Name: in-depth physiological analysis of defined cell populations in acute tissue slices of the mouse vomeronasal organ
Uploaded: 2016-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
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We thank Ivan Rodriguez and Benoit von der Weid for generating the FPR-rs3-i-venus mouse line, their constructive criticism and fruitful discussions. This work was funded by grants of the Volkswagen Foundation (I/83533), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) and by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. MS is a Lichtenberg Professor of the Volkswagen Foundation.

すべての動物の手順は、実験目的のために使用される動物の保護（指令609分の86 / EEC）とで勧告は欧州実験動物学協会連合会（FELASA）によって提唱上のローカルおよび欧州連合の法律を遵守していました。 C57BL / 6マウスとFPR-RS3-I-金星マウスの両方が食料や水自由摂取させ 、12時間の明/暗サイクル上で室温で両性のグループで飼育しました。実験のためのセックスのいずれかの若年成人（6-20週）を使用しました。明らかな性別依存の違いは認められませんでした。 1.溶液の調製<ol><li>細胞外溶液S1を調製する：のCaCl 2、1 145のNaCl、5 KClを、1 4-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-1-エタンスルホン酸（HEPES）は（mM単位）を含有する細胞外溶液を緩衝のMgCl 2、10 HEPES。 pH値= 7.3（NaOHで調整）。 （グルコースで調整）浸透圧= 300mOsmで。 </li><li> extracellu準備LAR溶液S 2：カルボゲン、酸素（95％O 2、5％CO 2）のCaCl 2、1のMgSO 4 125のNaCl、25（mM単位）のNaHCO 3、5のKCl、1を含有する細胞外溶液、5 BES。 pH値= 7.3; （グルコースで調整）浸透圧= 300mOsmで。 </li><li>組織の埋め込 ​​みのために4％の低ゲル化温度アガロース溶液（S 3）を準備します。4％の低ゲル化温度アガロース。一緒にマグネチックスターラーを備えた低ゲル化100mlのガラス実験用瓶にS 1 50mlにアガロースを2g溶解します。アガロースを溶融し、約20分間、または撹拌しながら溶液が透明になるまで70℃で（蓋密閉しないで）水浴中にボトルを置きます。クールダウンし、さらに使用するまで42℃で第2の水浴中で溶融したアガロースを保ちます。 </li><li>細胞内溶液S 4準備：（mM単位）143のKCl、2 KOH、1 EGTA、0.3のCaCl 2（= 110 nMの遊離Ca 2+）、10 HEPES、2をMgATP、1 NaGTPを含むピペット溶液を、pH値= 7.1（KOHで調整）。浸透圧= 290ミリオスモル。 </li><li>個々の実験計画（電位活性化電流の特定の種類を分離する例えば 、薬理学的遮断剤）に応じて変更/ S 1の組成物を調整し、S 2、S 4。 </li></ol> 2.ワークスペースの準備<ol><li>継続的に前に解剖、温度およびpH調整のために氷の上の場所や含酸素溶液に、S 2、少なくとも30分で貯蔵室酸素化スライスを埋めます。 </li><li> S 2とのセットアップを記録でスライス灌流のための貯蔵を記入し、継続的に酸素化。 </li><li>解剖の前に、S 2でビブラトーム室を充填し、チャンバの周囲に砕いた氷を手配。また、ビブラトーム室に室を酸素化からスペア氷冷酸素化ソリューションを転送し、継続的に酸素化おきます。 </li><li>手術器具や消耗品を配置します。 </li><li>解剖の下でアイスジェルパックを置きます顕微鏡は、皿の底に凍結からVNO組織を防止するために、紙タオルで覆っています。 </li><li>簡単に70％エタノールと蒸留水ですすぎとビブラトームするマウントしたクリーンかみそりの刃。すべてのスライスセッションのために交換してください。 </li></ol> 3. VNO解剖と埋め込み<ol><li> CO 2への短時間の曝露によって、動物を犠牲にし、鋭い手術用はさみを使って首を切ります。注：氷の上にVNOカプセルを置くことに、動物を犠牲にするから時間が重要であるように、2分未満までの時間を最小限に抑えます。組織の生存率を維持するために、30分未満でアガロースの両方で完全解剖VNOsを埋め込みます。 </li><li>大きな手術用ハサミで下顎を削除します。口腔を介して入力し、個別に各側の下顎の骨と筋肉をカット。 </li><li>大きなペトリ皿に逆さまヘッドの残りの部分を配置します。 </li><li>へのより良いアクセスを得るために培地鉗子で上顎のと鼻の先端の周りの皮膚を引き離します門歯。 </li><li>吻側方向（ 図1A）で〜45°の角度で切歯の大部分を切り取るために骨のはさみを使用してください。これは、鼻腔からVNOカプセルの除去を容易にします。 注：VNOカプセルの先端の損傷を防ぐために歯の根に切断しないでください。 </li><li>メディア鉗子でその吻側部で剛性上口蓋をつかみ、慎重に平らな角度（ 図1B）で一体に戻って皮をむきます。 注：繰り返しの氷冷S 2で洗い流してください。 </li><li>鋤骨の骨と顎の先端との間の骨の融合をカットするマイクロ春のはさみを使用してください。先端の湾曲部が外側に離れてVNOから指し示すとはさみのヒントを挿入し、慎重にVNOカプセルに横方向の左右両側に小さなステップで骨を切りました。 </li><li> VNOカプセルを削除するには、尾部に鋤骨の骨を切断するために、マイクロ春のはさみを使用して、慎重にn個のうち、鋤骨の骨を持ち上げますメディア鉗子を使用してASAL空洞。すぐに解剖の残りのステップが実行されるアイスジェルパックのステレオ顕微鏡下で小さなペトリ皿にVNOを転送します。 </li><li>乾燥から組織を防止するために、氷冷S 2少量のVNOをすすぎます。 </li><li>メディア鉗子で鋤骨の骨の後ろをつかむことにより、VNO軟組織が含まれている軟骨カプセルを分離します。位置VNOs両方の間の分割は（ 図1D i）を見えるように背ビュー用カプセル。 </li><li>後部に釘付け鋤骨の骨を維持しながら、中央の骨の両方から軟骨VNOカプセルを分離するために微細な鉗子の先端を使用してください。 注：唯一の軟骨カプセルの縁に鉗子を使用し、繊細な感覚上皮が損傷しやすいように、軟骨を貫通しないよう十分に注意してください。 </li><li> 2 VNOsが分離されたら、もみをカプセル化軟骨の除去を開始トンVNO。 </li><li> 1微細な鉗子でカプセルの上縁をつかみ、以前鋤骨の骨（内側）に取り付けた軟骨壁を離れて分割します。 </li><li>軟骨は、皿の底に、その湾曲した側面とVNOを回し、しっかりと鉗子を使用して1つの側に軟骨を突き止める残り削除します。慎重組織と軟骨との間の接続を緩めるために軟骨とVNOの間に非常に平坦な角度で背面側から第二の微細鉗子を移動します。 </li><li>ゆっくりと感覚上皮の損傷を避けるために、その尾の先端にそれを保持することによって離れて軟骨からVNOの皮をむきます。 </li><li> VNOがカプセルからレバレッジされると、スライス工程中にアガロース周囲から組織を切り離します軟骨の任意の残りの部分のように、残りのすべての小さな軟骨部分を削除してください。 </li><li>組織の損傷を防止するために、最初の解剖VNO氷のように冷たいS 2の小滴を置きます。側面ウィルに大きな血管lは器官が無傷のままであり、肉眼で解剖（ 図2A II）中に破損しなかったことを示す目に見えるようになります。血管が損傷してしまった場合、まだ限り、全体的な形態が明らかに損なわれていなかったとしてVNOをスライスして上に運ぶために価値があるだろう。 </li><li>すぐに第二VNOを分析。 </li><li> VNOsを埋め込 ​​むには、溶融したS 3とリムに小さなペトリ皿の両方を満たす（42℃の水浴中に保存され、1.3を参照してください）。 </li><li>感覚上皮への損傷を避けるために、微細なピ​​ンセットで広い尾の端にVNOを保持します。 </li><li>アガロースにVNOを浸し、細胞外液のフィルムだけでなく、その表面から任意の気泡を除去するために、前後に水平に数回移動します。 </li><li>皿の底に直面して、尾の先端に垂直にVNOを置きます。代わりに、直接鉗子でVNOをつまんで、近くproximi鉗子先端部を移動させることにより、向きを調整VNOにTY。 注：それは実験中の感覚ニューロンにスライス面とアクセシビリティを決定するように埋め込む時のオリエンテーションは非常に重要です。 </li><li>ゲルアイスパック上の皿を置き、アガロースが固化するまで待ちます。 注：アガロースは、これは、周囲のアガロースから組織を離脱するように固化開始した後VNOの向きを変更しないでください。 </li></ol> 4.冠状VNO組織スライス<ol><li>大きなペトリ皿のふたに小さな皿からアガロースブ​​ロックを削除するには、小さなへらを使用して、逆さまに上向きVNOの尾の先端を残してアガロースを反転。 </li><li>手術用メス（先端で3〜4ミリメートル、底部に8〜10ミリメートル）を使用して、角錐状にブロックをカット。埋め込まれた組織を傷つけないように注意してください。 </li><li>ビブラトーム試料プレートの中央にピラミッド型のブロックを固定し、接着剤が完全に乾燥するために〜1分を待つように瞬間接着剤を使用してください。 </li><li>スライスcに試料プレートを転送hamberそれに応じて、第二VNOを準備します。使用するまで4℃で第2の検体とプレートを保管してください。 </li><li>厚さ：：次の設定で振動ブレードミクロトームを使用して150〜200ミクロン。スピード：3.5 AU = 0.15ミリメートル/秒。周波数：7.5 AU = 75 Hzの。簡単に解剖顕微鏡下でスライス形態を検査した後に使用するまで酸素供給室にスライスを転送します。スライスは、いくつかの時間のために保持することができます。 </li></ol> 5.単一細胞電気生理学的記録<ol><li>記録のために、水浸対物レンズ、Dodtまたは赤外線微分干渉コントラスト（IR-DIC）、およびエピ蛍光だけでなく、冷却CCDカメラを搭載した直立固定ステージ顕微鏡を使用しています。データ収集のために、パッチクランプアンプ、ヘッドステージ、AD / DAインターフェースボードと（記録ソフトウェアを含む）は、PCを使用しています。 </li><li> 10月20日パッチピペット（4-7MΩ）の株式を準備します。プルピペットホウケイ酸ガラスキャピラリーから（1.50ミリメートルOD / 0.86ミリメートルID）usinマイクロフォージとGAのマイクロピペットプラーと火ポリッシュ。 注：かなり小さいのVSNにパッチを適用する際の火災はピペットチップを研磨することは非常に重要です。これは、高抵抗シールを得るために、負圧を適用する際に、細胞膜を破裂防止するのに役立ちます。ピペット開口部を研磨した後、1μm程度であるべきです。 </li><li>使用するまで損傷や埃の蓄積を防止するために、ピペット保存瓶にピペットを保管してください。 </li><li>ソリューションの貯水池を充填し、実験計画に従ってチューブにより灌流システムを準備します。 注：彼らは強く電気生理学的記録を妨害するように完全にチューブから気泡を除去します。 </li><li> 〜3ミリリットル/分の流量を達成するための圧力を調整します。 注：高圧力が電気生理学的記録の組織切片の動きだけでなく、終了の原因となります。 </li><li>イメージング室にVNOスライスを移し、厚さ0.1mmのSYNTで配線ステンレス鋼のアンカーを使用して、スライス位置を修正hetic繊維（ 図2B - C）。 注：合成繊維糸のいずれかの組織切片ではなく、スライスを囲むアガロースをふさがないでください。 </li><li>バスアプリケーションを介して、室温で酸素S 2に設定し、継続的に表面かん流するスライスを記録への転送撮像チャンバ。 </li><li>浴溶液の一定の交換のためのゆっくりと吸引を作成するために、溶液の表面に吸着キャピラリーを調整します。 8イン1マルチバレル「灌流鉛筆」を調整して、上記と血管（ 図2C、3A）50 が含まれているVNOスライスの非感覚の部分に近接しています。反対方向からのスライスに直面する灌流鉛筆と記録ピペットを配置することが有益です。 </li><li> （150mMのKClで満たされている）L字型の寒天ブリッジを使用して参照電極と浴溶液を接続します。 </li><li>ピペット溶液S 4でパッチピペットを埋めます。 </li><li>コー​​ティングを掻き落とすことなく、ヘッドステージに接続された塩化銀でコーティングされたパッチ電極の上にピペットを取り付け、しっかりと取り付けます。 </li><li>お風呂に入る前に、パッチピペットに若干の正圧（10ミリリットルのプラスチックシリンジに約1ミリリットル）を適用します。 </li><li> （ 図2D）、それを押すことなく目標を沈めることができるように十分マイクロマニピュレーターを用いて、浴中にピペットを下ろします。 </li><li>ヘッドステージに接続された電気生理学ソフトウェアを使用して、（4-7MΩ間のR ピップ 、）ピペット抵抗を監視します。 注：R ピップがある場合は、&lt;4MΩガラスチップが壊れています。 R ピップは &gt; 10MΩの場合、先端が最も可能性の高い目詰まりやピペットの交換が必要です。 </li><li>赤外線最適化された微分干渉コントラスト（DIC）を使用したCCDカメラでVNOスライスを視覚化し、FPR-RS3-I-金星は蛍光照明を用いて、細胞（または同様に標識ニューロン）を発現する識別そして、適切なフィルターキューブ。 </li><li>フォーカスや実験計画に応じて、蛍光または非蛍光細胞を標的とします。 </li><li>細胞体に近づくために、最大感度のためのハンドホイールを使用しています。ピペットチップが近接しているいったん正圧に起因して、細胞体膜の小さな凹みが見えるようになります。 </li><li>正圧を解放し、高抵抗シール（1月20日GΩ）を得るために、細胞膜を吸引するためのわずかな負圧を適用します。細胞膜を破壊し、全細胞構成を確立するために短く穏やかな吸引を適用します。 </li><li>実験中に常にアクセス抵抗を監視します。 注：のみ（R 入力の≤3％を、実験の過程にわたって変化&lt;20％）を小さく、安定したアクセス性を示すニューロン含む分析にを。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

VNOは、情報化学物質を検出する化学感覚構造です。今日まで、鋤鼻受容体の大多数は、ほんの数の受容体 - リガンド対が同定されているようにdeorphanizedされていません。このうち、V1rb2は、特にMHCペプチドSYFPEITHI 48とSEIDLILGY 58によって活性化されることが、男性特有のフェロモンESP1 57と同様にV2r1bとV2rf2によって活性化されることが、男性の尿フェロモン2-ヘプタノン30、V2rp5によって活性化されることが説明されましたそれぞれ。受容体 - リガンドの関係やシグナル伝達を理解するための前提条件は、ネイティブ環境で定義されたVSN集団の生物物理学的特性の知識です。パッシブとアクティブな膜特性、電位依存性イオンコンダクタンスと活動電位放電パターンは、受容体の神経細胞が刺激を化学感覚に応答する手段と範囲を定義します。電気生理学的急性組織スライスでの録音や、特に、人ル細胞パッチクランプ記録は、非常に詳細でこれらの特性を分析するための優れた方法を提供します。 組織切片における成功と信頼性の生理学的記録のための重要なステップは、準備そのものです。実験を行うために期間を最大にするために、組織はすぐに解剖後にスライスし、氷冷酸素化ソリューションに転送する必要があります。それに続いて、切片を、実験日あたりの細胞のかなりの数のいくつかの時間せる分析のために保持することができます。これは、解剖し、30分未満で1動物の両方VNOsを埋め込むための時間を短縮するために、いくつかの練習が必要です。その後、生存細胞をいくつかの無傷の組織切片を得るために、経験豊富な実験の成功率は十分に75％を上回っています。パッチクランプ記録を実行するのCa 2+イメージングと比較して低スループット実験的アプローチです。しかし、それははるかに高い時間的に単一細胞レベルでの活動のより詳細かつ汎用性の高い分析が可能解決。全細胞構成において、細胞内の培地をピペット液で透析します。ピペット溶液は、正確な細胞質ゾルの組成を反映していないかもしれないが、それは、細胞外および細胞内イオン条件の両方の上に正確に制御して実験を提供します。結果の信頼性の解釈については、アクセス抵抗とリーク電流の連続的な監視が重要です。回では、有意な増加またはアクセス抵抗の強い変化や解釈不可能な結果に電流リードを漏らすので、廃棄するこれらの記録を要求します。また、いくつかの薬理学的化合物が不可逆的に、それは必要に応じて各記録後のスライスを交換するレンダリング結合することに留意することが重要です。 セル接続構成で記録することの細胞内成分の透析を防ぎ、細胞の膜電位に影響を与えません。したがって、この技術は、スクリーニングの低侵襲性と、比較的高速な方法を提供します。しかし、このアプロACHは、一般的に、細胞膜の外側から超閾値活動電位駆動型静電容量電流の記録に限定されています。ルーズパッチ記録をVNOスライス38,54における感覚ニューロンの多数のスパイク挙動を分析するために適していることが証明されています。 ここで使用されるトランスジェニックモデルは、VSNをを表現FPR-RS3の人口を識別し、分析するための信頼性の高いツールを提供します。また、ここに記載の技術にかかわらず、それらの遺伝子型の他の行に拡張することができます。使用可能な回線へのトランスジェニックマウス限界実験を使用して、定義された細胞型を調査する多大な利点にもかかわらず。しかし最近では、対象となるゲノムの編集がより速く、より手頃な価格のCRISPR / Cas9技術59となっています。結論として、急性鋤鼻組織切片における標的パッチクランプ記録は、定義されたpopulatの生物物理学的および生理学的特性を特徴付けるための汎用的なアプローチを提供します感覚ニューロンのイオン。

ほとんどの動物は、それらの周囲と対話するために、それらの化学的感覚に大きく依存しています。嗅覚は、適切な交配パートナーを見つけ、食品を評価する、捕食者を回避し、配置するための重要な役割を果たしています。主嗅上皮1,2、Grueneberg神経節3,4、マゼーラ5,6の中隔臓器と鋤鼻器官：ほとんどの哺乳動物では、嗅覚系は、少なくとも4つの解剖学的および機能的に異なる周辺のサブシステムから構成されています。 VNOは、ID、性別、社会的地位や性的な状態7-10についての情報を伝える化学手がかりを検出するのに重要な役割を果たしているアクセサリーの嗅覚システム（AOS）、の末梢感覚構造を含みます。 VNOは、右口蓋上記の鼻中隔の基部に位置しています。マウスでは、軟骨カプセル11-13で囲まれた二国間の盲終わる管です。臓器は、三日月形の内側の感覚epitheの両方で構成されVSNをを保有し、側面上の非感覚一部のlium。両方の上皮との間の狭い鋤鼻ダクト14を介して鼻腔に接続された粘液で満たされた内腔に位置しています。非感覚組織の大きな横方向の血管は負圧15,16を介してVNO腔にそのようなペプチドまたは小型タンパク質のような比較的大きい、主に非揮発性の分子の進入を容易にするために、血管ポンピング機構を提供します。 VNOの構造部品は、出生時に存在し、臓器は、まもなく思春期17の前に大人のサイズに達します。しかし、齧歯類のAOSはすでに少年で機能しているかどうか18-20を議論することが課題です。 VSNを、それらの上皮場所とそれらが発現する受容体のタイプの両方によって区別されます。 VSNをは無髄軸索内腔に向かって突出しており、微絨毛の樹状ノブで終わる単一の先端樹状突起を持つバイポーラ形態を示します。 VSNの斧アドオン束生の、背尾側端での軟骨カプセルを残す中隔に沿って上昇し、副嗅球（AOB）21,22に篩板やプロジェクトを渡し鋤鼻神経を形成します。鋤鼻感覚上皮は2層で構成されています：頂端層が腔側に近い位置に配置し、V1R-とFPR-RS-発現ニューロンの1タイプではなく、すべての両方を保有されています。これらのニューロンは、AOB 23-25 ​​の前部にGタンパク質αサブユニットGのαi2とプロジェクトを共発現します。感覚ニューロンは、GαOと一緒に、より基底層特急V2RsまたはFPR-RS1に位置し、AOB 26-28の後部領域への軸索を送ります。 鋤鼻ニューロンはおそらく、尿、唾液などの各種体液中に分泌し、涙液されているという小さな情報化学物質29-33（V1Rs）またはタンパク質化合物34-38（V2Rs）によって活性化される37,39-41 </sup&gt; その場での実験でのVSNもホルミル化ペプチドおよび種々の抗菌剤/炎症結合化合物25,42によって活性化されることが示されています。また、異種FPR-RSタンパク質が（参照43を参照）同種または腐った食物源25で病気のための検出器としての潜在的な役割を示し、免疫系において発現のFPRでアゴニストスペクトルを共有して表明しました。 特定のVSN集団における受容体 - リガンドの関係および下流のシグナル伝達カスケードを理解するための基本的には、ネイティブ環境での基本的な生物物理学的特性の詳細な評価です。過去には、細胞内シグナル伝達の解析が大幅に蛍光マーカータンパク質30,44-49を共発現することによってニューロンの定義された人口をマークする遺伝子改変動物の恩恵を受けています。このプロトコルでは、蛍光マーカー（FPR-RS3-I-ビーナス）と共にFPR-RS3を発現するトランスジェニックマウス系統が使用されます。このアプローチは、急性冠状VNOの組織切片内の単一ニューロンのパッチクランプ記録を用いて光学的に識別可能な細胞集団の電気生理学的分析を行うために、そのような遺伝的に改変されたマウス系統を使用する方法を例示します。感覚刺激と薬理学的薬剤のための空気圧駆動式マルチバレル灌流システムは、録音時に、迅速な可逆焦点神経刺激または阻害することができます。スライス標本における全細胞記録は固有の特性、電圧活性化コンダクタンス、ならびに細胞のネイティブな環境での活動電位放電パターンの詳細な分析を可能にします。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose (low-gelling temperature)</td><td>PeqLab</td><td>35-2030</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Mg-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Na-GTP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03564</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgical tools and consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large Petri dish, 90 mm</td><td>VWR</td><td></td><td>decapitation, dissection of VNO capsule</td></tr><tr><td>Small Petri dish, 35 mm</td><td>VWR</td><td></td><td>lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose</td></tr><tr><td>Sharp large surgical scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>decapitation, removal of lower jaw</td></tr><tr><td>Strong bone scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>cutting incisors</td></tr><tr><td>Medium forceps, Dumont tweezers #2</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>removing skin and palate</td></tr><tr><td>Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>cutting out VNO&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>dissecting VNO out of cartilaginous capsule</td></tr><tr><td>Small stainless steel spatula</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>handling agarose block and tissue slices</td></tr><tr><td>Surgical scalpel</td><td></td><td></td><td>cutting agarose block into pyramidal shape</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>HEKA Elektronik</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID)</td><td>Science Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD-camera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC360FX</td><td></td></tr><tr><td>Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515</td><td>Leica Microsystems</td><td>I3</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence lamp</td><td>Leica Microsystems</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate magnetic stirrer</td><td>Snijders</td><td>34532</td><td></td></tr><tr><td>Microforge&amp;nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator Device&amp;nbsp;</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller, vertical two-step</td><td>Narishige</td><td>PC-10&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>CSM DM 6000 SP5</td><td></td></tr><tr><td>Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug)</td><td>Quest Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>HCX APO L20x/1.00 W</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronik</td><td>TDS 1001B</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer&amp;nbsp;</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat 030</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion system 8-in-1</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH Meter five easy</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette storage jar</td><td>World Precision Instruments</td><td>e212</td><td></td></tr><tr><td>Recording chamber&amp;nbsp;</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>Slice mini chamber</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Wilkinson Sword GmbH</td><td>Wilkinson Sword Classic</td><td></td></tr><tr><td>Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments)</td><td>custom-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>S4E</td><td></td></tr><tr><td>Trigger interface&amp;nbsp;</td><td>HEKA Elektronik</td><td>TIB-14 S</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT 1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Water bath&amp;nbsp;</td><td>Memmert</td><td>WNB 45</td><td></td></tr></tbody></table>

in-depth physiological analysis of defined cell populations in acute tissue slices of the mouse vomeronasal organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

定義された細胞集団の生物物理学的および生理学的特性への洞察を得るために、我々は、マウスVNO（ - 2 図1）の急性冠状組織切片を行います。切開後、切片は、いくつかの時間氷冷酸素化細胞外溶液（S 2）に保つことができます。記録のセットアップでは、新鮮な酸素化溶液（ 図2D）との一定の交換は、実験を通して、組織の生存率を保証します。ここでは、トランスジェニックマウスモデル（FPR-RS3-I-金星）を採用します。この株の共発現でのVSN FPR-RS3と蛍光マーカータンパク質、感覚ニューロンの定義された人口の光学的識別を可能にするFPR-RS遺伝子ファミリーの原型メンバー（ 図3）。電気生理学的記録は、単一細胞レベルでの詳細な分析のための手段を提供します。例えば、電位依存性電流の分析は、電圧クランプで行われますモード（ 図4A - B）。イオン電流の特定のタイプを単離するために、スライスは電位依存性L型Ca 2+電流（ 図4B）をブロックするための電圧依存性Na +電流 （ 図4A）又はニフェジピンを阻害するようなTTXなどの薬剤で灌流されます。さらに、我々は日常的に活動電位放電パターン（ 図4C）を分析するために電流クランプ構成でホールセル記録を行います。ホールセル記録に加えて、細胞接着型の「ルーズシール」の録音は、細胞内成分（図5A）の透析を防止侵襲性の低い方法を提供します。セル51（ 図5B）の集団を定義した活性化し、記録する活動電位駆動型の短い刺激印加時に容量性電流は、感覚のリガンド（MUPS 例えば、主要な尿蛋白）をスクリーニングするための高感度かつ効率的な方法を提供しています。 FO = &quot;jove_content&quot;：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54517/54517fig1.jpg" /> 図1：VNO の解剖 。マウス頭部の（A）側面図切歯が切断する位置と角度を例示します。 （B）上口蓋（UP）を取得し、バック剥離するための最良のポイントを描いた腹ビュー。 （C）下顎、切歯および口蓋を除去した後VNOと鋤骨の骨（VB）を保有軟骨カプセル（CC）の上に腹ビュー。 （D）VNOs（D i）を両方の二国間の局在を描いた解剖VNOカプセルの背ビュー。側面図は、両方のVNOsは（D ロ ）を分離する必要が背側の軟骨の縁を示しています。スケールバー= 1ミリメートル（A - D）。517 / 54517fig1large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54517/54517fig2.jpg" /> 図2： チャンバーと顕微鏡のステージを記録する組織の調製、上皮（i）の非感覚の部分で大血管（BV）のコースと位置を説明するためのVNO上の概略側面図。破線は冠状スライス層です。 CCのうち剥離VNO上の側面図は、血管を示している（ⅱ）。厚さ0.1mmの合成繊維（SF）スレッドと有線ステンレス鋼アンカーを用いた溶液で満たされた記録チャンバーの底部に固定された（B）アガロース埋め込 ​​み冠状VNOの組織切片。四角で囲んだ領域は、組織切片を囲むアガロースを示します。 （Cは）アガロース（AG）の位置及び姿勢を示す模式図は、二つの繊維の間に位置する冠状VNOスライスを-embedded。 （D）顕微鏡ステージ上に載置された記録チャンバーの概要。チャンバは、酸素S 2と一定の表面灌流のためのバス・アプリケーション（BA）、灌流鉛筆感覚刺激または薬理学的薬剤を適用する（PP）、アンプのヘッドステージに接続された記録ピペット（RP）、参照電極（REが装備されています）吸引毛細管（SC）は、チャンバ内の溶液の一定の交換を維持します。スケールバー= 1ミリメートル（ⅱ）。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54517/54517fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54517/54517fig3.jpg" /> 図3： 冠状VNO TISSUEスライス。（A）共焦点画像（最大突起）が150μm急性冠状VNOの組織切片の鋤鼻感覚上皮内の蛍光FPR-RS3タウ-金星は+ニューロン（緑）の分布を示します。血管（BV）、管腔（L）、感覚上皮（SE）。 （B）FPR-RS3のタウ金星+ニューロンは、管腔の境界でノブのような構造で終わる単一の先端樹状突起を示します。全細胞パッチクランプ記録は、VSNのソーマ、パッチピペット（PP）から行われました。 （C）基底側のソーマを残す細長いデンドライト（D）、細胞体（S）及び軸索（A）の先端の樹状ノブ（K）を持つ単一のVSNの形態。スケールバー、50μmの（A）、10ミクロン（B）、5ミクロン（C）。この図は、52から変更されている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54517/54517fig3large.jpg" target="_blank">こちらをクリックしてください</a>この図の拡大版を表示します。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54517/54517fig4.jpg" /> 図4：高速FPR-RS3 +のVSN中のNa +電流を活性化させるTTX-敏感の全細胞パッチクランプ記録から分離された電圧依存性Na + およびCa 2+ 電流だけでなく、スパイク放電 （A）代表トレース。制御条件の下で（ⅰ）電圧ステップ録音（細胞外溶液S 1;細胞内の溶液S 4）が内向き電流電圧依存迅速かつ一過性を明らかにする。 （ⅱ）TTX処理（1μM）が強く電流を減少させます。デジタル減算トレース（コントロール-TTX（ⅲ））レーヴTTX感受性の電位依存性Na +電流をALS。制御およびFPR-RS3 +ニューロンから分離されたTTX敏感なのNa +電流の電流-電圧関係（IV）。 （B）代表のCa 2+電流トレースは（10μMのニフェジピン）の薬理学的に単離しました。段階的に正（Cの i）と負（C iii）の電流注入時に発生する（リバウンド）活動電位の脱/過分極や電車を示す（C）代表電流クランプトレース。 0 pAの電流注入（Cⅱ）で測定された自発的活動に注意してください。 （C 静脈 ）制御とFPR-RS3 +（私は注入 ）注入電流の関数としてのニューロンの発火頻度。発火率の緩やかな増加は、コントロールについても同様ですそして、FPR-RS3 + VSNを。 VSNをが低いピコアンペアが53から56の範囲であっても、現在の注射に絶妙に敏感であることに注意してください。 -I曲線fは 0 pAの電流注入での自発的なスパイク周波数を使用して、「バックグラウンド補正された」ことに注意してください。データは、平均±SEMです。この図は、52から変更されている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54517/54517fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54517/54517fig5.jpg" /> 図5： 基礎のVSNから外「緩いパッチの録音感覚上皮の基底層における記録ピペットを描い急性VNOの組織切片の（A）IR-DIC像。 （B）細胞接続構成における基底VSNの代表元の記録（＆＃39;緩いシール&#39;）プールされた組換え発現された主要な尿蛋白（rMUPs）で刺激（3秒）をブリーフィングするためにスパイクの短い過渡バーストで応答し、それぞれ上昇したカリウム濃度（50 mMの、1秒）、（B i）を 。 （B i）を示す記録の高倍率は、刺激に対する応答（Bⅱ）にスパイクのバーストを示しています。赤いバーは、刺激、刺激間間隔= 30秒、連続記録、中断&lt;1秒（カットマーク//）の時間を示しています。スケールバー=5μmの（A）。パネル（A）は、基準38から変更されている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54517/54517fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

マウス鋤鼻器官の急性組織スライスで定義された細胞集団の中で、深さ生理学的解析

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

in-depth-physiological-analysis-defined-cell-populations-acute-tissue

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.6K ビュー.  RWTH Aachen University. Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings. 

ビデオ: In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

鋤鼻上皮の多電極アレイ録音

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

神経科学

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

マウス鋤鼻急性組織スライス標本のイメージングフェロモンセンシング

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

遺伝的にコードされたカルシウムセンサーを発現する鋤鼻器のスライス標本のイメージング神経細胞応答

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

無傷の鋤鼻器官と副嗅球のex vivoでの準備

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures. The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, respiratory, and squamous epithelia which differ markedly in anatomical locations, morphology, and functions. In adult mice, the nose is covered with various skull bones, limiting experimental access to internal structures, especially those in the posterior such as the main olfactory epithelium (MOE). Here we describe an effective method for obtaining almost the entire and intact nasal tissues with preserved anatomical organization. Using surgical tools under a dissecting microscope, we sequentially remove the skull bones surrounding the nasal tissue. This procedure can be performed on both paraformaldehyde-fixed and freshly dissected, skinned mouse heads. The entire deboning procedure takes about 20-30 min, which is significantly shorter than the experimental time required for conventional chemical-based decalcification. In addition, we present an easy method to remove air bubbles trapped between turbinates, which is critical for obtaining intact thin horizontal or coronal or sagittal sections from the nasal tissue preparation. Nasal tissue prepared using our method can be used for whole mount observation of the entire epithelia, as well as morphological, immunocytochemical, RNA in situ hybridization, and physiological studies, especially in studies where region-specific examination and comparison are of interest.

プリザーブド解剖組織と無傷マウスの鼻腔組織を準備するための効果的なマニュアル脱骨方法

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

生物学

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of available mating partners or threats. In mice, this task is executed primarily by the olfactory system and its underlying subsystems, including the main and accessory olfactory systems. Both have peripheral organs populated by sensory neurons expressing G-protein coupled receptors able to bind chemical cues that reach the nasal cavity. Even though the molecular characteristics of these receptors is well understood, little is known about their cognate specific ligands. The method described here combines in situ hybridization detection of olfactory or vomeronasal receptors with immunodetection of phosphorylated ribosomal protein S6 (pS6) - a marker of neuronal activation. This protocol was devised to identify neurons activated after a single event of exposure to purified or complex chemical stimuli detected by the olfactory organs. Importantly, this technique allows the investigation of neurons triggered in biologically relevant contexts. Ideally, this method should be used to probe the molecular biology of the olfactory system and to study olfactory behaviors.

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

This protocol combines in situ hybridization with immunofluorescence to identify olfactory and vomeronasal receptor genes expressed in olfactory sensory neurons after activation by chemical stimuli in the mouse.

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of ...

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from Vomeronasal Sensory Neurons

Source: Ackels, T., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54517">In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The protocol video describes establishing a whole-cell patch clamp for electrophysiological recording from the sensory neurons of the vomeronasal organ (VNO) in mice. A coronal VNO slice with fluorescently labeled sensory neurons is placed in a recording setup. A labeled neuron is patched with a recording pipette in a whole-cell configuration for electrophysiological recording in response to chemical stimuli.

鋤鼻感覚ニューロンからの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Solution Preparation

	Prepare ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Preparation of Mouse Vomeronasal Organ for Vibratome Sectioning

Source: Ackels, T., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54517">In-depth physiological analysis of defined cell populations in acute tissue slices of the mouse vomeronasal organ.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video outlines the isolation of a mouse vomeronasal organ (VNO) and tissue preparation for vibratome sectioning. Sections are used to characterize the biophysical and physiological attributes of a specific group of sensory neurons.

ビブラトーム切片化のためのマウス鋤鼻器官の調製

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
Both ...

神経細胞培養技術

一次神経細胞培養

Perforated Patch-Clamp Recording of Olfactory Sensory Neurons in Mice

For this protocol, have mice available between 2 and 4 weeks old. In this presentation, mice expressing OR/IRES/tauGFP are used.
By using OR/IRES/tauGFP mice, all neurons expressing the OR of interest will be labeled with GFP. This method can be used for OR expressed in all zones. However, dissections and recordings will be easier for OR expressed in the dorsal zone.
Begin by anesthetizing and then decapitating a mouse.
The outcome of this protocol depends on the quality of the dissection. These dissection steps must be as short as possible and be precise.
To begin the surgery, use dissecting scissors to make a longitudinal cut along the dorsum. Pull skin apart to remove it. Then, cut along the lower jaw and make a coronal cut parallel to the teeth. Thus, remove the upper incisor teeth. Now, make a coronal cut around the head, behind the eyes. Discard the posterior head, and transfer the anterior portion to ice-cold Ringer&#39;s.
Now, under a dissection microscope, isolate the septum within 5 to 10 minutes. Start with a longitudinal cut along the ventral side. Then, cut the dorsal bones longitudinally along the dorsal lateral side of the nasal cavity.
Next, remove most of the bones and the palate. Transfer the isolated septum and attached epithelium to a container of oxygenated Ringer&#39;s at room temperature. Within five minutes, make the final preparations before recording.
The solution must not be too warm, or the preparation will look damaged. To access the neuroepithelium for recording, first, peel the epithelium from the underlying septum with forceps. Then, using micro-Vannas scissors, cut the anterior end of the septum to release the epithelium.
Now, carefully remove the vomeronasal organ. Cut it off where it is attached dorsally. The isolated epithelium can now be moved to the recording chamber, mucus side up. Once in place, use a harp to flatten the tissue. Then, transfer the chamber to an upright microscope. Visualize the neuroepithelium under a 40x water immersion objective while perfusing it continually with fresh Ringer&#39;s at room temperature.
To begin, search for the cells of interest, which, in this case, express EGFP. So 480-nanometers light is used to scan for cells that emit light in the 530 to 550-nanometer range. The targeted dendritic knobs and OSNs, when reviewed at 80 to 160x under bright field, should be clearly distinguishable from the supporting cells.
Now, load the electrode with the nystatin solution. Tap out any bubbles that form, and attach the electrode to the holder. Now, apply some positive pressure. The expected resistance is between 15 and 20 megaohms. Then, bring the electrode to the cell while maintaining the positive pressure.
When the resistance increases to about 40 megaohms, release the pressure and apply a slight negative pressure. If a gigaseal is made, the membrane potential should be clamped at about negative 75 millivolts.
Now that the cell is open, proceed with the experiment. Apply stimulation protocols and perfuse with pharmacological treatments as needed. To test with a single odorant, record 200 to 500 milliseconds of spontaneous activity. Apply the odorant for 500 milliseconds, and then, measure responses for up to 10 seconds.

マウス鋤鼻器官の急性組織スライスで定義された細胞集団の中で、深さ生理学的解析

要約

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マウスの嗅覚ニューロンの穿孔パッチクランプ記録