 p値（0.05≤** P≤0.01と* P）との結果は統計的に有意であると考えられました。 </li></ol>

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著者は、開示することは何もありません。

幹細胞研究の最近の進歩は、基本的な開発プロセスの理解を改善だけでなく、バイオテクノロジー、製薬、細胞治療、再生医療、および組織工学アプリケーション18、19、20における幹細胞の使用のための有望な機会を提供していないだけ。初期胚から分離された多能性ESCのが最も有望であるが、それらは技術的な課題と倫理的ジレンマ21、22、23に直面しています。成体細胞由来誘導多能性幹細胞（性IPSC）は、代替手段を提供しますが、彼らはあまりにも同様の技術的および安全性の問題に直面している23。さらに、性IPSCは、遺伝的に安定ではないかもしれないか、従って、それらの治療的使用を制限し、遺伝的変化を受けていてもよいです。幹細胞は、出生後のTISの様々な報告されています訴えると臓器。これらのASCの最も一般的な発生源は、骨髄、脂肪、および筋肉組織です。しかし、出生後の発生源からのASCは、増殖および分化の可能性24、25が限られています。彼らはまた、経年や環境ストレスへの暴露に苦しむので、常に治療への応用26、27、28のために有効ではありません。これは、ASCをよりナイーブである幹細胞の新しいソースを検索するために、私たちと他の人をリードしてきました。 当社は、ASCをの代替として原始的な幹細胞の周産期情報源を調査しました。本稿では、コード/胎盤サンプルからヒトMSCを単離するために、信頼性の高い堅牢、かつ簡単な方法を提供します。 ASCの単離のために使用される他の供給源および方法と比較して、この方法は、HIGを大量に単離するための効率的かつ非侵襲的な方法を提供しますH-品質のMSC。それは、さらに、BMとして大人のソースからのMSCに比べて周産期のMSCのより高い増殖および分化の可能性を強調する。 胎盤に胎児を取り付けるUCは、二つの動脈、静脈、CL、及びWJ（血管の周囲の組織）を含む別個の解剖学的領域と大きい器官です。いくつかの研究は、可変の増殖および分化ポテンシャル25で、29の全体のコードからのMSCの単離、WJ、または胎盤を報告しています。それにもかかわらず、現在までに、何の研究では、効果的に調査しないとコード/胎盤試料の異なる解剖学的領域から細胞を比較しました。ここではMSCの単離のためのUC、CPJ、および接続されたFPの解剖のための体系的かつ簡単な方法を提供します。また、その増殖のcapabilを決定することによって、特徴づけ、単離された細胞の品質を評価するために、包括的かつシンプルなプロトコルを表示しますities、並びにそれらの自己複製と分化ポテンシャル。この方法は、再現性があり、かつ、優れた品質のMSCの大規模な量を生み出します。 我々は、単一の細胞内への組織の完全な消化が単離された細胞の低い収率を持っていたのに対し、市販のトリプシン溶液を使用して、サイズが組織片の部分消化1〜2ミリメートルの再現性、外植片から細胞をもたらしたことがわかりました。しかし、ある研究は、UCの大きな組織外植片のサイズの約10mmの細胞の単離30のために最適であったことを報告しました。逆に、別の研究では、組織外植片法は、酵素消化法31と比較してより長い培養周期と細胞のより低い収率をもたらしたことを示唆しました。以前の報告では、コードの処理は、コラゲナーゼIIおよびヒアルロニダーゼ、別々に、またはトリプシンを以下で組織、臍帯細胞32、33を単離するために行われてきました<sup&gt; 34。だけでなく、前培養に、臍帯組織の消化方法のばらつきの大きな取引がありますが、また、単離された細胞は異質であるように思われました。より長い期間のために過酷な酵素の使用は、細胞接着および増殖に影響を与え、細胞膜を劣化させることができます。この方法の結果は、部分的に消化された周産期組織外植片は、広範な細胞損傷を引き起こすことなく、細胞の成長を提供することが示された生存率を維持し、MSCの同種集団のより高い量を得ました。 外植片からの細胞の解離および分離するためのプロトコルは簡単であるが、ステップのいくつかは、困難になるかもしれません。まず、培養フラスコの表面への付着を可能にすることによって、外植片の付着を確実にします。これは培養の最初の2時間のために組織片をカバーする、媒体の少量を使用し、次いで注意深く残りの培地を添加することによって容易にすることができます。 Second、T75フラスコあたり15未満に外植片の数を制限します。フラスコあたりピースまたはあまりにも多くの作品の間にあまりにも小さなスペースでは、細胞成長のために抑制されています。インキュベーションの3日後に培養フラスコの表面に付着しない第三に、組織片を遵守し、培養のために新しいフラスコに転送する必要があります。第四に、培養される組織片は、添付ファイルを阻害する細胞破片の自由でなければなりません。第五に、大部分の培養は、より多くのメディアを必要とし、細胞の伸長効率を改善しません。細胞が急速にコンフルエントになり、組織源に応じて区別できるように最後に、特に細胞成長の出現後に、密接に外植片培養物をモニターします。技術のいくつかの制限がCL、WJ、CPJ、及びFPを分離するために試料を解剖の専門知識の欠如が挙げられます。低WJの収率で得られたサンプルサイズが小さいです、。そして遅延加工試料をAVOする収集の2~4時間以内に処理する必要がありますID細胞回復の損失。 MSCの特徴づけのためのゴールドスタンダードは、プラスチックに付着線維芽細胞の表現型を形成し、複数の系統に分化する能力です。これらはまた、ISCT 35によって記載されるようにMSCを定義するための一般的に使用される基準です。本研究では、4つ全ての供給源から単離された細胞はプラスチックに付着しており、MSCマーカー（CD29、CD44、CD73、CD90、およびCD105）造血マーカーCD45について陰性発現について陽性発現が認められました。加えて、それらは、ヒト白血球抗原（HLA）クラスIを発現するがHLAクラスIIについて陰性でした。 BM-MSCは、WJ-とCPJ由来細胞に比べて高かったです。これらの結果は、UC由来MSC 33、36、37、38の以前の報告と一致しています。加えて、我々の結果は、CL-、WJ-、CPJ-は、FP-MSCは多能発現することを示しましたそのようなOCT4、NANOG、およびSOX2として効力遺伝子;以前に報告されたように39しかし、彼らの表現は、ESCのそれよりも低かったです。これらの結果は、周産期由来細胞40における多能性マーカーの発現を報告した以前の研究と一致してもいました。興味深いことに、それは多能性マーカーの発現は、他の供給源から単離された細胞におけるよりCPJ-MSCの中に高かったことが観察されました。また、UC-MSCがBM-MSCの41を上回る自己複製能を示したことに気づきました。興味深いことに、表現型の特徴の類似性にもかかわらず4つの供給源から単離された細胞は、可変CFE値を有していました。しかし、FP-MSCを除き、それらはすべてBM-MSCのより良いCFE値を有していました。他のすべてのMSCと比較するとCPJ-MSCは増殖の最高CFE値とレートを持っていました。また、WJ-とCPJ-MSCがBM-MSCのより高い分化能を示しました。 CL-MSCは少なくとも分化を示しました。すべての3つの系統（ すなわち、脂肪生成、軟骨、および骨形成）への潜在的な、CPJ-MSCは最高trilineageの分化能を有しており、FP-MSCは少なくとも脂肪生成分化能を表示するのに対し。 結論として、我々の結果は、単離されたMSCの質と量がコード/胎盤サンプルの4つのソース間で異なることを示しました。 CPJ-MSCは、より多くの増殖能力と大きな自己再生能力を持っていました。彼らはtrilineage細胞型への分化にも強力でした。それらの低倍加時間に、CPJ-MSCは、急速に1000倍に拡大することができ、高スループット薬物または生体材料のスクリーニングのために使用します。これらの細胞は、細胞治療や再生医療アプリケーションのためのより多くの有望な供給源である可能性があります。

幹細胞は様々な臓器や身体の組織に存在します。彼らは再生能力を有し、人間の生命1、2のスパンを通じて体内に損傷を受けた組織の修復に大きな役割を果たしています。これは、特に以来、成体幹細胞（ASCに）、で大きな関心を生成した胚性幹細胞（ESC）とは異なり、ASCの使用は道徳的、倫理的ジレンマをもたらすことはありません。いくつかの研究は、間葉系間質細胞（MSC）のように、ASCの単離を報告しています。造血幹細胞（HSC）;骨髄（BM）から脂肪組織（AT）および歯髄3、4、5の範囲の様々な大人のソースを含むと異なる前駆体、。しかし、成人のニッチのほとんどに存在するASCの数は限られており、それらの単離は、一般的に可能ドナーと侵襲性と痛みを伴う手順を含みますサイトの罹患率。また、ドナーの年齢や環境ストレスも単離された細胞6、7、8の品質および生物学的活性を決定する上で重要な役割を果たすことができます。 ASCはまた、in vitroでの培養中に限られた増殖と分化能を表示します。 現在のASCのこれらの欠点を克服するために、新しいソースは、幹細胞を単離するために追求されてきました。これらの努力は、臍帯血、臍帯組織、胎盤、羊水9を含む周産期のソースからの幹細胞の単離、につながっています。これらのソースは、その簡単で、豊富な可用性10、11、12、13の注目を集めています。また、周産期組織は、非侵襲的に得られ、それらから誘導された幹細胞ことができます成人源14,15から単離されたASCよりプリミティブ。彼らは、出生時に得られた組織から分離されており、経年変化や環境ストレス16にゲノムに最小限の変化を受けていると考えられます。 しかし、自己複製ならびに分化するように周産期源及びそれらの可能性からの幹細胞の報告された特性は、17、11広く変えます。これは、ヒト臍帯（UC）は複雑な器官であるという事実に一部である可能性があります。私たちは、周産期の組織の別個の領域がバリエーションと非周産期源由来のASCと比較してこれらの幹細胞のより原始的な性質を担当する特定のニッチを作成すると仮定しました。 UC、臍帯胎盤接合（CPJ）：この研究は、三の別個の解剖学的領域にコード/胎盤サンプルの解剖を説明しますD胎児の胎盤（FP）。コードライニング（CL）とウォートンのゼリー（WJ）：UCは、さらに2つのゾーンに解剖しました。 CL、WJ、CPJ、及びFPから単離された細胞の分析は、それら全てが線維芽細胞様の形態を示し、MSCマーカーを発現することを実証したが、彼らは彼らの自己再生および分化能が異なります。 CPJ由来の細胞は、それらの細胞治療、再生医療、および組織工学のためのより多くの有望なソース作り、UC-とFP由来細胞と比較して高い増殖率と自己複製能を示しました。

<table><tbody><tr><td>DMEM with 4,500 mg/mL glucose</td><td>Invitrogen</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Aleken Biologicals</td><td>FBSS500</td><td></td></tr><tr><td>Isobutyl-methylxanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879-250mg</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D4902-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Prospec</td><td>CYT-270</td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma</td><td>I7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>TGF&amp;beta;1</td><td>Prospec</td><td>CYT-716</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>A-7631</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbate 2-phosphate</td><td>Sigma</td><td>A-8960</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>Sigma</td><td>G-6251</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>50591419</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET RNA purification kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>iScript kit</td><td>Biorad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit</td><td>Biorad</td><td>1725274</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH75-125D</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O&amp;nbsp;</td><td>American MasterTech Scientific</td><td>STORO100</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine blue</td><td>Thermo Scientific</td><td>S71363</td><td></td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin red stain</td><td>Thermo Scientific</td><td>S25131</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse anti-Human CD29</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>559883</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse anti-Human CD34</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>555824</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-Human CD44</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>555478</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-Human CD45</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse anti-Human CD73</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>560847</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-Human CD90</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>561969</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse anti-Human CD105</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>IEC</td><td>93522M-2</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Hera Cell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope (LM)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>0267151B</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II and Diva Software</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>Canto II&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>MJ Research Inc.</td><td>PTC-100</td><td></td></tr><tr><td>Real-Time PCR System&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta

ヒト臍帯（UC）および胎盤は、彼らがどんな倫理的あるいは道徳的な懸念を提起していないので、ますます注目を集めている間葉系間質細胞（MSC）の非侵襲的、原始的と豊富な源です。 UCからMSCを分離するための現在の方法は、可変の増殖ポテンシャルを有する細胞の低量が得られます。 UCは、解剖学的に複雑な器官であるため、MSCの特性の違いは、それらの単離の解剖学的領域の違いに起因し得ます。 UC、臍帯胎盤接合（CPJ）、および胎児胎盤（FP）：本研究では、最初の3つの別個の解剖学的領域にコード/胎盤サンプルを解剖しました。第二に、二つの異なるゾーン、コードライニング（CL）及びウォートンゼリー（WJ）は、分離しました。外植片培養技術は、その後4つの源から細胞を単離するのに使用しました。外植片からの細胞の初代培養に必要な時間は、組織の供給源に依存して変化しました。 4ダ - 細胞の増殖は、3以内に発生しましたCPJ外植片のYS、成長が7の後に観察された - それぞれ、CL / WJ及びFP外植片から14日 - 10日及び11。単離された細胞はプラスチックに付着したと同様に、骨髄（BM）由来のMSCに、例えばCD29、CD44、CD73、CD90、およびCD105などの線維芽細胞様形態および表面マーカーを、表示しました。しかしながらCPJ-MSCおよびBM-MSCのより高い効率を示すWJ-MSCを用いて、変化した細胞を、コロニー形成効率。 4つのすべてのソースからのMSCは、それらが多能性であったことを示す、脂肪生成、軟骨形成、及び骨形成系統に分化しました。 CPJ-MSCは、他のMSC源と比較して、より効率的に分化しました。これらの結果は、CPJは、最も強力な解剖学的領域であり、in vitroでのより大きな増殖と自己複製能力を有する細胞の高い数を、生み出すことを示唆しています。結論では、4つのソースからのMSCの比較分析は、CPJは、細胞療法のためのMSCのより有望な源、regenerativであることを示し電子薬、および組織工学。

解剖およびヒト臍帯、臍帯胎盤ジャンクション、および胎児胎盤からの細胞の単離周産期の組織は3つの個別の解剖学的領域から構成されています。 CL（紐の外側ライニング）とWJ（臍帯内部の血管を取り囲むゼリー状物質）：最初は、二つの動脈と一つ静脈、ならびに二つの別個のゾーンを含む、UCです。第二は、CPJ（臍帯および胎盤の間の接続）であり、第3は、（コードが母親の子宮壁に取り付けられた胎盤に挿入）CPJ直後であるFP、です。周産期組織からの細胞の単離プロトコールの概略を図1に示されています。 4つのソース-CL、WJ、CPJ、そして明確に識別FPは、であり、 図2に示すように、外植片から細胞を単離するために分離しました。 T外植片培養物からの細胞伸長の彼の外観は、定期的に監視し、LMによって記録されました。接着性線維芽細胞は、CPJの外植片を培養の3~4日後に観察されました。同様の形態を有する細胞は、それぞれ、WJ、CL、及びFP外植片を培養した後、7-8、9-10、および11-14日目に見えました。様々なソース（CL、WJ、CPJ、及びFP）を表す外植片からの細胞の成長は、図3Aに示されています。これらの細胞は、P0としました。 P0細胞を継代培養したところ、BM-MSCのと同様の線維芽細胞様の形態を示す、クローンに成長するように見えました。しかし、それらは、 図3B及びCに示すように、32時間からCPJ及びFPからの細胞のために94時間の範囲、集団倍加時間の変化を示しました。 WJとCLからの細胞は、CPJとFPと同様の倍加時間の内側を持っていました。 P0細胞のさらなる分析は、彼らはまた、16から92個のコロニーの範囲、CFEに変化することを示しました。FP細胞が最低（16）CFEを有していたCPJからの細胞は、最高（92）を有していました。 CL及びWJからの細胞（ 図4A〜C）は、それぞれ、59および80個のコロニーのCFE値を有していました。 CLからの細胞は、BM-MSCのに似CFE値を有していました。これらの結果は、CPJ由来細胞が高い増殖と自己複製能力を有することを示唆しています。 単離された細胞のImmunoprofile CL、WJ、CPJ、及びFPから単離された細胞は、細胞特異的マーカーの発現について調べました。 P3-5細胞は、CD29、CD44、CD73、CD90、およびCD105（ 図5AおよびB）としてのMSCマーカーについて陽性発現を示しました。これらの細胞はまた、私はマーカ主要組織適合性クラス、HLA-ABCを発現することが知られており、クラスIIマーカー、HLA-DR 3を発現しません。目のための陽性細胞の百分率4つのすべてのソースから選択されたマーカーをESE標準BM-MSCので表さものと同様でした。しかし、MFI比はWJ-とCPJ由来細胞がほぼ類似しており、CL-とFP由来細胞（ 図5C）よりも高いことを示しています。興味深いことに、CFE値を変化させるにもかかわらず、異なるソースからのすべての細胞は、MSCマーカーの類似のレベルを発現しました。細胞表面マーカーの結果に基づいて、4つのすべての供給源から単離された細胞を、MSCのとみなしました。これらの細胞のさらなる分析は、 図5Dに示すように、それらはまた、多能性遺伝子、OCT4、NANOG、KLF4、およびSOX2を発現することが明らかになりました。 CPJ-MSCはWJ-、CL-とFP-MSCの続く多能性マーカーの最も高い発現を、持っていました。 孤立MSCの分化能 MSCを特徴付けるためのゴールドスタンダードは、diffeする能力であります複数の系統にrentiate。我々の結果は、周産期源の全てから単離されたMSCが容易脂肪生成、軟骨形成、及び骨形成性細胞型に分化することが示されました。脂肪生成誘導体は、図6（a）に示すように正、オイルレッドOで染色した脂肪滴を生成しました。 MSCの軟骨形成誘導体のトルイジンブルー染色は、細胞外マトリックス（ 図6B）の産生を支援プロテオグリカンおよび糖タンパク質の存在を実証しました。 図6Cに示すように、積極的にアリザリンレッドで染色されたMSCの骨形成性誘導体としては、骨の石灰化に関与するカルシウム沈着物の存在を示します。 予想されたように、すべてのソースから単離されたMSCの転写分析はtrilineage分化（ 図6D -F）を示しました。しかし、ポット分化のentialは、MSCのソースに依存して変化しました。 WJ-MSCの脂肪生成誘導体はCPJ-のMSCに比べ選択脂肪生成遺伝子（CEBPβ、FABP4、およびPPARγ）の2倍より高い発現レベルを有していました。 CL-とFP-MSCは、これらの遺伝子の最低の表現を持っていました。軟骨形成分化の場合には、CPJ-MSCの誘導体はWJ-とFP-MSCの誘導体よりも50倍高い選択軟骨の遺伝子（SOX9およびCOL2）を発現しました。 CL-MSCの乏しい脂肪生成分化と同様に、それらは軟骨の遺伝子の最も低い発現によって明らかなように、低い軟骨形成潜在能力を有していました。選択された骨形成遺伝子（COL1、OPN、およびOCN）の2倍より高い転写レベルによって示されるようにCPJ-MSCはまた、最も高い骨形成分化能を示しました。しかしながら、前駆細胞マーカーRUNX2の発現は、これらの細胞は、分化条件に応答における遅かったことを示し、WJ-MSCの骨原性誘導体で最も高かったです。ここでも、CL-MSCは、貧しい示しました。骨形成系列への分化。これらの結果は、CPJ-MSCおよびWJ-MSCはCL-とFP-MSCのより大きな分化能を表示することを示唆しています。 CL-MSCはtrilineage誘導体に分化する最低の可能性がありました。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig1.jpg" /> 図1： ヒト臍帯、臍帯胎盤ジャンクション、および胎児胎盤からの細胞の単離の概略。収集したサンプルを検査し、解剖を進めます。臍帯（UC）、臍帯胎盤接合（CPJ）、および胎児胎盤（FP）： ステップ1.手動3つの離散領域にコード/胎盤サンプルを分析し、分離します。ハサミとピンセットを用いて臍帯ライニング（CL）にUC 2つの異なるゾーンを分離し、ウォートンゼリー（WJ）。 ステップ2。 1- Tに別々に解剖した組織の各々をカットO 2 mmの片は、はさみを使用して、部分的に片を消化します。 ステップ3.文化に組織片。 ステップ4は、トリプシン処理により、外植片から細胞を分離します。単離された細胞を継代培養し、特徴づけます。 ステップ5.単離および特徴づけ細胞が増幅され、様々な用途に使用することができます。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55224/55224fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig2.jpg" /> 図2： ヒト臍帯、臍帯胎盤ジャンクション、および胎児胎盤からの解離及び外植片の培養。図示コード/胎盤試料の三つの異なる解剖学的領域である：UC（CLおよびWJに分割）、CPJ、およびFP、ならびに関連する動脈および静脈。 CL、WJ、CPJ、そしてFPは、外植片から細胞を単離するために手動切開により分離しました。解剖領域の各々は、別々にCMの9 mLのを使用して2枚のプレートを小さな断片に切断し、75-CM中で培養しました。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55224/55224fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig3.jpg" /> 図3： ヒト臍帯、臍帯胎盤ジャンクション、および胎児胎盤から単離された細胞の形態。 LMにより可視化（A）CL、WJ、CPJ、及びFPの外植片からの細胞成長、。 CL、WJ、CPJ、及びFP外植片から単離された細胞の（B）継代培養は、線維芽細胞様形態を示しました。スケールバーは100μmの（：4X倍率）を表しています。 Tの倍加時間（C）人口彼はCL、WJ、CPJ、およびFPから細胞を単離しました。 BM-MSCは、標準として用いました。エラーバーは三重測定の平均の標準誤差を表す（** P≤0.05≤0.01 * P）。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55224/55224fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig4.jpg" /> 図4： コロニー形成ヒト臍帯、臍帯胎盤ジャンクション、および胎児胎盤からの細胞の効率。 1.63細胞/ cm 2のクローン密度で播種CL、WJ、CPJ、及びFPから単離された細胞（P0）の（A）の成長は、LMによって可視化しました。コロニー形成能力を表示バイオレット（B）結晶で染色された細胞の顕微鏡写真。 （C）細胞を染色したウィットの単一コロニーHクリスタルバイオレット。スケールバーは100μmで（：4X倍率）を示します。 （D）CL、WJ、CPJ、及びFPに由来する細胞から形成されたコロニーの数のグラフ表示。 BM-MSCは、標準として用いました。エラーバーは三重測定の平均の標準誤差を表す（** P≤0.05≤0.01 * P）。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55224/55224fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig5.jpg" /> 図5： ヒト臍帯、臍帯胎盤ジャンクション、および胎児胎盤から単離された細胞によって発現MSCマーカーの分析。 （A）CL、WJ、CPJ、及びFPから細胞による間葉表面マーカー（CD29、CD44、CD73、CD90、およびCD105）の発現、抑止としてフローサイトメトリーによって採掘。 （B及びC）陽性細胞のパーセンテージおよび選択された間葉表面マーカーについてのメジアン蛍光強度（MFI）比のグラフ表示。 MFI比はアイソタイプのMFI値によって（ゲーティングされた細胞集団の蛍光強度に基づいてソフトウェアによって生成される）マーカーのMFI値を割ることにより計算しました。エラーバーは三連の測定の平均値の標準誤差を表します。 QRT-PCRにより決定される（D）CL、WJ、CPJ、及びFPから細胞による多能性遺伝子（OCT4、NANOG、KLF4、およびSOX2）の発現、。 （** P≤0.01と* P≤0.05）。遺伝子発現は、GAPDHおよびβアクチンに対して正規化し、エラーバーは三重測定の平均の標準誤差を表します。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55224/55224fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図6： ヒト臍帯、臍帯胎盤ジャンクション、および胎児胎盤から単離さMSCの多系列分化。 （A）細胞は、脂質滴の存在を示す、3週間、脂肪生成分化培地中でインキュベートし、オイルレッドOで染色しました。 （B）細胞ペレットを3週間にわたって軟骨形成分化培地中でインキュベートしました。ペレット培養物の組織学的凍結切片は、グリコサミノグリカンの存在を表示し、トルイジンブルーで染色しました。 （C）細胞は、骨の石灰化を示唆しているカルシウム沈着物の生産を表示する、3週間、骨形成分化培地中でインキュベートし、アリザリンレッドで染色しました。すべての画像はLMによって得られました。スケールバーは100μmの（：4X倍率）を表しています。 BM-MSCは、我々標準として再利用。選択された遺伝子の（DF）式（CEBPβ、FABP4、およびPPARγ、SOX9、ACAN、及びCOL2;それぞれとCOL1、RUNX2、OPN、およびOCN脂肪生成、軟骨形成、及び骨形成系統へのMSCの分化を表す）、決定されQRT-PCR分析によって（** P≤0.01 * P≤0.05）。遺伝子発現は、GAPDHおよびβアクチンに対して正規化し、エラーバーは三重測定の平均の標準誤差を表します。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55224/55224fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 遺伝子 </td><td> プライマー配列 </td><td> 製品長さ </td></tr><tr><td> OCT4 </td><td>フォワード-CCCCTGGTGCCGTGAA </td><td> 97 </td></tr><tr><td></td><td>逆GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG </td><td> &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> NANOG </td><td>将来をAAAGAATCTTCACCTATGCC </td><td> 110 </td></tr><tr><td></td><td>逆GAAGGAAGAGGAGAGACAGT </td><td></td></tr><tr><td> KLF4 </td><td>将来をCGAACCCACACAGGTGAGAA </td><td> 94 </td></tr><tr><td></td><td>逆TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC </td><td></td></tr><tr><td> SOX2 </td><td>将来をTTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA </td><td> 75 </td></tr><tr><td></td><td>逆CTGGGGCTCAAACTTCTCTC </td><td></td></tr><tr><td> SOX9 </td><td>将来をAGCGAACGCACATCAAGAC </td><td> 85 </td></tr><tr><td></td><td>逆CTGTAGGCGATCTGTTGGGG </td><td></td></tr><tr><td> COL2 </td><td>将来をCTCGTGGCAGAGATGGAGAA </td><td> 252 </td></tr><tr><td></td><td>逆CACCAGGTTCACCAGGATTG </td><td></td></tr><tr><td> ACAN </td><td>将来をAGCCTGCGCTCCAATGACT </td><td> 103 </td></tr><tr><td></td><tD&gt;逆GGAACACGATGCCTTTCACC </td><td></td></tr><tr><td> COL1 </td><td>将来をAAGGTCATGCTGGTCTTGCT </td><td> 114 </td></tr><tr><td></td><td>逆GACCCTGTTCACCTTTTCCA </td><td></td></tr><tr><td> RUNX2 </td><td>将来をTGCTTCATTCGCCTCACAAA </td><td> 111 </td></tr><tr><td></td><td>逆AGTGACCTGCGGAGATTAAC </td><td></td></tr><tr><td> OPN </td><td>将来をCATACAAGGCCATCCCCGTT </td><td> 112 </td></tr><tr><td></td><td>逆TGGGTTTCAGCACTCTGGTC </td><td></td></tr><tr><td> OCN </td><td>将来をTAAACAGTGCTGGAGGCTGG </td><td> 191 </td></tr><tr><td></td><td>逆CTTGGACACAAAGGCTGCAC </td><td></td></tr><tr><td> CEBPβ </td><td>将来をTATAGGCTGGGCTTCCCCTT </td><td> 94 </td></tr><tr><td></td><td>逆AGCTTTCTGGTGTGACTCGG </td><td></td></tr><tr><td> FABP4 </td><td>将来をTTAGATGGGGGTGTCCTGGT </td><td> 158 </td></tr><tr><td></td><td>逆GGTCAACGTCCCTTGGCTTA </td><td></td></tr><tr><td> PPARγ </td><td>将来をGGCTTCATGACAAGGGAGTTTC </td><td> 74 </td></tr><tr><td></td><td>逆ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG </td><td></td></tr><tr><td> GAPDH </td><td>将来をACAACTTTGGTATCGTGGAAGG </td><td> 101 </td></tr><tr><td></td><td>逆GCCATCACGCCACAGTTTC </td><td></td></tr><tr><td>アクチン</td><td>将来をAATCTGGCACCACACCTTCTAC </td><td> 170 </td></tr><tr><td></td><td>逆ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC </td><td></td></tr></tbody></table> 表1：本研究で用いたヒトプライマー配列のリスト。

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Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

ここで、我々は、ヒト臍帯（UC）および臍帯に胎児胎盤サンプル単離のための（CL）、ウォートンゼリー（WJ）、臍帯胎盤接合（CPJ）、および胎児胎盤（FP）裏地の解剖のためのプロトコルを提示しますそして外植片培養技術を用いて、間葉系間質細胞（MSC）の特徴付け。

ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

isolation-characterization-mesenchymal-stromal-cells-from-human

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

46.3K ビュー.  Oakland University. ここで、我々は、ヒト臍帯（UC）および臍帯に胎児胎盤サンプル単離のための（CL）、ウォートンゼリー（WJ）、臍帯胎盤接合（CPJ）、および胎児胎盤（FP）裏地の解剖のためのプロトコルを提示しますそして外植片培養技術を用いて、間葉系間質細胞（MSC）の特徴付け。 

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Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

ヒト間葉系幹細胞の単離および多孔質骨基質上での栽培

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

発生生物学

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

強化された骨形成のためのヒト脂肪由来間質細胞の単離および濃縮

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（MSCs）と血管内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）の単離および動物血清自由膨張

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

生物学

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

ヒト臍帯由来間葉系幹細胞から早産児と正期産児の分離と性状

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage

Exploring the therapeutic potential of mesenchymal stem cells is contingent upon the ease of isolation, potency toward differentiation, and the reliability and robustness of the source. We describe here a stepwise protocol for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord tissue (uMSCs), their immunophenotyping, and the propagation of such cultures over several passages. In this procedure, the viability of the uMSCs is high because there is no enzymatic digestion. Further, the removal of blood vessels, including the umbilical cord arteries and the vein, ensures that there is no contamination of cells of endothelial origin. Using flow cytometry, uMSCs upon isolation are CD45&#8722;CD34&#8722;, indicating an absence of cells from the hematopoietic lineage. Importantly, they express key surface markers, CD105, CD90, and CD73. Upon establishment of cultures, this paper describes an efficient method to induce differentiation in these uMSCs into the skeletal muscle lineage. A detailed analysis of myogenic progression in differentiated uMSCs reveals that uMSCs express Pax7, a marker for myogenic progenitors in the initial stages of differentiation, followed by the expression of MyoD and Myf5, and, finally, a terminal differentiation marker, myosin heavy chain (MyHC).

We describe a protocol for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord tissue and their differentiation into the skeletal muscle lineage.

ヒト臍帯組織からの間葉系幹細胞の生成と骨格筋系統への分化

Exploring the therapeutic potential of mesenchymal stem cells is contingent upon the ease of isolation, potency toward differentiation, and the ...

Isolation and Culture of Three Kinds of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells

Umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) are an important cell source for regenerative medicine. UC-MSCs can be isolated from the umbilical cord Wharton's jelly, as well as from the umbilical arteries and umbilical vein. They are known as perivascular stem cells obtained from umbilical arteries (UCA-PSCs), perivascular stem cells obtained from the umbilical vein (UCV-PSCs), and mesenchymal stem cells obtained from Wharton's jelly (WJ-MSCs). UCA-PSCs and UCV-PSCs are pericytes derived from perivascular regions that are progenitors of MSCs. Isolation and culture of the three kinds of cells is an important source for studying stem cell transplantation and repair. The present protocol focuses on the isolation and culture of cells through mechanical separation, adherent culture, and cell crawling out. Through this technique, the three different types of stem cells can be derived. Cell surface markers were detected by flow cytometry. The stem cells were detected for multilineage differentiation potential by adipogenic, osteogenic, and neural-like differentiation, which is consistent with the phenotype of MSCs. This experimental protocol expands the source of UC-MSCs. In addition, the cell isolation method provides a basis for further study of regenerative medicine and other applications.

The present protocol describes the isolation and culture of mesenchymal stem cells from the umbilical cord arteries, vein, and Wharton's jelly.

Umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) are an important cell source for regenerative medicine. UC-MSCs can be isolated from the umbilical cord ...

ヒト臍帯からのWJ-MSCの解剖と単離

Isolation of Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells with High Yields and Low Damage

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells with remarkable regenerative and immunomodulatory properties. Wharton's jelly (WJ) from the umbilical cord (UC) has gained increasing interest in the biomedical field as an outstanding source of MSCs. However, challenges such as limited supply and lack of standardization in existing methods have arisen. This article presents a novel method for enhancing MSC yield by dissecting intact WJ from the umbilical cord. The method employs blunt dissection to remove the epithelial layer, maintaining the integrity of the entire WJ and resulting in an increased quantity and viability of harvested MSCs. This approach significantly reduces WJ waste compared to conventional sharp dissection methods. To ensure the purity of WJ-MSCs and minimize external cellular influence, a procedure utilizing internal tension to peel off the endothelium after flipping the UC was conducted. Additionally, the Petri dish was inverted for a short time during explant culture to improve attachment and cell outgrowth. Comparative analysis demonstrated the superiority of the proposed method, showing a higher yield of WJ and WJ-MSCs with better viability than traditional methods. The similar morphology and expression pattern of cell surface markers in both methods confirm their characterization and purity for various applications. This method provides a high-yield and high-viability approach for WJ-MSC isolation, demonstrating great potential for the clinical application of MSCs.

著者スポットライト:幹細胞由来血管新生オルガノイドの進歩とウォートンゼリーの最適化された単離によるMSC産生の強化

This study presents a unique blunt dissection procedure to preserve the integrity of Wharton's jelly (WJ), resulting in less damaged WJ and a greater quantity and viability of the harvested mesenchymal stem cells (MSCs). The method demonstrates superior yield and proliferative ability compared to conventional sharp dissection methods.

高収率で低損傷の臍帯由来間葉系幹細胞の単離

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells with remarkable regenerative and immunomodulatory properties. Wharton's jelly (WJ) ...

ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

要約

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ヒト間葉系幹細胞の単離および多孔質骨基質上での栽培

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

強化された骨形成のためのヒト脂肪由来間質細胞の単離および濃縮

単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（MSCs）と血管内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）の単離および動物血清自由膨張

ヒト臍帯由来間葉系幹細胞から早産児と正期産児の分離と性状

ヒト臍帯組織からの間葉系幹細胞の生成と骨格筋系統への分化

Isolation and Culture of Three Kinds of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells

高収率で低損傷の臍帯由来間葉系幹細胞の単離

高収率で低損傷の臍帯由来間葉系幹細胞の単離