This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.

細胞培養のための1.準備<ol><li>ヒト細胞の市販の株式を購入します。 注：このプロトコルは、HCT116結腸直腸癌および初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞（HRPTEC）を利用します。 </li><li> HCT116の培養のための500ミリリットルの媒体を作る：ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/ 7.5％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）を補充した高グルコース培地。 </li><li> HRPTECの培養物を500 mlの培地を加える：5％FBS、1％の上皮細胞成長サプリメント、1％P / Sを補充した上皮細胞培地。 </li><li> 140mMのNaClを、3のKCl、10mMののNa 2 HPO 4、15mMのKH 2 PO 4：1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の500ミリリットルを準備します。 pHを7.4に調整し、121℃で40分間オートクレーブで滅菌します。 </li></ol>細胞培養の2開始<ol><li>慎重トンを乱すことなく、80〜90％のコンフルエント皿から培地を吸引彼は細胞。 </li><li>アリコート培養皿あたり1×PBS 3〜5mlの、静かにコーティングするために皿の表面積を各フラスコを揺らして、慎重に1×PBSを吸引します。第1×PBS洗浄のために繰り返します。 </li><li>各培養皿に小分けし、0.05％トリプシン - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）の3ミリリットルを、穏やかにトリプシンEDTAで均一にコート細胞をに揺すります。 2-3分間37℃でインキュベートします。 </li><li> 90秒間4000×gで15ミリリットルの遠心分離管と遠心分離機に剥がれた細胞を転送します。 </li><li>完全DMEM 1ml中に再懸濁細胞ペレット。 </li><li>血球計数器を用いて細胞数を計測します。 100mMの細胞培養皿は、1cm 2あたり約2,500〜5,000細胞の初期播種密度を達成するために必要とされるどのように多くの非発熱性及びポリスチレン計算します。 </li><li>ステップ30から45分間、37℃の水浴中で1.2または1.3で行われたプレ暖かい完全な細胞培養培地。 </li><li> 70％エタノールを含む培地ボトル細胞バイアルを除染。この点から前方すべて操作は無菌的に行われるべきです。 </li><li>ステップ2.6で述べた播種密度内で凍結細胞のボリューム全体を使用するために必要な限り多くの100mmの細胞培養皿にアリコート完全DMEM 6ミリリットル。 </li><li> 100mm培養皿のそれぞれに、ステップ2.6で算出された細胞懸濁液の量を転送します。均等にプレートの表面上に細胞を分配するために、手動で各プレートを揺らし。 </li><li> 5％CO 2雰囲気中で37℃のインキュベーター内でシードされた100ミリメートル細胞培養皿を置きます。細胞は、次のステップの前に、少なくとも24時間インキュベートすることを許可します。 </li></ol> 3.継代<ol><li>細胞集密度の割合（皿の面積をカバー％細胞）を決定するために、顕微鏡下で各細胞培養皿を表示します。インキュベーターとプリ暖かい完全培地および1×PBSに細胞を返します。細胞は、80から100までパーセントのコンフルエントであれば次のステップに進みます。 </li><li>慎重に乱すことなく、使用済み培地を吸引各培養皿中の細胞。 </li><li>アリコート培養皿あたり1×PBS 3〜5mlの、静かにコーティングするために皿の表面積を各フラスコを揺らして、慎重に1×PBSを吸引します。第1×PBS洗浄のために繰り返します。 </li><li>各培養皿に小分けし、0.05％トリプシン-EDTAの3ミリリットルを、穏やかにトリプシンEDTAで均一にコート細胞をに揺すります。 2-3分間37℃でインキュベートします。 </li><li>このインキュベーションの間に、多くの培養皿にアリコート完全培地10mlを1cm 2あたり2,500〜5,000の細胞の細胞密度を得るために必要とされます。 </li><li>細胞がプレートから剥離したら、すぐに1×定義されたトリプシンインヒビターの3ミリリットルを追加し、穏やかにトリプシンEDTAの全てが中和されていることを確認するために、1分間の皿を旋回。 </li><li>無菌の15mlの遠心管に剥がれた細胞を移し、脇に置きます。残りの細胞を収集し、同じ15ミリリットルの遠心管にそれを転送するために皿にPBS 1×3ミリリットルを追加します。 </li><li> 150 XGを遠心分離して細胞をペレット化5分間。 </li><li>上清を吸引し、完全培地3mlに細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>血球計を用いて細胞を計数し、1cm 2あたり2,500〜5,000の細胞の細胞密度を得るために完全培地15 mlを含むの150mm培養皿に播種。各キャップ結合アッセイのための2つの150ミリメートルを使用してください。 注：液体培地を介して細胞への酸素の拡散は、ボリューム36に依存しています。懸濁液中の接着細胞や細胞を使用するかどうかの実験の間で一貫性のメディアの容量を維持することが推奨されています。メディアが拡散でこれらの変動性を回避するために、（議論で説明したように24時間のワークステーションでインキュベート）予め調節することができます。 </li><li> 5％CO 2雰囲気中で37℃のインキュベーターで播種し、培養皿を置きます。細胞は、次のステップに進む前に、少なくとも24時間インキュベートすることを許可します。 </li></ol> 4. Physioxic露出<ol><li>顕微鏡下で細胞を見ます。 BESのためのトンの結果は、細胞が24時間の暴露70〜80％コンフルエント、48時間の暴露50〜60％コンフルエント、および72時間の暴露40〜50％コンフルエントであることを確認してください。 </li><li>所望の時間（24、48、または実験に応じて72時間）のための低酸素ワークステーションにセルを配置します。 </li><li>適切なphysioxiaにワークステーションを設定します。 注：たとえば、3％O 2設定は、5％のCO 2および92％N 2を伴うことになります。 注：ダイナミックレンジ内の酸素変動が機器内に特定のタイムライン、プログラムのスケジュールを超える希望するか、手動で任意の間隔で酸素の設定を調整している場合。 </li><li> 60％の湿度を設定します。ワークステーションの雰囲気は、それにもかかわらず、非常に乾燥している、とメディアが著しく長い実験（&gt; 48時間）の間に蒸発します。 （メディアは、ワークステーションの雰囲気で平衡化されるように）細胞培養DISのメディアを補充するためにワークステーション内の細胞培養フラスコ内のメディア予約を保ちます彼は。 注：溶存酸素は大気中の酸素36と均衡するような（例えば、PBSおよびトリプシンEDTAなど）、溶解前に細胞と相互作用する任意のソリューションは、低酸素ワークステーション内で使用する前に24時間事前に調整されなければなりません。 </li><li>溶解するまでワークステーション内の細胞を保管してください。 </li></ol>キャップ結合アッセイ5.準備バッファ<ol><li>調製1×トリス緩衝食塩水（TBS）。 <ol><li> dH 2 Oの800ミリリットルで、8.76グラムのNaClおよび6.05グラムトリス塩基を溶解します。 </li><li> 1 M HClを用いて7.4の最終pHに対する解決策をもたらします。 </li><li> dH 2 Oを使用して、1リットルに最終容量を持参</li></ol></li><li>非変性溶解バッファーを準備します。キャップ結合アッセイの日を緩衝溶解準備します。空白のアガロースビーズとγアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズ（7.9および7.13ステップ）を洗浄するために余分な溶解バッファーを作成します。 <ol><li> dH 2 Oの7ミリリットルで、160μlの5 MのNACを追加リットル、160μlの1 Mトリス塩酸pH7.4の、40μlの200mMのNaFを、40μlの1 MのMgCl 2、および40μlの1mMのオルトバナジウム酸ナトリウム。 </li><li> 7ミリリットル溶液にイゲパールの40μLを加えます。それは非常に粘性があるようイゲパルを取得支援するためにピペットの先端をカットします。 </li><li>イゲパルの全てが溶解するまで、ピペッティング、またはボルテックスによって7ミリリットルの溶液を混ぜます。 </li><li> 8ミリリットルの溶液の最終容量を上げ、氷上に保ちます。 </li></ol></li><li> 4xのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-PAGEサンプルバッファーを準備します。 <ol><li>ビーカーに、16ミリリットルの1MのTris-HCl pHが6.8、12.64ミリリットルグリセロール、および8ミリリットルジチオスレイトール（DTT）を組み合わせます。 </li><li> SDSの3.2グラムとブロモフェノールブルーの0.16グラムを追加します。粉末が完全に磁気攪拌棒を混合することにより溶解させます。 </li><li> -20℃で1.5 mlマイクロチューブに小分けし、店舗。 </li></ol></li></ol> 6.細胞溶解<ol><li>非変性溶解緩衝液を準備し、氷の上で目の日を保ちます電子キャップ結合アッセイ。 </li><li>前加温1×PBSと30分間37℃の水浴中でトリプシン。 </li><li>各キャップ結合アッセイ1.5 mlマイクロ遠心チューブに溶解緩衝液のアリコート980μlを行っています。 </li><li>溶解緩衝液980μlに、4-（2-アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩および100Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを10μlの10μLを加えます。氷の上に保管してください。 </li><li>低酸素ワークステーション内の廃棄物容器内の各150ミリメートル皿からメディアを破棄します。 </li><li>暖かい1×PBS 3-4 mlの細胞を洗浄し、液体のすべてを捨てます。 </li><li>各皿に暖かい0.05％トリプシンEDTAの1ミリリットルを加え、2分間、または細胞がもはやプレートに接着されるまで放置します。 </li><li>ピペットを用いて1.5 mlのマイクロ遠心チューブに1プレートの細胞を移します。必要に応じてセルの各プレートが別々の1.5mL微量遠心管に転送されるように繰り返します。 </li><li> 90秒tの6000×gで1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブを遠心O細胞をペレット。 </li><li>ペレットを乱すことなくピペットを用いてトリプシンを吸引します。ペレットを1.5 mlのマイクロ遠心チューブは、90秒間6000×gで再遠心分離、乱された場合。 </li><li>優しくちょうどペレット上記チューブに200μlのPBSをピペットで暖かい1×PBSで細胞を洗浄。再び遠心分離し、ペレットを乱されている場合。 </li><li>ペレットを乱すことなくPBSを吸引します。 </li><li> 1ミリリットルからピペット500μlを最初に携帯ペレットに溶解緩衝液を調製しました。ピペッティングにより完全にペレットを再懸濁。 </li><li>第二の細胞ペレットに再懸濁された細胞を組み合わせて、上下にピペッティングすることにより、第2のペレットを再懸濁。すべてのペレットを合わせ、各サンプルのために再懸濁されるまで、このプロセスを繰り返します。 </li><li> 1.5ミリリットルマイクロチューブに溶解バッファーの残りの500μlの溶解液を兼ね備えています。 </li><li>低酸素ワークステーションからのサンプルを削除します。 注：溶解緩衝液を添加した後、LL以降の工程は、低酸素ワークステーションを37℃に設定し、次のステップは、冷（4℃または氷上で）実行されるべきであるよう、周囲空気中で実施されます。 </li><li>溶解1.5-2時間、4℃でサンプルを回転させることにより、穏やかな攪拌を使用して細胞。 </li><li>細胞破片を除去するために、4℃で15分間12,000×gで溶解した細胞を遠心します。 </li><li>新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにライセートを移し、ペレットを捨てます。 </li><li>将来のウェスタンブロット分析のための全細胞溶解物の入力制御として使用される上清の一部（5~10％）を予約します。 </li></ol> 7.キャップ結合アッセイ<ol><li>各サンプルについて、1.5ミリリットルのマイクロチューブを分離するために、ブランクアガロースビーズ制御スラリー50μlのとγアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズスラリー50μlのを転送します。ビーズスラリーの収集を容易にするために、ピペットの先端を除去するために、はさみを使用してください。 </li><li>ビーズbをペレットyが30秒間500×gでスラリーを遠心分離します。 </li><li>慎重に上清を除去し、TBS500μlのビーズを再懸濁します。 </li><li>繰り返しは、7.2と7.3を繰り返します。 30秒間500×gでビーズをペレット化し、上清を除去します。 </li><li>空白のアガロースビーズを含む1.5 mlマイクロチューブにステップ6.19からの溶解物を含有する上清を移します。 注：空白のアガロースビーズは非特異的にビーズと相互作用する溶解物からタンパク質を除去するためのプレクリアステップとして機能します。 </li><li>穏やかに攪拌しながら4℃で10分間インキュベートします。 </li><li> 30秒間500×gで遠心分離することにより、ブランクのアガロースビーズをペレット化。 </li><li> γアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズを含む1.5 mlのマイクロチューブにライセートを移します。 </li><li> 30秒間500×gで遠心分離し、supernaを廃棄することによりビーズをペレット化し、溶解緩衝液500μlでビーズを再懸濁することにより、ブランクアガロースビーズを洗浄タント。 5回の洗浄の合計のために、この4回繰り返します。 </li><li> 1×SDS-PAGEサンプル緩衝液中でブランクアガロースビーズを再懸濁し、そして95℃で90秒間のビーズを沸騰させます。将来のウェスタンブロット分析のために-20℃で保存は、目的のタンパク質は、ビーズに非特異的に結合するかどうかを観察しました。 </li><li>キャップ結合タンパク質を捕捉するために4℃で1時間穏やかに攪拌しながらγアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズと溶解液をインキュベートします。 </li><li> 30秒間500×gで遠心分離することにより、γアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズをペレット化。上清を捨てます。 </li><li>ステップ7.9を繰り返して、γアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズを洗ってください。 </li><li>溶解緩衝液600μlの中でビーズを再懸濁します。 </li><li> 1mMの最終濃度にGTPを加えます。 </li><li> 4°Cで1時間穏やかに攪拌しながらγアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズ+ 1 mMのGTPをインキュベートします。注：このを非特異的（ すなわち、非メチル化GTPとの相互作用）は、m 7 GTPと相互作用するタンパク質の関連付けを解除します。 </li><li> 30秒間500×gで遠心分離することにより、γアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズをペレット化。 </li><li>新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移し、4×SDS-PAGE試料緩衝液（50mMのトリス-HCl、100mMのDTT、2％SDS、0.1％ブロモフェノールブルー、10％グリセロール）の200μLを加えます。将来のウェスタンブロット分析37のために-20℃でのGTPコントロールサンプルを保管してください。ステップ7.9を繰り返してビーズを洗浄します。 </li><li> 1×SDS-PAGE試料緩衝液（50mMのトリス-HCl、100mMのDTT、2％SDS、0.1％ブロモフェノールブルー、10％グリセロール）中でビーズを再懸濁し、90秒間、95℃で沸騰します。将来のウェスタンブロット分析37のために-20℃でメートル7 GTP結合画分を保管してください。 </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+HIF-1alpha+in+response+to+hypoxia+is+instantaneous.">Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous.</a> FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).</li><li>Newby, D., Marks, L., Lyall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissolved+oxygen+concentration+in+culture+medium:+assumptions+and+pitfalls.">Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls.</a> Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+cap-dependent+translation+by+4E-binding+protein+1:+competition+with+p220+for+binding+to+eukaryotic+initiation+factor-4E.">Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E.</a> EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).</li><li>Pyronnet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+eukaryotic+translation+initiation+factor+4G+(eIF4G)+recruits+mnk1+to+phosphorylate+eIF4E.">Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E.</a> EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).</li><li>Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISG15+modification+of+the+eIF4E+cognate+4EHP+enhances+cap+structure-binding+activity+of+4EHP.">ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP.</a> Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+structure,+mechanism,+and+regulation+of+scavenger+mRNA+decapping+activity.">Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity.</a> Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).</li><li>Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+resins+containing+enzymatically+resistant+mRNA+cap+analogs--a+new+tool+for+the+analysis+of+cap-binding+proteins.">Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins.</a> RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).</li><li>Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mammalian+eIF4E-family+members.">Characterization of mammalian eIF4E-family members.</a> Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

生理的酸素条件に曝露したヒト細胞中でのキャップ結合タンパク質の分析は、新規な酸素調節翻訳開始因子の同定を可能にすることができます。 mRNA又は他のキャップ結合タンパク質の5 &#39;キャップのためのこれらの因子の親和性がm 7 GTP結合アガロースビーズへの関連の強さを測定することができます。この技術の一つの注意点は、それがタンパク質ポスト溶解のキャップ結合能を?...

翻訳制御は、特に細胞ストレス1の期間中に、遺伝子発現の転写調節にも等しく重要なステップとして浮上しています。翻訳制御の焦点は、タンパク質合成の最初のステップは7-メチルに真核生物の開始因子4E（のeIF4E）の結合を伴う開始の律速段階（メートル7 GTP）のmRNA 2の5 &#39;キャップであります。 eIF4EはeIF4A、RNAヘリカーゼ、およびeIF4Gを、他の翻訳因子と40Sは3リボソームの募集に必要な足場タンパク質を含んでeIF4Fという名前の三量体複合体の一部です。正常な生理的条件下では、mRNAの大半はキャップ依存性機構を介して翻訳されていますが、細胞ストレスの期間の下で人間のmRNAの約10％が1,4- intiationキャップ非依存性翻訳される可能性があり5&#39;UTRを含まれています。キャップ依存性翻訳は、歴史的に同義語となっていますOUのeIF4Fで、しかし、eIF4Fのストレス固有のバリエーションが話題に5-8となっています。 様々な細胞ストレスはのeIF4E活性がラパマイシン複合体1（mTORC1）の哺乳類標的を介して抑制させます。このキナーゼは、その目標の一つ、4E結合タンパク質（4E-BP）の活性の増加をもたらすストレス、下損なわれる。非リン酸化4E-BPはのeIF4EとブロックのeIF4Gは、キャップ依存性翻訳9,10の抑制を引き起こすと相互作用する能力に特異的に結合します。興味深いことに、eIF4E2（または4EHP）という名前のeIF4Eのホモログは、おそらく、それがストレス媒介抑制を回避することができ、4E-BP 11のためのはるかに低い親和性を有します。確かに、最初は原因のeIF4G 12との相互作用の欠如への翻訳のリプレッサーとして特徴づけ、eIF4E2は、低酸素ストレス6,13の間にそれらの3 &#39;UTR中のRNAの低酸素応答エレメントを含むmRNAの何百もの翻訳を開始します。この活性化IeIF4G3、RNA結合タンパク質モチーフ4、および低酸素誘導因子、低酸素eIF4F複合体を構成する（HIF）2α、またはeIF4F H 6,13との相互作用を介して達成秒。通常の条件下ではリプレッサーとして、eIF4E2はGIGYF2とZNF598 14と結合します。これらの複合体は、部分的には、アガロース結合M 7 GTPの親和性樹脂を介して同定されました。この古典的な方法15は、翻訳の分野における標準であり、最高の、最も一般的にプルダウンでキャップ結合複合体を単離するための技術を使用し、in vitroでの結合アッセイ16-19です。キャップ依存性翻訳機構の間に変化する部分6-8,13のように柔軟で適応浮上しているように、この方法は急速にストレス応答に関与する新規キャップ結合タンパク質を同定するための強力なツールです。いくつかの真核生物のモデル系は、このようなストレス応答のためeIF4E2ホモログを使用するように見えるようさらに、eIF4Fの変動は、広い意味を持っている可能性がシロイヌナズナ 20として、S.ポンベ 21は 、Dは 22 ショウジョウバエ 、およびCは 23 エレガンス 。 証拠は、eIF4Fの変動がストレス条件に厳密に限定されないが、通常の生理24に関与することを示唆しています。 （微小電極を介して測定）（キャピラリー端で）または組織内の組織への酸素供給は、脳25で2から6パーセントから変化し、肺26内の百分の3から12まで、腸27、4％でで3.5から6パーセント肝臓28、腎臓29内の7から12までパーセント、筋肉30で4％、および骨髄31で6から7パーセント。細胞およびミトコンドリアは、1.3％未満の酸素32を含んでいます 。これらの値は、細胞が日常的に培養される周囲の空気よりも低酸素状態に非常に近いです。これは、どのような以前に低酸素症特異的な細胞過程であると考えられたが、生理的環境の中で関連するかもしれないことを示唆しています。興味深いことに、eIF4FとeIF4F H </suP&gt;積極的に生理学的な酸素または「physioxia」24に露出し、いくつかの異なるヒト細胞株におけるmRNAの異なるプールまたはクラスの翻訳開始に関与します。低酸素はまた、適切な胎児の発育33を駆動し、細胞は、一般physioxia 34においてより高い増殖速度、より長い寿命、より少ないDNA損傷の少ない一般的なストレス応答を持っています。したがって、eIF4F Hは、おそらく生理的条件下で、選択遺伝子の発現の重要な要因です。 ここでは、固定された生理的酸素条件や組織の微小環境の可能性が高い、より代表的であるダイナミック変動範囲内の培養細胞へのプロトコルを提供します。この方法の一つの利点は、細胞が低酸素ワークステーション内に溶解されることです。細胞溶解に低酸素細胞培養物からの遷移は、他のプロトコルで実行される頻度は明らかではありません。細胞は、多くの場合、最初の小さな低酸素培養器から除去されること酸素に対する細胞応答が速いようフォア溶解するが、酸素へのこの暴露は35（1または2分）生化学的経路に影響を与える可能性があります。特定のキャップ結合タンパク質が第2の基地との相互作用を必要とするか、またはメートル7 GTPを加水分解することができ、したがって、いくつかのキャップ相互作用は、精製プロセスにおいて見落とされる可能性があります。アガロース結合酵素耐性キャップ類似体には、このプロトコルで置換されていてもよいです。ここに記載の方法によりeIF4F HとeIF4Fの他のバリエーションの活性および組成を探ることは、細胞が生理的条件やストレス応答の際に利用する複雑な遺伝子発現機械に光を当てるます。

<table><tbody><tr><td>&amp;gamma;-aminophenyl-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP agarose C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;-linked beads</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-1555</td><td>Agarose-linked m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP</td></tr><tr><td>100 mm culture dish</td><td>Corning</td><td>877222</td><td>10-cm culture dish</td></tr><tr><td>150 mm culture dish</td><td>Thermofisher</td><td>130183</td><td>15 cm culture dish</td></tr><tr><td>AEBSF Hydrochloride</td><td>ACROS Organics</td><td>A0356829</td><td>AEBSF</td></tr><tr><td>Agarose Beads</td><td>Jena Bioscience&amp;nbsp;</td><td>AC-0015</td><td>Agarose bead control</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Fisher</td><td>BP112-25</td><td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td></tr><tr><td>1.5 ml Centrifuge Tubes</td><td>FroggaBio</td><td>1210-00S</td><td>Used to centrifuge small volumes</td></tr><tr><td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher</td><td>1495970C</td><td>Used in culturing primary cells</td></tr><tr><td>Defined trypsin inhibitor</td><td>Fisher</td><td>R007100</td><td>DTI</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172-25</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Epithelial cell medium (complete kit)</td><td>ScienCell</td><td>4101</td><td>Includes serum and growth factor supplements)</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td></tr><tr><td>100 mM Guanosine 5&#039;-triphosphate, 1 ml</td><td>Jena Bioscience</td><td>272076-0251M</td><td>GTP</td></tr><tr><td>HCT116 colorectal carcinoma</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td>Human cancer cell line</td></tr><tr><td>Human renal proximal tubular epithelial cells</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-010</td><td>HRPTEC</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/High Glucose</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>Standard media for human cell culture</td></tr><tr><td>Hyclone Penicillin-Streptomycin solution</td><td>GE Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>Antibiotic component of DMEM</td></tr><tr><td>H35 HypOxystation</td><td>Hypoxygen</td><td>N/A</td><td>Hypoxia workstation</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>MP Biomedicals</td><td>2198596</td><td>Detergent component of lysis buffer</td></tr><tr><td>Monopotassium phosphate</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>Fisher</td><td>5299-100</td><td>NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)</td></tr><tr><td>Disodium phosphate</td><td>Fisher</td><td>5369-500</td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Premium Grade Fetal Bovine Serum</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>Cell Signalling</td><td>58715</td><td>Component of lysis buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Fisher</td><td>BP166-100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Sodium Orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>56508</td><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Component of buffers</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>2500-067</td><td>Trypsin used to detach adherent cells</td></tr></tbody></table>

analysis of cap-binding proteins in human cells exposed to physiological oxygen conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

メートル7 GTPアフィニティーカラムでのeIF4EとeIF4E2の酸素に応答したキャップ結合能の解析 Fのigure 1及び結腸直腸癌において、初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞（HRPTEC）（： 図1および2は、2つのヒト細胞株中での酸素の変動に応じて二つの主要なキャップ結合タンパク...

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Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

生理的酸素条件に曝露されたヒト細胞におけるキャップ結合タンパク質の解析

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

analysis-cap-binding-proteins-human-cells-exposed-to-physiological

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

7.7K ビュー.  University of Guelph. Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

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Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

S の酵母酵母の低酸素応答中に時間をかけての mRNA のレベルを測定

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

遺伝学

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal hyperglycemia. As an alternative treatment option to exogenous insulin injection, transplantation of functional pancreatic tissue has been explored1,2. This approach offers the promise of a more natural, long-term restoration of normoglycemia. Protection of the donor tissue from the host's immune system is required to prevent rejection and encapsulation is a method used to help achieve this aim.
Biologically-derived materials, such as alginate3 and agarose4, have been the traditional choice for capsule construction but may induce inflammation or fibrotic overgrowth5 which can impede nutrient and oxygen transport. Alternatively, synthetic poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels are non-degrading, easily functionalized, available at high purity, have controllable pore size, and are extremely biocompatible,6,7,8. As an additional benefit, PEG hydrogels may be formed rapidly in a simple photo-crosslinking reaction that does not require application of non-physiological temperatures6,7. Such a procedure is described here. In the crosslinking reaction, UV degradation of the photoinitiator, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produces free radicals which attack the vinyl carbon-carbon double bonds of dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking at the chain ends. Crosslinking can be achieved within 10 minutes. PEG hydrogels constructed in such a manner have been shown to favorably support cells7,9, and the low photoinitiator concentration and brief exposure to UV irradiation is not detrimental to viability and function of the encapsulated tissue10. While we methacrylate our PEG with the method described below, PEGDM can also be directly purchased from vendors such as Sigma.
An inherent consequence of encapsulation is isolation of the cells from a vascular network. Supply of nutrients, notably oxygen, is therefore reduced and limited by diffusion. This reduced oxygen availability may especially impact &beta;-cells whose insulin secretory function is highly dependent on oxygen11-13. Capsule composition and geometry will also impact diffusion rates and lengths for oxygen. Therefore, we also describe a technique for identifying hypoxic cells within our PEG capsules. Infection of the cells with a recombinant adenovirus allows for a fluorescent signal to be produced when intracellular hypoxia-inducible factor (HIF) pathways are activated14. As HIFs are the primary regulators of the transcriptional response to hypoxia, they represent an ideal target marker for detection of hypoxic signaling15. This approach allows for easy and rapid detection of hypoxic cells. Briefly, the adenovirus has the sequence for a red fluorescent protein (Ds Red DR from Clontech) under the control of a hypoxia-responsive element (HRE) trimer. Stabilization of HIF-1 by low oxygen conditions will drive transcription of the fluorescent protein (Figure 1). Additional details on the construction of this virus have been published previously15. The virus is stored in 10% glycerol at -80&deg; C as many 150 &mu;L aliquots in 1.5 mL centrifuge tubes at a concentration of 3.4 x 1010 pfu/mL. 
Previous studies in our lab have shown that MIN6 cells encapsulated as aggregates maintain their viability throughout 4 weeks of culture in 20% oxygen. MIN6 aggregates cultured at 2 or 1% oxygen showed both signs of necrotic cells (still about 85-90% viable) by staining with ethidium bromide as well as morphological changes relative to cells in 20% oxygen. The smooth spherical shape of the aggregates displayed at 20% was lost and aggregates appeared more like disorganized groups of cells. While the low oxygen stress does not cause a pronounced drop in viability, it is clearly impacting MIN6 aggregation and function as measured by glucose-stimulated insulin secretion15. Western blot analysis of encapsulated cells in 20% and 1% oxygen also showed a significant increase in HIF-1&alpha; for cells cultured in the low oxygen conditions which correlates with the expression of the DsRed DR protein.

A method for photo-encapsulation of cells in a crosslinked PEG hydrogel is described. Hypoxic signaling within encapsulated murine insulinoma (MIN6) aggregates is tracked using a fluorescent marker system. This system allows serial examination of cells within a hydrogel scaffold and correlation of hypoxic signaling with changes in cell phenotype.

カプセル化された細胞凝集体の中で低酸素シグナルの追跡

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

生物工学

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

生化学

安定同位体トレーシングと LC-MS 分析による DHODH および SDH 活性の測定

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

著者スポットライト:哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素に依存しないアッセイ  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, oxidative stress, apoptosis, aging, mitochondrial encephalomyopathies and drug toxicity. Given this, technologies to measure cardiac mitochondrial function are in demand. One technique that employs an integrative approach to measure mitochondrial function is respirometric oxidative phosphorylation (OXPHOS) analysis.
The principle of respirometric OXPHOS assessment is centered around measuring oxygen concentration utilizing a Clark electrode. As the permeabilized fiber bundle consumes oxygen, oxygen concentration in the closed chamber declines. Using selected substrate-inhibitor-uncoupler titration protocols, electrons are provided to specific sites of the electron transport chain, allowing evaluation of mitochondrial function. Prior to respirometric analysis of mitochondrial function, mechanical and chemical preparatory techniques are utilized to permeabilize the sarcolemma of muscle fibers. Chemical permeabilization employs saponin to selectively perforate the cell membrane while maintaining cellular architecture.
This paper thoroughly describes the steps involved in preparing saponin-skinned cardiac fibers for oxygen consumption measurements to evaluate mitochondrial OXPHOS. Additionally, troubleshooting advice as well as specific substrates, inhibitors and uncouplers that may be used to determine mitochondria function at specific sites of the electron transport chain are provided. Importantly, the described protocol may be easily applied to cardiac and skeletal tissue of various animal models and human samples.

Saponin-permeabilized fiber preparation in conjunction with respirometric oxidative phosphorylation analysis provides integrative assessment of mitochondrial function. Mitochondrial respiration in physiological and pathological states can reflect various regulatory influences including mitochondrial interactions, morphology and biochemistry.

サポニン透過性心臓繊維の呼吸計測の酸化的リン酸化の評価

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, ...

生物学

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

浸透哺乳動物の心臓のトランスムラル吸光分光法を用いた細胞代謝モニタリングのための心臓内側発射光カテーテル

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

グリコーゲンの生化学的滴定<em&gt;インビトロ</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

生理的酸素条件に曝露されたヒト細胞におけるキャップ結合タンパク質の解析

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S の酵母酵母の低酸素応答中に時間をかけての mRNA のレベルを測定

カプセル化された細胞凝集体の中で低酸素シグナルの追跡

低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

サポニン透過性心臓繊維の呼吸計測の酸化的リン酸化の評価

浸透哺乳動物の心臓のトランスムラル吸光分光法を用いた細胞代謝モニタリングのための心臓内側発射光カテーテル

グリコーゲンの生化学的滴定

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析