Name: collection of serum- and feeder-free mouse embryonic stem cell-conditioned medium for a cell-free approach
Uploaded: 2017-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
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この研究は、基礎科学研究開発プログラム（2013R1A1A2060930）および医学研究センタープログラム（2015R1A5A2009124）韓国国立研究財団を通じて（NRF）、科学、ICT省が資金を提供し、今後の計画によってサポートされていました。この研究はまた、病気の子供のための病院からの起動オペレーティング・グラント（HK歌唱）でサポートされています。私たちは、G4 MESCラインを提供するために、この原稿博士アンドラーシュナジの編集中にその優れた助けのためのLaura BarwellとサラJSキムに感謝したいと思います。

注：血清及び無フィーダーCM収集プロトコルの概略図を図1に示されています。 1.材料（MEFを、ミディアム、プレート、および溶液の調製） <ol><li>文化のMEFに培地の500ミリリットルを準備します。 10％FBS（ESC品質）、50単位/ mlペニシリン、および50mg / mlストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を補足。 </li><li>確立されたルーチンプロトコル13次胚からのMEFを単離し、MEF培地中で維持します。 </li><li>文化へたmESCを培地500mlを準備します。 DMEM、15％FBSおよび2mMのL-グルタミン、100μMの非必須アミノ酸（NEAA）、100μMのβメルカプトエタノール、100ユニット/ mlの白血病抑制因子（LIF）、50単位/ mlペニシリン、および50が補充されますミリグラム/ mlのストレプトマイシン。 </li><li> 0.1％ゼラチン溶液の5mlを10cmの細胞培養皿をコーティングすることによりゼラチン化プレート（5ゼラチン化プレート/ 1 MESCプレート）を準備します。少なくとも10分間インキュベート<html>室温で。 </li><li>たmESCの無血清条件に減少血清培地の500ミリリットルを準備します。サプリメントは、炭酸水素ナトリウム（pHは7.0）の1.2グラムと血清培地を削減しました。 0.2μmのボトルトップフィルターに通してフィルタリングします。 </li><li>老化関連βガラクトシダーゼ（SAβ-GAL）老化細胞の検出のための染色溶液調製：1mg / mlのX-GALを、40mMのクエン酸/リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）（ジメチルホルムアミド、DMFに溶解） 、5mMのフェリシアン化カリウム、5mMのフェロシアン化カリウム、150mMのNaCl、及び2mMのMgCl 2 14。 注意：（危険）DMFは、有毒で腐食性のソリューションです。ソリューションを取り扱う場合の個人防護服（ 例えば、ニトリルまたはラテックス手袋、白衣、およびゴーグル）を着用してください。ヒュームフードを使用してください。 </li><li>文化ヒト皮膚線維芽細胞（HDFを、NHDF-ADデア・線維芽細胞）への培地500mlを準備します。 10％FBSおよび100単位/ mlのペニシリンおよび100mg / mlストレプトマイシンを含むDMEMを補います。 </li></ol>マウス胚性幹細胞のjove_title &quot;&gt; 2。文化（図1Aおよび2A） 注：細胞培養生物学的安全フード内のすべてのステップを実行します。 <ol><li> 15cmの細胞培養皿にマイトマイシンCを10μg/ mlを含むMEF培地20mlでのMEFを扱います。 37℃で2時間、5％CO 2インキュベートします。 </li><li> MEFからの培地を吸引除去します。 PBSで細胞を3回洗浄します。トリプシンEDTA（TE、1×）の3 mlを加え、37℃で3分間、5％CO 2インキュベートします。 3分後、300×gで3分間MEF培地と遠心分離機の6ミリリットルでTEを中和します。 </li><li> MEF培地5mlで再懸濁。トリパンブルー染色し、血球計数器を用いて得られた細胞懸濁液中の細胞数を決定します。 MEF培地中の10-cmの細胞培養皿あたり2×10 6細胞の密度でプレートに不活性化したMEF（フィーダー）。 37℃で24時間、5％CO 2インキュベートします。 </li><li>上（フィーダをメッキした後、MESC媒体24時間とMEF培地を交換してください翌日）。 </li><li> MESC培地でフィーダー上で2×10 6細胞の密度でプレートたmESC（G4 F1ハイブリッドES細胞）。 37℃で48時間、5％CO 2インキュベートします。 注：MESC-CMのアンチエイジング効果が低い継代数のたmESCは15-17を使用しているときに可能性が強いです。私たちは、ルーネンフェルト・タネンバウム研究所、マウントサイナイ病院、25のオードストリート、トロント、ON、M5T 3H7、カナダで博士アンドラーシュナジからG4 MESCラインを取得しました。 </li><li> 70から80までパーセントサブコンフルエントな状態で比較的高い密度と継代で細胞を保管してください。毎日新鮮なMESC培地で培地を交換してください。 </li></ol> 3.血清の収集とフィーダー馴化培地（図1Bおよび図2B） 注：細胞培養生物学的安全フード内のすべてのステップを実行します。 <ol><li> 5mlのPBSでMESCプレートをすすぎます。 TE（2.5倍）の1ミリリットルを加え、37℃で3分間、5％CO 2インキュベートします。 3分後、MESC mediu 2mlのTEを中和メートルと300×gで3分間遠心操作します。 </li><li> MESC媒体の各ゼラチンコート培養皿（5ゼラチン化プレート/ 1 MESCプレート）にMESC媒体とプレートの5ミリリットル1ミリリットル中に再懸濁。 37℃で培養し、5％CO 2 80〜85までの％の密集度に達します。 </li><li>合計3回の洗浄のために、1回の洗浄あたり10分間細胞（10cmプレートあたり8ミリリットル）をカバーするのに十分なPBSでたmESCを洗ってください。 37℃で24時間、5％CO 2のための低血清培地中でインキュベートします。 注：洗浄工程は、FBSの汚染を防止することが重要です。インキュベーション時間18,19に従うことが重要です。 </li><li> 2500×gで20分間、50ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機にMESC-CMを収集します。遠心分離後の上澄み液（CM）を収集します。 0.2μmのボトルトップフィルターに通してフィルタリングします。 </li></ol>マウス胚の4効果幹細胞馴化培地（MESC-CM） 注：MESC-CMの効果は、次のようないくつかの方法によって検証されましたSAβ-galアッセイ、細胞周期分析、定量RT-PCR。 <ol><li> SAのβ-galアッセイ（図3A） <ol><li> HDF培地で6ウェルプレート中のウェル当たり2×10 4細胞の密度でシードのHDF。 37℃で一晩インキュベートし、5％CO 2。 </li><li>一晩のインキュベーション後、廃棄HDF媒体の半分とはMESC-CMと制御媒体を追加します。 37℃で72時間、5％CO 2インキュベートします。制御媒体がたmESCの非存在下におけるゼラチンコートディッシュで（血清メディア縮小）無血清培地に由来します。 </li><li> 2回の洗浄の合計のために、1回の洗浄につき30秒間細胞（6ウェルプレート当たり2ミリリットル）をカバーするのに十分なPBSで細胞を洗浄。固定のために3.7％パラホルムアルデヒド（PFA）を追加します。室温で5分間インキュベートします。 注意：（危険）パラホルムアルデヒドは有毒で腐食性のソリューションです。ソリューションを取り扱う場合の個人防護服（ 例えば、ニトリルまたはラテックス手袋、白衣、およびゴーグル）を着用してください。ヒュームフードを使用してください。 </li><li>固定液を吸引します。ステップ4.1.3で説明したように、PBSで2回固定した細胞を洗浄。 </li><li> SAβ-gal染色液（1-2 1mlあたり6ウェルプレート中）を追加します。 37℃で17.5時間インキュベートします。 注：これは、CO 2インキュベーター中でインキュベートされるべきではありません。 </li><li> SAβ-gal染色溶液を吸引し、ステップ4.1.3で説明したように、PBSで2回細胞を洗浄します。 </li><li>カウンター染色用エオシンソリューションを追加します。室温で5分間インキュベートします。ステップ4.1.3で説明したように、PBSで2回細胞を洗浄。 </li><li>その後の分析のために取り付けられたデジタルカメラを使用して、光学顕微鏡、キャプチャ画像を用いて100倍の倍率で画像セル。 注：細胞の総数は、ブラインド方法でカウントすることができ、SAのβ-gal陽性の青色細胞の割合を算出することができます。 </li></ol></li><li> 細胞周期分析（図3B） <ol><li>の密度で種子のHDFHDF培地6cmの細胞培養皿中でウェルあたり8×10 4個の細胞。 37℃で一晩インキュベートし、5％CO 2。 </li><li>一晩のインキュベーション後、廃棄HDF媒体の半分とはMESC-CMと制御媒体を追加します。 37℃で24時間、5％CO 2インキュベートします。 </li><li> 3.1で説明したステップとして、細胞をトリプシン処理し、300×gで5分間遠心操作します。冷PBS溶液で細胞を洗浄2500×gで3分間、2回遠心分離（PBS 0.5 mMのCaCl 2を、2％FBS、1.5ミリリットルチューブあたり1ミリリットルで）。冷PBS溶液100μlで再懸濁。 </li><li>ボルテックスしながら冷エタノールを200μlをドロップすることによって細胞を固定。少なくとも1時間、4℃で保管してください。 </li><li>ステップ4.2.3で説明したように、二回の冷PBS溶液で細胞を洗浄。 </li><li> 50μg/ mlのRNアーゼを含有するクエン酸ナトリウム緩衝液250μL（1.12％pH値8.5）に細胞を再懸濁。 37℃で30分間インキュベートします。 </li><li>クエン酸ナトリウム250μlのを追加します。50μg/ mlのヨウ化プロピジウムを含むバッファー。室温で20分間インキュベートします。 </li><li> 20フローサイトメトリーを用いて、各試料中の10,000細胞を測定します。 </li></ol></li><li> 定量RT-PCR（図3C） <ol><li>種子のHDFとステップ4.1.1と4.1.2で説明したように、MESC-CMを追加します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってRNA抽出キットを使用してのHDFからトータルRNAを単離します。分光光度計21を用いて抽出した全RNAを定量化します。 </li><li>製造業者のプロトコール20に従って、オリゴ（dT）プライマーおよびM-MLV逆転写酵素を含む反応混合物の20μlに1μgの全RNAを添加することにより、cDNAを合成。 </li><li>グリーンPCRマスターミックスと特定の遺伝子プライマー（ 補足 表1）を用いて、リアルタイムPCR装置を用いてcDNAの増幅を測定します。 GAPDH発現を用いてデータを正規化します。以下のPCRプロトコルを使用します。最初のデ95℃で10分間naturation。 95℃で15秒間の45サイクル、55℃で20秒間、および72℃で35秒間。 95°C、60°Cで1分間、95℃で30秒間、および60℃15で5秒で15秒間融解曲線ステージ。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Lavasani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-derived+stem/progenitor+cell+dysfunction+limits+healthspan+and+lifespan+in+a+murine+progeria+model.">Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model.</a> Nat Commun. 3, 608 (2012).</li><li>Woo, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+indirect+contribution+of+human+embryonic+stem+cell-derived+hepatocyte-like+cells+to+liver+repair+in+mice.">Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice.</a> Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).</li><li>Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenicity+as+a+clinical+hurdle+for+pluripotent+stem+cell+therapies.">Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies.</a> Nat Med. 19, 998-1004 (2013).</li><li>Moon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+treating+ischemic+disease+using+human+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells+without+direct+incorporation.">A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation.</a> Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).</li><li>Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+angiogenesis+for+critical+limb+ischemia:+microvascular+therapies+coming+of+age.">Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age.</a> Circulation. 118, 9-16 (2008).</li><li>Lazarous, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+in+patients+with+intermittent+claudication:+results+of+a+phase+I+trial.">Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial.</a> J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).</li><li>Adams, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+and+hurting:+molecular+mechanisms,+functions,+and+pathologies+of+cellular+senescence.">Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence.</a> Mol Cell. 36, 2-14 (2009).</li><li>Harrison, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+fed+late+in+life+extends+lifespan+in+genetically+heterogeneous+mice.">Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice.</a> Nature. 460, 392-395 (2009).</li><li>Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+sirtuins+viable+targets+for+improving+healthspan+and+lifespan.">Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan.</a> Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).</li><li>Martin-Montalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+improves+healthspan+and+lifespan+in+mice.">Metformin improves healthspan and lifespan in mice.</a> Nat Commun. 4, 2192 (2013).</li><li>Loffredo, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+differentiation+factor+11+is+a+circulating+factor+that+reverses+age-related+cardiac+hypertrophy.">Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy.</a> Cell. 153, 828-839 (2013).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li><li>Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisenescence+effect+of+mouse+embryonic+stem+cell+conditioned+medium+through+a+PDGF/FGF+pathway.">Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway.</a> FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).</li><li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+number+affects+the+pluripotency+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+judged+by+tetraploid+embryo+aggregation.">Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation.</a> Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).</li><li>Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+protein+enrichment+and+analysis:+an+optimized+approach+applied+on+cancer+cell+lines+using+2D+LC-MS/MS.">Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS.</a> J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).</li><li>Makridakis, M., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretome+proteomics+for+discovery+of+cancer+biomarkers.">Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers.</a> J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).</li><li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+replicative+senescence+by+insulin-like+growth+factor-binding+protein+3+in+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells.</a> Aging Cell. 6, 535-545 (2007).</li><li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cellular+senescence+by+insulin-like+growth+factor+binding+protein-5+through+a+p53-dependent+mechanism.">Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism.</a> Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).</li><li>Eiselleova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells.">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

血清および無フィーダーMESC-CMの成功収集のために、以下の提案を考慮に入れなければなりません。最も重要な要因は、MESC-CMを収集するための初期継代たmESCを使用しています。以前は、初期継代MESC-CMは、後期継代たmESCと比較して、より良好なアンチエイジング効果を有することが示されています。たmESCの継代数は、それらの発生能16及び多能17に影響を与えることが報告されています。 さらなる研究は、抗老化作用を誘導するMESCのsecretome、特定の要因を分析するために必要とされているが、我々は、現在MESC-CMは、細胞レベルで老化を減少させるのに十分であると結論付けることができます。 若い細胞に戻って老化細胞を元に戻すMESC固有の分泌因子の同定は今後の研究のために重要となります。高品質は、このような抗体アレイ15のような分泌分子、上の分析についてD secretome分析、メディア収集プロセス（ステップ3）の間に洗浄工程が非常に重要です。洗浄工程が適切に行われていない場合は、分泌分子は、血清（FBS）コンポーネント18,19によって汚染されます。 （24時間以上）より長いインキュベーション時間は、血清の下で飢餓によって細胞の自己分解またはアポトーシスの可能性を増大させることができるように血清および無フィーダー培養時間（24時間）は、培地収集プロセス（ステップ3）で非常に重要です-と枯渇条件18,19を feeder-。フィーダは、分子22の多くを分泌するように、通常のESCの培養条件は、未分化細胞の長期培養のためのフィーダー層を必要とします。ゼラチン被覆プレートは、フィーダー細胞からの汚染の可能性を防止します。 血清および無フィーダー培養条件から収穫MESC-CMは、老化のHDFにおける抗老化能力を持っています。 mESC-の抗老化効果CMは、SAβ-gal活性などの老化関連の複数の読み出しによって実証されています。強化された増殖能（細胞周期分析）。およびp53、P21、P16、及びIL-6の遺伝子発現レベル（ - 3C 図3A）を減少させました。 ヒト初代細胞はMESC-CMで処理される場合、異種汚染が臨床応用のための重要な課題であろう。したがって、ヒトESCまたはiPS細胞から分泌因子の調査は、人間の起源由来のCMの臨床応用のための重要な今後の研究であろう。幹細胞と抗老化研究に基づいて、無細胞アプローチの収束が治療法上の改善に大きな洞察が得られ、老化関連疾患の現在の理解を拡大することが期待されます。

このプロトコルの目的は、血清および無フィーダー培養条件から培地（MESC-CM）を-conditionedし、その生物学的機能を特徴づけるために、マウス胚性幹細胞（MESC）を収集することです。 一般的には、胚性幹細胞（ESCは）による自己再生1-3のための彼らの多能性と能力に再生医療や細胞治療のための大きな可能性を持っています。しかし、幹細胞の直接移植は、免疫拒絶および腫瘍形成4,5のようないくつかの制限を有します。従って、無細胞アプローチは、再生医療や老化介入6,7の代替治療戦略を提供することができます。 老化は、増殖停止、改変された細胞生理学、および行動の永続的な状態によって特徴付けられる組織や臓器の老化に対する細胞相手と見られています。老化、癌、心臓血管疾患、Tなどの流行病のための主要な危険因子であります2型糖尿病、および神経変性8を YPE。老化の明らかな特徴の一つは、幹細胞の老化や枯渇9によって引き起こされる組織の再生能力の低下、です。多くの重要な研究は、このような一貫して老化を遅らせ、寿命を延長する能力を持っているラパマイシン9、レスベラトロール10、およびメトホルミン11、および血液媒介全身の要因、すなわちGDF11 12、薬理学的分子を、示しています。 本研究では、MESC-CMは、血清因子とのMEFからの分泌因子の混入を排除するために、血清（ウシ胎児血清、FBS）およびフィーダー（マウス胚線維芽細胞、MEFの）層なしで収穫されています。これらの条件は、結果的にMESC固有の分泌因子の正確な同定を可能に血清および無フィーダーCMを可能にしました。 この提案されたプロトコルは、非常に効率的で比較的費用対効果、および容易動作します。この技術は、老化関連疾患及びその他の再生のための介入に向かって安全かつ潜在的に有利な無細胞治療アプローチの開発のために使用することができる抗老化効果を媒介することができるMESC由来の可溶性因子の特性への洞察を提供しますトリートメント。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>#11960-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>#30044333</td><td>20%, ES cell quality</td></tr><tr><td>Penicillin and streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>#15140</td><td>50 units/ml penicillin and 50&amp;nbsp;mg/ml streptomycin</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>#25030</td><td>2&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Nonessential amino acids (NEAA)</td><td>Invitrogen</td><td>#11140</td><td>100&amp;nbsp;&amp;micro;M</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M3148</td><td>100&amp;nbsp;&amp;micro;M</td></tr><tr><td>Leukemia inhibitory factor&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>#ESG1107</td><td>100 units/ml</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>#22600</td><td></td></tr><tr><td>X-gal&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#B4252</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>3.70%</td></tr><tr><td>Dimethylformamide (DMF)</td><td>Sigma</td><td>#D4551</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide</td><td>Aldrich</td><td>#455946</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>potassium ferrocyanide</td><td>Aldrich</td><td>#455989</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>#S7653</td><td>150 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>#M2393</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Sigma</td><td>#M4287</td><td>10&amp;nbsp;&amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Propidium iodide&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#P4170</td><td>50&amp;nbsp;&amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion</td><td>#15596018</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV reverse transcript-tase</td><td>Promega</td><td>#M170B</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR master mix&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>#4367659</td><td></td></tr><tr><td>HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast&amp;nbsp;</td><td>LONZA</td><td>#CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>Bottle top filter</td><td>Corning</td><td>#430513</td><td>0.2 &amp;mu;m</td></tr></tbody></table>

collection of serum- and feeder-free mouse embryonic stem cell-conditioned medium for a cell-free approach

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.

もともと、たmESCは、FBSおよび他のサプリメント（ 図1Aおよび2A）とのMESC培地中のMEFフィーダー上で維持されています。 CMは、フィーダー層、FBSまたは他のサプリメント（ 図1Bおよび2B）なし低血清培地におけるたmESCから収集しました。この培養条件は、潜在的なフィーダからの要因による汚染、FBS、または他のサプリメントなしMESC-特定の条件培地を収集することを可能にします。制御媒体たmESCことなく、同一の培養条件下で回収しました。 ⅰ）通常のMESC培養条件（ 図2A）およびii）血清および無フィーダー培養条件（ 図2B）：たmESCは、2つの培養媒体間の異なる形態を示します。 MESCコロニーは、MEF層上に成長し、通常のMESC文化cの下の楕円形で光沢のある外観を示しましたonditions（ 図2A）。逆に、血清および無フィーダー培養条件のたmESCは偏平で不規則な形態（ 図2B）を示しました。 MESC-CMの機能的特徴付けは、SAβ-galアッセイ（ 図3A）、細胞周期解析（ 図3B）、および定量PCR（ 図3C）などの老化に関連する方法によって達成されました。 MESC-CMと老化のHDFの治療は、細胞老化（ 図3A）の指標である正のSAのβ-gal陽性細胞の数を、減少しました。細胞周期分析は、G 0 / G 1期（ 図3B）内のセルの数を減少させ、一方MESC-CM処理が劇的に、S中の細胞の数を増加し、G 2 / M期ことを明らかにしました。また、MESC-CM処理をn（老化関連遺伝子の発現レベルの減少しましたamely、p53の、P21、およびP16）及び老化関連分泌表現型（SASP）の発現レベル（IL-6）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55035/55035fig1.jpg" /> 図1：MESC-CMの調製と最適化。無血清および無フィーダーCMの準備と最適化のための実験的な戦略。 （A）通常MESCの培養条件および（B）血清および無フィーダーMESC-CMの培養条件。 C：FBSおよびMEFなしのコントロール培地; CM：FBSおよびMEFなしの馴化培地。ペらの許可を得て修正されました。 15。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55035/55035fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55035/55035fig2.jpg" /> 図2：明視野イムたmESCの年齢。 （A）通常の条件および（B）血清およびフィーダーなしの条件下でたmESC。黄色の矢印は、通常のMESC培養条件におけるフィーダー細胞（MEFの）を示します。スケールバー=100μmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55035/55035fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55035/55035fig3.jpg" /> 図3：MESC-CMのアンチエイジング効果のキャラクタリゼーション。 （A）SAβ-gal活性染色およびSAのβ-gal陽性細胞の割合。フローサイトメトリーによる（B）細胞周期分析。 （C）のqRT-PCRによる老化関連遺伝子の発現レベル（p53の、P21、及びP16）及び老化関連分泌表現型（SASP）の発現レベル（IL-6）の発現レベル。値は平均±SDであります。数値は3回の独立した実験の代表です。群間の統計的有意差は一方向ANOVAおよびTukeyの事後検定によって同定しました。 * P &lt;0.05、** P &lt;0.01。 Y =非老化細胞; S：老化細胞; C：FBSおよびMEFなしのコントロール培地; CM：FBSおよびMEFなしの馴化培地。スケールバー=10μmです。ペらの許可を得て修正されました。 15。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55035/55035fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

このプロトコルは、マウス胚性幹細胞（MESC）を収集するための方法を提供するメディア-conditioned（MESC-CM）血清（ウシ胎児血清、FBS）に由来する - とフィーダー細胞のための（マウス胚線維芽細胞、MEFの）フリー条件フリーアプローチ。これは、老化や老化関連疾患の治療のために適用することができます。

血清やフィーダーフリーのマウス胚のコレクションは、無細胞アプローチのための細胞馴化培地を幹

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

collection-serum-feeder-free-mouse-embryonic-stem-cell-conditioned

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.2K ビュー.  Yeungnam University. このプロトコルは、マウス胚性幹細胞（MESC）を収集するための方法を提供するメディア-conditioned（MESC-CM）血清（ウシ胎児血清、FBS）に由来する - とフィーダー細胞のための（マウス胚線維芽細胞、MEFの）フリー条件フリーアプローチ。これは、老化や老化関連疾患の治療のために適用することができます。 

ビデオ: Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

発生生物学

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

リコンビナーゼ媒介カセット交換を用いて、マウス胚性幹細胞における構造と機能の研究

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

マウス着床前胚幹細胞の誘導

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, epigenetic regulators, and post-translation modifications of histones that combinatorially influence the gene expression state of nearby genes. RNA has also been shown to interact with various proteins to regulate chromatin dynamics&#160;and gene expression. Chromatin-associated RNA immunoprecipitation (CARIP) followed by next-generation sequencing (CARIP-Seq) is a novel method to survey RNAs associated with chromatin proteins, while chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP-Seq) is a powerful genomics technique to map the location of post-translational modification of histones, transcription factors, and epigenetic modifiers on a global-scale in ES cells. Here, we describe methods to perform CARIP-Seq and ChIP-Seq, including library construction for next-generation sequencing, to generate global chromatin-associated RNA and epigenomic maps in ES cells.

Here, we describe methods to perform ChIP-Seq and CARIP-Seq, including library preparation for next-generation sequencing, to generate global epigenomic and chromatin-associated RNA maps in ES cells.

CARIP Seq とチップ Seq: クロマチン結合 Rna および胚性幹細胞における蛋白質 DNA 相互作用を識別する方法

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

T細胞の導出<em&gt;体外</em&gt;マウス胚性幹細胞からの

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

免疫・感染学

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

マウス胚性幹細胞の皮質介在ニューロン前駆細胞への分化

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

神経科学

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

培養ヒト胚および誘導多能性幹細胞に適したマウス胚性線維芽細胞の調製

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

生物学

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

無血清全胚培養系で、マウス胚発生

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Generating Cortical Interneuron Precursors From Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Tischfield, D. J., et al <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56358">Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video presents a method for generating cortical interneuron precursors from mouse embryonic stem cells. The protocol entails culturing the stem cells in media containing specific small molecule inhibitors, which facilitate stem cell proliferation and aggregation into embryoid bodies (EBs). Subsequently, the EBs are dissociated with enzymes and plated on culture plate wells coated with adhesion proteins to promote their differentiation into cortical interneuron precursors.

マウス胚性幹細胞からの皮質介在ニューロン前駆体の生成

1. Media Preparation
NOTE: Warm all media to 37 &#38;#176;C before use in cell culture.

	Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) media (for preparing 500 mL)
	
	...

JoVE Encyclopedia of Experiments

神経細胞培養技術

高度な神経細胞モデル

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

マウス胚性幹細胞から神経前駆細胞を作製する技術

1. Mouse embryonic stem cell culture

	Prepare 0.1% gelatin coated cell culture dishes or plates.
	
		Add 2 mL of sterilized 0.1% gelatin (0.1% w/v in ...