Name: design and implementation of an automated illuminating, culturing, and sampling system for microbial optogenetic applications
Uploaded: 2017-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
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私たちは便利な議論や編集のためのプロトコル、キーラン・スウィーニーをテストする際に支援するためのモリーラザルとベロニカ・デルガドに感謝して、原稿の重要な読書のためのテイラー・スコット、私のアン・adirekkun、およびステファニーゲラーだろう。ミーガンニコールMcClean氏、博士バローズウェルカム基金からの科学的なインターフェイスでのキャリア賞を保持しています。

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著者らは、開示することは何もありません。

私たちは心の中で柔軟にこの装置を設計しました。使用されるすべてのコードはフリーでオープンソースです。セグメント細胞へのデフォルトの画像解析処理が簡単で、すぐに実行されます。カスタム解析は、フィジーグラフィック・ユーザ・インタフェースを代表画像を解析BeanShellのスクリプトに入力を変換し、その後、スクリプトを呼び出すためのプラグインを設定する際に、ユーザ入力を記録することによって実現することができます。それが呼び出されると、このスクリプトは、バックグラウンドを差し引いた画像の最新のセットにファイルパスを含む「画像」と呼ばれる文字列配列を送信されます。実験が突然終了した場合、それらが失われないように、それらが収集される画像やデータが保存されます。青色LEDアレイは、我々の光遺伝学系を誘導するために選択されたが、それは、異なる色のLEDに置き換えることができます。それは簡単にPCB上の追加のMOSFETスイッチとリレースイッチ用のマイクロコントローラ上だけでなく、スルーホール利用可能な追加の入力ピンと出力ピンがあります。このシステムのために、より複雑な目的のために適合されます。例えば、LEDに電力を供給し、培養容器に縛り付け光センサーから値を読み、その後、濁度を測定するためのソフトウェアを変更し、それに応じて容器を希釈するために、マイクロコントローラ上で追加のピンを使用し、タービとして動作し、この装置を作るために。 ケアは、敏感な顕微鏡装置を保護するために、流体の流量が一貫していることを確認するために、文化が汚染されないように注意する必要があります。培養容器は、意図的に接種されたときに前の汚染は、容器に接種し、内部には成長がないことを確認する前に数日を待つことによって検出することができます。顕微鏡対物レンズで細胞培養をこぼす回避するために、マイクロ流体デバイスは、吸収性の布の上にそれを介して第1ポンピング細胞培養によって漏れないことを確認してください。培養容器に培地の流れが不整合である場合、それは通常、チューブの周りため蠕動ポンプのローラが緩すぎるとなっています。水槽ポンプからの空気の流れが矛盾している場合、液体はプールと一貫性のない空気の流れに抵抗することが排水管にはU字型の曲がりがないことを確認してください。メディアはそれの内側まで乾燥しているため、チューブは実験後に詰まった場合は、目詰まりを溶解するために湯浴中で詰まったチューブを浸します。 実験の計画や結果を分析する際に考慮すべきこのプロトコルに固有の制限があります。希釈率と使用するチューブの長さに応じて、細胞培養物を顕微鏡に培養容器からポンプ輸送される間の約10分の遅れがあります。したがって、十分に短い時間スケールにわたって発生研究のイベントに適していません。実験は、メディアの容量によってのみ制限され、約10日間連続して実行することができますしながら、また、細胞培養の進化は、実験が増加する期間として考慮されなければなりません。リミメディアのティン栄養素、代謝および遺伝子発現35、36、37、38、39に重大な影響を有し、したがって、研究対象の生理学の局面に基づいて決定されるべきです。結果を分析すると、画像、特に辺境のデータから画像のROIを画像解析ルーチンによって同定されたような方法でエラーを検討する点が、必要があります。気泡やアーチファクトが細胞について誤解することにより測定された蛍光をゆがめることが可能です。このような誤測定を排除するための簡単な方法の1つは、自家蛍光強度以下の蛍光強度を持つすべてのROIを破棄することです。 このプロトコルは、セット連続培養で増殖することができる生物で光に応答して蛍光強度および/または廃液細胞培養の細胞形態を測定するために有用であろう攪拌しない一貫性のある焦点面にTLE、及び自動画像分析アルゴリズムによって同定すること。ここで使用されるデフォルトのセル識別アルゴリズムは、出芽酵母似ているほぼ球形の微生物に最も直接的に適用されます。このプロトコルの一代替手段40は、バッチ培養のセットで微生物を成長し、各時点について一括をサンプリングし、フローサイトメトリーによってサンプルを特徴付けることです。しかしながら、ここで説明されたプロトコルの利点は、同じ培養物から採取されたサンプルは、多くのサンプルを採取することができ、プロセスが自動化されることです。このプロトコルはまた、光遺伝学酵母が継続的に培養し、蛍光によって関心領域の識別をバイアスすぐにではなく、複数の画像を取得することにより、顕微鏡34の下で撮像されたされた同様の方法を改善します。このプロトコルの大きな利点は、個々の細胞の多くの測定が定期的にwitho数日間にわたって取得することができることですUTのユーザー入力。露光に微生物培養物の応答を測定した後、次のステップは、応答のシリコ閉ループ制御で実装することができます。

光遺伝学システムは、遺伝子発現、1、2、3、4、5タンパク質の局在化、6タンパク質活性、6、7、8タンパク質結合、8、9、10、およびタンパク質分解を含む細胞プロセスの成長のリストを制御するために光を使用します。プログラムされた光刺激と制御された環境で細胞を培養するため、および生物学的に関連するタイムスケールの上にそれらの応答を測定するための11の方法は、細胞生物学、バイオテクノロジーの研究のためにこれらのツールの可能性を利用することが必要です。我々の方法は、AE、よく混合した一定の細胞増殖速度を維持するためにchemostasisを利用します評価、及びプログラムされた照明に曝される温度制御されたガラス製の培養容器12、13。倒立顕微鏡で培養排水中の我々の画像の個々の細胞は、プログラムされた照明への文化の応答を測定します。流出液の細胞培養の蛍光強度および細胞形態は、ユーザ入力なしに複数日にわたって測定することができるように培養、サンプリング、画像化、および画像解析は完全に自動化されています。 このプロトコルは、増殖する細胞培養及び顕微鏡精通ほとんどの研究室で実施することができ、使用される装置は、安価で容易に入手可能なコンポーネントで構成されています。透明な培養容器は、光の1μW/ cm 2の範囲では-10 mW / cm 2で発光可能な発光ダイオード（LED）のマトリックス上に配置されています。微生物を連続培養容器で増殖させます。 1蠕動ポンプがでメディアを追加するために使用されます希釈率は、他の顕微鏡に小さい速度で培養物を回収するために使用され、その差は、オーバーフロー出口を通って逃げます。加熱パッドは、温度を維持しています。空気が継続的に正の圧力を維持するだけでなく、ミックスと文化を通気するために培養容器内に圧送されます。空気ポンプを除き、これらのデバイスへの電力はまた、温度計と接続されたデスクトップコンピュータからの入力を受け取るマイクロコントローラによって調節されます。流出液の細胞培養物を倒立顕微鏡のステージ上のマイクロ流体デバイスに圧送されます。非蛍光及び蛍光画像を自動的に取得されます。画像中の細胞は、関心領域（ROI）のように各セルを検索し、各ROIの特性を測定するアルゴリズムを特徴とします。 このプロトコルの適用を実証するために、我々は、青色光responsiで操作サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞の変化する光強度に対する応答を測定し蛍光タンパク質の転写を制御する光遺伝学システムまし。このシステムにおいて遺伝子発現を制御するための複数の光遺伝学系はすでに14、15、16が存在するため、一般的パン酵母としても知られているS.セレビシエは 、選択されました。さらに、このモデル生物は、一般にシステム生物学17およびバイオテクノロジーアプリケーション18、19、20のための筐体としての研究のために使用されます。私たちの代表的な結果は、このプロトコルは、入力光強度を変化させると、蛍光レポーターの産生を測定することによって、複数日間の培養の転写を制御するために使用することができることを示しています。

<table><tbody><tr><td>Extensive lab manual</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>An extensive, regularly updated lab manual is available in the &amp;ldquo;Optogenetic Chemostat Files&amp;rdquo; GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results.</td></tr><tr><td>Fritzing Design Viewer</td><td>Fritzing</td><td>NA</td><td>The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at &quot;http://fritzing.org/download/&quot;</td></tr><tr><td>Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled)</td><td>Adafruit</td><td>50</td><td>Microcontroller. 1 required.</td></tr><tr><td>Arduino Stackable Header Kit</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10007</td><td>Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required.</td></tr><tr><td>Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V</td><td>Adafruit</td><td>180</td><td>For making electrical connections to the PCB. 1 required.</td></tr><tr><td>Soldering iron stand</td><td>Adafruit</td><td>150</td><td>For making electrical connections to the PCB. 1 required.</td></tr><tr><td>Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031&quot; diameter - 100g</td><td>Adafruit</td><td>145</td><td>For making electrical connections to the PCB. 1 required.</td></tr><tr><td>0.1 &amp;mu;F capacitor</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-08375</td><td>Stabilizes voltage in PCB. 1 required.</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;F capacitor</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-00523</td><td>Stabilizes voltage in PCB. 1 required.</td></tr><tr><td>MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219</td><td>Maxim</td><td>MAX7219CNG</td><td>LED driver. 1 required.</td></tr><tr><td>8 pin IC Socket</td><td>Mouser Electronics</td><td>575-144308</td><td>16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix.</td></tr><tr><td>24 Pin IC socket</td><td>Mouser Electronics</td><td>535-24-3518-10</td><td>Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB.</td></tr><tr><td>Digital multimeter</td><td>Adafruit</td><td>2034</td><td>For troubleshooting electronics. 1 required.</td></tr><tr><td>Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1&quot;)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT-12693</td><td>Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Flush diagonal wire cutters</td><td>Adafruit</td><td>152</td><td>For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required.</td></tr><tr><td>Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12&quot; (300mm)</td><td>Adafruit</td><td>793</td><td>Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required.</td></tr><tr><td>Half-size breadboard</td><td>Adafruit</td><td>64</td><td>The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it.</td></tr><tr><td>Miniature 8x8 Blue LED Matrix</td><td>Adafruit</td><td>956</td><td>Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white.</td></tr><tr><td>Stackable header-3 pin</td><td>SparkFun Electronics</td><td>13875</td><td>8 required.</td></tr><tr><td>Resistor Kit - 1/4W (500 total)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10969</td><td>For electronics. 1 required.</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;IRL520N MOSFET</td><td>International Rectifier</td><td>IRL520N</td><td>Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required.</td></tr><tr><td>Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT 11367</td><td>Wire for electronics. 1 required.</td></tr><tr><td>5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed</td><td>Adafruit</td><td>276</td><td>Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required.</td></tr><tr><td>12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed</td><td>Adafruit</td><td>798</td><td>For peristaltic pumps. 2 required.</td></tr><tr><td>Electric Heating Pad - 10cm x 5cm</td><td>Adafruit</td><td>1481</td><td>For heating the bioreactor. 1 required.</td></tr><tr><td>Low flow variable flow peristaltic pump</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td>For pumping media. 1 required</td></tr><tr><td>Medium flow variable flow peristaltic pump</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td>For pumping culture. 1 required.</td></tr><tr><td>9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed</td><td>Adafruit</td><td>63</td><td>For microcontroller power supply. Order 1.</td></tr><tr><td>High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras</td><td>Adafruit</td><td>642</td><td>Thermometer for the bioreactor. 1 required.</td></tr><tr><td>Micromanager</td><td>Micromanager</td><td>NA</td><td>The free, open-sourced microscope control software is available at &quot;https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release&quot;</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td>NA</td><td>The free, open-sourced image analysis software is available at &quot;http://fiji.sc/&quot;</td></tr><tr><td>Arduino Integrated Development Environment</td><td>Arduino</td><td>NA</td><td>The free, open-sourced IDE is available at &quot;https://www.arduino.cc/en/Main/Software&quot;</td></tr><tr><td>Custom code</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>The custom microcontroller code and &quot;Bioreactor Controller&quot; plugin are available in the &amp;ldquo;Optogenetic Chemostat Files&amp;rdquo; GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>USB Cable A to B - 6 Foot</td><td>SparkFun Electronics</td><td>CAB-00512</td><td>Used to download data to microcontroller. 1 required.</td></tr><tr><td>bioreactorTimecourse_example.csv</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the &amp;ldquo;Optogenetic Chemostat Files&amp;rdquo; GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>Tota-frost gels (diffusion paper)</td><td>B&amp;amp;H</td><td>B&amp;amp;H # LOFSFTL&lt;br/&gt; MFR # T1-72</td><td>For LED matrix. 1 required.</td></tr><tr><td>Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in</td><td>Grainger, inc</td><td>20JL37</td><td>Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required.</td></tr><tr><td>Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>S120VC</td><td>For measuring light intensity. 1 required.</td></tr><tr><td>Labelling Tape</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015N</td><td>For labelling and securing loose components. 1 required.</td></tr><tr><td>Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4&quot; LCD</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>For measuring light intensity. 1 required.</td></tr><tr><td>100mL GL45 hybridization glass bottle</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>(7910-40150)</td><td>Bioreactor vessel. 1 required.</td></tr><tr><td>Six port assembly</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>Custom&amp;nbsp;</td><td>For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125&quot; OD x .055&quot;ID. Port A: 1.0&quot; long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0&quot; long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0&quot; long above cap slug, 65 mm&amp;nbsp; long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3</td><td>Amazon</td><td>B0009F3P3U</td><td>Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame.</td></tr><tr><td>1/16&quot; ID x 3/16&quot; OD x 1/16&quot; Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing</td><td>United States Plastic Corp.</td><td>57288</td><td>Tubing. ~25&#039; required.</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-62992-32</td><td>Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required.</td></tr><tr><td>2L Laboratory Flask</td><td>Pyrex</td><td>4980</td><td>Media flask and effluent flask. 2 required.</td></tr><tr><td>Day pinchcock</td><td>Fisher Scientific</td><td>5867</td><td>For pinching tubes shut. 3 required.</td></tr><tr><td>Replacement tubing assembly 1/16&quot; ID</td><td>Traceable Products</td><td>3372</td><td>The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.</td></tr><tr><td>Replacement tubing assembly 1/50&quot; ID</td><td>Traceable Products</td><td>3371</td><td>The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.</td></tr><tr><td>Male luer with lock ring x 1/16&quot; hose barb, Nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-00</td><td>Connectors. ~10 luers are required.</td></tr><tr><td>Male luer with lock ring x 1/8&quot; hose barb, Nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-04</td><td>Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing.</td></tr><tr><td>Female luer x 1/16&quot; hose barb adapter, Nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-00</td><td>Connectors. ~10 luers required.</td></tr><tr><td>Female luer x 3/16&quot; hose barb adapter</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-08</td><td>Connectors. ~10 luers required.</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>SC-45502-28</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-56</td><td></td></tr><tr><td>Microbore PTFE Tubing, 0.022&quot;ID x 0.042&quot;OD, 100 ft/roll</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06417-21</td><td>Tubing. 1 roll required.</td></tr><tr><td>Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-13</td><td>Tubing. ~25&#039; required.</td></tr><tr><td>3/16&quot; ID x 1/4&quot; OD x 1/32&quot; Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing</td><td>United States Plastic Corp.</td><td>57293</td><td>Tubing. ~1&#039; required.</td></tr><tr><td>Vacuum filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>974107</td><td>Nalgene vacuum filter for sterile filtering media.</td></tr><tr><td>Aquel Oxy-Boost 200</td><td>Rena Aquatic Supply</td><td>AP200</td><td>Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m pore syringe filter</td><td>Corning International</td><td>431229</td><td>This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required.</td></tr><tr><td>Slygard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td>For microfluidic device. 1 required.</td></tr><tr><td>American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>17989000</td><td>For cutting tubes and PDMS. 1 blade required.</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHAWB100028 ALDRICH</td><td>For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required.</td></tr><tr><td>Microscope cover glass 22x60-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>For microfluidic device. 1 required.</td></tr><tr><td>Rectangular aluminum frame with a square window</td><td>Custom</td><td>Custom</td><td>To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches.&lt;br/&gt; Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches&lt;br/&gt; Thickness: ~1/32 inches</td></tr></tbody></table>

design and implementation of an automated illuminating, culturing, and sampling system for microbial optogenetic applications

光遺伝学システムは、細胞プロセスを変更するために特定の波長の光に反応して立体構造を変更遺伝的にコードされたタンパク質を利用します。光遺伝学システムのプログラムされた照明および刺激を組み込んだシステムを培養し、測定が必要です。我々が構築した光のプログラムされた用量で微生物細胞を照射し、自動的に取得し、流出液中の細胞の画像を分析するために、連続培養装置を使用するためのプロトコルを提示します。ケモスタット、この装置の動作は、増殖速度と細胞環境を厳密に制御することを可能にします。連続的な細胞培養の流出物は定期的にサンプリングし、細胞をマルチチャンネル顕微鏡によって画像化されます。蛍光強度および培養流出物から採取した細胞の細胞形態の動的応答が複数日にわたって測定されるように培養、サンプリング、画像化、および画像解析は完全に自動化されていますユーザーの入力なし。我々は、動的に転写を活性化する光遺伝学系で操作サッカロマイセス・セレビシエの株においてタンパク質産生を誘導することによって、この培養装置の有用性を実証します。

この装置は、CRY2 / CIB1タンパク質対30に基づいて、誘導光遺伝学転写系を介して青色光に応答して、黄色蛍光タンパク質（YFP）を発現するS.セレビシエの培養物を刺激するために使用しました。細胞は0.2±0.008の平均希釈率でリン酸限定培地でchemostatically成長させました。リン酸塩の制限は、一般に、成長速度を制御するためにS.セレビシエケモスタット実験で使用され、リン酸制限の効果は十分に特徴付けられています。 31、32は 、連続的に希釈された培養容器33の流出物は、倒立顕微鏡でマイクロ流体デバイスにサンプリングしました。 図8に示すように、画像が自動的に分析されました。個々の細胞は、バックグラウンドを差し引いた位相コントラスト画像とそのYFPのconcentraで同定されましたバックグラウンドを差し引いた蛍光画像から測定されるようションは、それらの蛍光から推定しました。 169677細胞の蛍光を、実験の70時間にわたり、マイクロ流体デバイス内の28の場所から取得した排出物の33600画像から解析しました。我々は、蛍光照明系とCMOSカメラを装備した倒立顕微鏡を使用しました。 YFP画像は500/20 nmの励起フィルター、30分の535 nmの発光フィルター、およびT515lpダイクロイックを用いて取得しました。画像は、ケーラー照明の下で、40X位相差対物レンズを用いて撮影しました。画像は平方マイクロメートルあたり87ピクセルと16ビットの色深度で記録しました。培養は、6時間間隔で完全な暗闇に続く、6時間間隔で青色光の強度を変化させることに暴露しました。文化は前にその蛍光強度が最初の暗期中に減少している理由である最初の測定に光にさらされていました。&lt;/ P&gt; 図9は、培養容器を照明に応答して起因する光遺伝学システムの起動時にYFP生産に蛍光を示しています。これは、平均単セル測定は、蛍光強度の人口分布を明らかにする集団にわたって蛍光の単セル測定の有用性を実証します。 42時間26分で外れ値に注意してください。対応する画像を確認した後、バックグラウンドを差し引いた画像中の細胞に似ているアーチファクトをもたらす、背景の合成画像を生成するために使用される画像の大部分において、細胞の塊があったことが明らかでした。また、培養容器からの泡は、マイクロ流体チャンネルに圧送し、その縁の部分は、画像解析アルゴリズムにより細胞と誤解しました。気泡やバックグラウンドを差し引いアーチファクトも、実際のセルに対応しているので、それらの測定された蛍光強度細胞の自己蛍光よりも低いです。この図は、自動的に3日間にわたって取得することができるデータの品質を実証します。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54894/54894fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/54894/54894fig8.jpg" /> 図8： 画像解析アルゴリズムの視覚的描写。これらの画像はトリミングされ、閲覧を容易にするために拡張されました。 （A）6つの画像は、細胞培養のバックグラウンドを差し引いた位相コントラスト画像を生成するために取得されます。主画像が取得された後に、5つの追加の画像を簡単にセルがずれていることを確認するために、各取得の間オン廃液サンプリングポンプを用いて取得されます。背景の合成画像は、5つの成分画像から生成されます。各画素の値背景画像5成分画像の両端が同じ画素の中央値です。 （B）バックグラウンドを差し引いた画像は、バイナリに変換されます。バイナリは、その後拡張され、バイナリの連続セクション内の穴が充填されています。黄色のアウトラインは大きさや真円度の基準に基づいて選択された関心領域（ROI）に対応しています。 （C）これらのROIは、各細胞の蛍光がROI内の最も明るいピクセルの値として測定された蛍光画像上にマッピングされます。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54894/54894fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/54894/54894fig9.jpg" /> 図9： 経時的な蛍光強度の人口分布 。これらの副図中の測定されたフッ素の対数escenceは、フローサイトメトリーにおける標準的な慣行に従って、表示されます。 AとBの線は、培養容器内の細胞培養物を透過した無菌培地および光を透過光との強度の差として測定される培養によって吸収または回折された光の強度を示しています。なお、第2縦軸に対してプロットされています。時間の経過とともに人口の測定された蛍光の対数の（A）]ボックスおよびウィスカープロット（5 パーセンタイル 、25 パーセンタイル値、中央値、75 パーセンタイル 、95 パーセンタイル ）。 （B）色に対応するビンの範囲で測定された蛍光を有する細胞の正規化周波数に対応し、同じデータの2次元ヒストグラム。色は42時間26分で、外れ値なしデータの範囲に含まれるスケールました。最低蛍光ビン内の外れ値の正規化周波数0.7です。 （C）光への最初の記録露光前と光に対する最大の暴露後の人口の測定された蛍光の対数の1次元ヒストグラム。それは、この株でYFPの光誘起式は二峰性であることを示しています。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54894/54894fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

我々は、倒立顕微鏡を用いて流出液中の微生物、定期的に画像を細胞の培養物を照明する光遺伝学システムを使用するための連続的な培養装置を設計しました。照明の動的応答は、数日間にわたって測定することができるように培養、サンプリング、画像化、および画像解析は完全に自動化されています。

微生物光遺伝学アプリケーションのための自動照明、培養、およびサンプリングシステムの設計と実装

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

design-implementation-an-automated-illuminating-culturing-sampling

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K ビュー.  University of Wisconsin-Madison. 我々は、倒立顕微鏡を用いて流出液中の微生物、定期的に画像を細胞の培養物を照明する光遺伝学システムを使用するための連続的な培養装置を設計しました。照明の動的応答は、数日間にわたって測定することができるように培養、サンプリング、画像化、および画像解析は完全に自動化されています。 

ビデオ: Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

遺伝学

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

神経科学

ゼブラフィッシュにおける光遺伝学的シグナル操作による発生の検討

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

著者スポットライト:ゼブラフィッシュ胚におけるシグナル伝達の操作による細胞運命決定の解読 

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

ゼブラフィッシュ胚における光遺伝学的シグナル伝達の活性化

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

発生生物学

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical control allows for an unprecedented ability to dissect function and holds the potential for enabling novel genetic therapies. However, optogenetic experiments require adequate light sources with spatial, temporal, or intensity control, often a bottleneck for researchers. Here we detail how to build a low-cost and versatile LED illumination system that is easily customizable for different available optogenetic tools. This system is configurable for manual or computer control with adjustable LED intensity. We provide an illustrated step-by-step guide for building the circuit, making it computer-controlled, and constructing the LEDs. To facilitate the assembly of this device, we also discuss some basic soldering techniques and explain the circuitry used to control the LEDs. Using our open-source user interface, users can automate precise timing and pulsing of light on a personal computer (PC) or an inexpensive tablet. This automation makes the system useful for experiments that use LEDs to control genes, signaling pathways, and other cellular activities that span large time scales. For this protocol, no prior expertise in electronics is required to build all the parts needed or to use the illumination system to perform optogenetic experiments.

This protocol describes how to perform optogenetic experiments for controlling gene expression with red and far-red light using PhyB and PIF3. Included are step-by-step instructions for building a simple and flexible illumination system, which enables the control of gene expression or other optogenetics with a computer.

光遺伝学的実験のための簡便で汎用性の高い照明システムの構築

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

生物工学

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

哺乳類細胞における安定した光遺伝学的遺伝子回路を確実にエンジニアリングおよび制御

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

微生物化学およびタンパク質生産のための光制御発酵

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction

Many neuromuscular diseases, such as myasthenia gravis (MG), are associated with dysfunction of the neuromuscular junction (NMJ), which is difficult to characterize in animal models due to physiological differences between animals and humans. Tissue engineering offers opportunities to provide in vitro models of functional human NMJs that can be used to diagnose and investigate NMJ pathologies and test potential therapeutics. By incorporating optogenetic proteins into induced pluripotent stem cells (iPSCs), we generated neurons that can be stimulated with specific wavelengths of light. If the NMJ is healthy and functional, a neurochemical signal from the motoneuron results in muscle contraction. Through the integration of optogenetics and microfabrication with tissue engineering, we established an unbiased and automated methodology for characterizing NMJ function using video analysis. A standardized protocol was developed for NMJ formation, optical stimulation with simultaneous video recording, and video analysis of tissue contractility. Stimulation of optogenetic motoneurons by light to induce skeletal muscle contractions recapitulates human NMJ physiology and allows for repeated functional measurements of NMJ over time and in response to various inputs. We demonstrate this platform&#39;s ability to show functional improvements in neuromuscular connectivity over time and characterize the damaging effects of patient MG antibodies or neurotoxins on NMJ function.

We describe a reproducible, automated, and unbiased imaging system for characterizing neuromuscular junction function using human engineered skeletal muscle tissue and optogenetic motoneurons. This system allows for the functional quantification of neuromuscular connectivity over time and detects diminished neuromuscular function caused by neurotoxins and myasthenia gravis patient serum.

ヒト神経筋接合部の光遺伝学的モデルの工学と特徴付け

Many neuromuscular diseases, such as myasthenia gravis (MG), are associated with dysfunction of the neuromuscular junction (NMJ), which is difficult to ...

Lustro Automation技術を用いた酵母光遺伝学的応答解析

High-Throughput Optogenetics Experiments in Yeast Using the Automated Platform Lustro

Optogenetics offers precise control over cellular behavior by utilizing genetically encoded light-sensitive proteins. However, optimizing these systems to achieve the desired functionality often requires multiple design-build-test cycles, which can be time-consuming and labor-intensive. To address this challenge, we have developed Lustro, a platform that combines light stimulation with laboratory automation, enabling efficient high-throughput screening and characterization of optogenetic systems.
Lustro utilizes an automation workstation equipped with an illumination device, a shaking device, and a plate reader. By employing a robotic arm, Lustro automates the movement of a microwell plate between these devices, allowing for the stimulation of optogenetic strains and the measurement of&#160;their response. This protocol provides a step-by-step guide on using Lustro to characterize optogenetic systems for gene expression control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. The protocol covers the setup of Lustro&#39;s components, including the integration of the illumination device with the automation workstation. It also provides detailed instructions for programming the illumination device, plate reader, and robot, ensuring smooth operation and data acquisition throughout the experimental process.

著者スポットライト:Lustro を使用したオプトジェネティクス研究の進歩 

This protocol outlines the steps for utilizing the automated platform Lustro to perform high-throughput characterization of optogenetic systems in yeast.

自動化プラットフォームLustroを用いた酵母のハイスループット光遺伝学実験

Optogenetics offers precise control over cellular behavior by utilizing genetically encoded light-sensitive proteins. However, optimizing these systems to ...

微生物光遺伝学アプリケーションのための自動照明、培養、およびサンプリングシステムの設計と実装

要約

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制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

ゼブラフィッシュ胚における光遺伝学的シグナル伝達の活性化

ゼブラフィッシュ胚における光遺伝学的シグナル伝達の活性化

ゼブラフィッシュ胚における光遺伝学的シグナル伝達の活性化

光遺伝学的実験のための簡便で汎用性の高い照明システムの構築

哺乳類細胞における安定した光遺伝学的遺伝子回路を確実にエンジニアリングおよび制御

微生物化学およびタンパク質生産のための光制御発酵

ヒト神経筋接合部の光遺伝学的モデルの工学と特徴付け

自動化プラットフォームLustroを用いた酵母のハイスループット光遺伝学実験