Name: characterization of human monocyte-derived dendritic cells by imaging flow cytometry: a comparison between two monocyte isolation protocols
Uploaded: 2016-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
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This research is supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, award K99/R00 AA021264. Additional lab support as part of startup package has been received from the Department of Immunology, Institute of NeuroImmune Pharmacology, Herbert Wertheim College of Medicine, and FIU- Office of Research and Economic Development. Gianna Casteleiro was supported by NIH/NIGMS R25 GM061347. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

全体的にヒト血液の研究をレビューし、IRBプロトコル承認＃のIRB-13から0440 FIUの治験審査委員会（IRB）によって承認されています。ヒトロイコパックは、マイアミ、フロリダ州のコミュニティ血液バンクから購入しました。 標準的な密度勾配法によるPBMCの1の単離<ol><li> T75フラスコ中の1×リン酸緩衝生理食塩水で血液の1希釈：1を実行します。 </li><li>ピペット注意深く15 50mlの遠心分離チューブに密度勾配溶液のmlおよび層 - この傾斜以上希釈血液の（25〜30ミリリットル/チューブ）。 </li><li> 1の加速と0の減速で1200×gで20分間遠心します。 </li><li>遠心分離後、新しい50mlの遠心分離チューブに界面層（白血球）を収集し、PBSで2回（1,080×gで3分間）で細胞を洗浄します。毎回上清捨てます。 </li><li>塩化アンモニウム - カリウム溶解（ACK）緩衝液で細胞を治療する（赤血球を溶解するために）。バッファのとで10ミリリットルを追加します。4℃で15分間cubate。 </li><li> 、PBSで2回細胞を洗浄1080×gで3分間遠心分離し、上清を毎回捨てます。 </li><li> PBMCをを含んでなる、ペレットを保存します。 </li><li>選択した単球の精製方法に進みます。 </li></ol>アドヒアランス法による2.単球精製<ol><li> L-グルタミン（300 mg / mlで）を含有する完全な細胞培養培地を準備し、ペニシリン（50 U / ml）を-streptomycin（50μg/ ml）および10％ウシ胎児血清を補充しました。 </li><li> PBMCを、加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で、完全培地10mlあたり5×10 7細胞の濃度で、T75フラスコ中でそれらを培養することにより、約2時間接着させます。 </li><li>インキュベーション後、培養フラスコからの非付着、浮遊細胞を除去し、穏やかにPBSで2回付着細胞を洗浄します。 </li><li>ヒト顆粒-MACRを2μl/ mlを添加した完全細胞培養培地中で接着細胞をインキュベート10μg/ mlのストック濃度で保存ophageコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン4（IL-4）。 </li><li>培地の半分を変更し、サイトカインごとに48時間を補充します。 </li><li> MDDCsへの単球の分化のために7日 - 5許可します。 </li></ol>磁気分離法による3単球の精製<ol><li>標準的な密度勾配技術からのPBMCを収集し、細胞/ mlの濃度でPBS緩衝液中の5 mlのポリスチレンチューブに注ぎ、再懸濁します。 </li><li> 、50μlの/ mlの細胞を用いたヒト単球濃縮カクテルを追加し、よく混ぜ、10分間4℃でインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、50μlの/ mlの細胞を用いて磁性粒子を追加し、よく混ぜ、5分間4℃でインキュベートします。 </li><li> PBS緩衝液を添加することにより、2.5ミリリットルの全体積に細胞懸濁液を起動し、ピペッティングにより2ダウンよく混ぜる - 3回。 </li><li>磁気デバイスにキャップなしでポリスチレンチューブを置き、2 RTで取っておきます。5分。 </li><li>インキュベーションの後、連続した1つの動きで、磁石をピックアップし、クリーン50ミリリットルの遠心分離管に目的の精製された単球画分を注ぎます。 </li><li> 10μg/ mlのストック濃度で保存されたヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン4（IL-4）を2μl/ mlを補充した完全細胞培養培地中で接着細胞を培養します。 </li><li> 48時間ごとに、培地の変更の半分は、新しいメディア（cRPMI中）およびサイトカインで5分間、1080×gでスピンダウンし、再サスペンドペレット。 </li><li> MDDCsへの単球の分化のために7日 - 5許可します。 </li></ol> 4.トリパンブルー排除生存率アッセイ 注：PBMCを、単球、およびMDDCsの細胞収率および生存率を得るために、この技術を使用してください。 <ol><li>標準トリプシン-EDTAを用いてフラスコ及びPBSを用いて細胞ペレットの洗浄を行い、収穫細胞。ペレットの大きさに応じて、再ペレットを溶解するためにPBSの5〜10ミリリットルに懸濁。 </li><li>希釈した細胞ペレットとトリパンブルー試薬の1希釈：マイクロ遠心管では、1を実行します。 </li><li>このミックスから、アリコート10μlの細胞計数スライドにし、製造業者のプロトコルに従って自動細胞カウンターを使用して結果を読み取ります。自動細胞カウンターを使用できない場合は、同様の細胞数は、血球計または手動カウンターを使用して可能です。 </li></ol> 5. MTTアッセイ<ol><li> 96ウェルプレート中の完全培地4×10 4個 /100μlの濃度でプレートの細胞を各ウェルに。細胞が培養液に調整するための24時間を許可します。 </li><li>インキュベートし、それぞれ0（0日）、36（3日目）および84（7日目）時間で読み取りを行います。 </li><li>希望のインキュベーションの終了時に、メディアを取り出し、単独で100μlのPBSと交換してください。 </li><li> 3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド溶液（MTT）（5mg / ml）をdimethを10mlを添加することにより調製しますドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を1gにイルスルホキシド（DMSO）。 </li><li>各ウェルにMTT溶液10μl（5 mg / mlで）を追加し、さらに2時間37℃でインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、PBSおよび未変換MTT混合物（黄色液）を含有する上清を除去します。 </li><li>各ウェルにSDS-DMSO溶液100μlを加え、さらに1時間インキュベートします。 </li><li>マイクロプレートリーダーを用いて540 nmの吸光度を読みます。 </li></ol> 6.細胞表面イメージングフローサイトメトリーによる染色分析<ol><li>精製した単球からの分化の7日後に1.5 mlチューブの適切な数への単球由来樹状細胞の1×10 6細胞のアリコートを分配します。 </li><li>熱不活性化50μlの（HI）ヒト血清を用いてブロッキング細胞による細胞表面染色を開始し、4℃で10分間インキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、5分間720×gで遠心分離細胞は、上清を捨てます。 </li><li>セルPELLEへtは、それぞれの蛍光標識抗体（ 例えば、抗CD11cのまたは抗CD14）を追加し、光から保護し、20分間4℃でインキュベートします。彼らは、補償のために必要とされているので、別々のチューブでは、）は、単一の蛍光色素染色したサンプル/ mlのを準備します。 </li><li>インキュベーション後、5分間720×gでPBS緩衝液遠心1mlの各時間で細胞を2回洗浄します。 </li><li>光から保護された細胞を維持、フローサイトメトリー分析のための細胞/ 100μlの濃度でPBS緩衝液中に再懸濁します。 </li><li>生存細胞上にゲートするためには、事前の製造元の指示に従った器具サイトメトリ単一細胞イメージングフローに細胞を取得する各チューブにDAPIの1μlを添加します。 </li></ol> 7.統計分析<ol><li>入力スプレッドシート内のすべてのデータ。 </li><li>必要に応じてスチューデントのt検定および/または一方向ANOVAを使用して結果を比較してください。 </li><li> p &lt;0.05の場合の差は統計的に有意であると考えてみましょう。 </李&gt; </ol>

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All authors disclose no competing financial interests.

単離したヒト血液からMDDCsを生成する既知の難しさに基づいて、本研究はMDDCsを生成するための2つのよく確立された方法の総合的な比較を提供することを目的としました。比較第一の方法は、ガラスやプラスチック（接着法）21,22,27に接着する単球の能力を活用することによってMDDCsを生成するための十分に確立された伝統的な方法です。付着方法は、迅速かつ費用効果的であり、複雑な装置の使用を必要としません。しかし、この方法のいくつかの欠点は、リンパ球汚染、低柔軟性、単球過渡操作22,30,31が含まれます。比較して第二の別の方法は、ネガティブ選択によりPBMCから単球を単離するために設計されたヒト単球濃縮キット26を使用して、全末梢血単核細胞（PBMC）からの単球の磁気分離です。この分離方法の利点は、不要な細胞であります標識した標的細胞を自由に列を必要とせずに直接抗体で細胞を標的とすることなく、新たなチューブに注ぎ出している間に磁石を用いて分離されます。かかわらず（磁気分離対付着）単球の単離方法の、両方の手順の後に、プロトコル内の重要なステップの一つは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）で単球のin vitro刺激し、インターロイキン4（ IL-4）、MDDCsを生成するために必要とされます。これは、抗原の取り込みおよび未熟MDDCs 32の処理能力の特性を損なうことなく血単核細胞からMDDCsを生成するための一般的かつ十分に確立されたプロトコルです。一般的にDCのin vitroでの生成のために使用される技術の主要な制限の1つは、単球などの前駆細胞の低い収率です。上記報告したように、接着方法によって単離された単球は、総Pの約6.2％を占めましたBMC、磁気分離により単離した単球がPBMCの最大25％を占めました。総血単核細胞20の1％ - DCはわずか0.1を構成している10％31 -文献によると、単球の正常成人の差動白血球数が2であるために及びます。そのため、磁気分離後に得られた単球の高い収率（〜25％）が細胞集団と不要な細胞に結合する抗体および/または磁性粒子の欠如の不純物が原因である可能性があります。 分離された単球の高い収率および純度を達成するために、プロトコル内のすべての重要なステップは、慎重に従わなければなりません。標準的な密度勾配遠心分離による血液からのPBMCの単離の間に、いくつかの重要なステップがあります。まず、ピペッティングし、注意深く50ml遠心チューブに密度勾配液の上に血の階層化は厳しくピペッティングすることは、このソリューションと血液の混合を引き起こす可能性がありますので、練習が必要なステップです、これを単離することは困難である弱いPBMC層をもたらすことができる、または、PBMCを有する赤血球の完全な混合物をもたらすことができます。この工程では、血液の明確に定義された層と異なるPBMC層を有するようにピペットの一定の比較的遅い流れを維持することが重要です。第二に、加速1および減速0と次のステップで遠心分離が非常に重要です。これらの設定は、最初の遠心分離工程のために使用されていない場合、それは不規則密度勾配溶液と血液の混合につながると血液成分の残りの部分からのPBMCを分離しません。 ACKとのより長いインキュベーションは、赤血球と一緒に実行可能なPBMCの減少につながることができますので、 - （15分10）第三に、もはや最適化された時間より用のバッファを溶解塩化アンモニウムカリウム（ACK）でのPBMCをインキュベートすることが重要です。また、ACKのインキュベーション後にPBS洗浄を行うことも重要です。しかし、赤血球は、最初で溶解されていない場合ACKのステップと、彼らはまだ洗浄の後に表示されるように継続し、ACKの溶解の別のラウンドを強くお勧めします。 白血球細胞の単離後、単球を生成するための接着方法を実行するときに心に留めておくべきいくつかの重要なステップがあります。浮遊リンパ球の存在が少ない単球が接着させることができ、また、より低いMDDCの純度をもたらすことができるので、まず、PBMCをインキュベーションの2時間後の浮遊リンパ球を洗浄することは非常に重要です。なお、これらの洗浄工程は、重要な過剰かつ過酷な洗浄です（推奨よりも多く、 すなわち 、2回）より低い単球の収率で得られた、あまりにも接着性単球を洗浄引き起こす可能性があります。サイトカインはMDDCsへの単球の分化に関与しているので、第二に、完全培地およびサイトカインで細胞をインキュベートすることが重要です。加えて、 48時間ごとに培地を交換し、サイトカインを補充することは、細胞の分化および生存のために重要です。メディアを変えながら、浮動MDDCsを保存し、分化の過程の間に表面から切り離すことができますいくつかのMDDCsがあるので、新鮮な培地およびサイトカインと一緒に文化に戻ってそれらを返すことも重要です。単球が、推奨濃度で播種取り付けられ、成長するために、彼らは細胞の接触にセルを必要とするので、近接して配置されていること、それはまた、重要なことを確認します。単球を生成するために、磁気分離法を行う場合には、良好な収率および単球の高純度を得るために、いくつかの重要なステップがあります。まず、メーカーが推奨する細胞濃度を維持するために重要です。それは低い収率および低い純度につながる可能性として、磁石に置かれたときポリスチレンチューブを乱さないことも重要です。上記のように、この技術は、他のCの存在に関連することができる接着方法に比べて有意に高い単球収率（ 図1）に導きますells。細胞は、フローサイトメトリーによって特徴付けられたときまた、磁気方法は、他の細胞の存在と相関し得る二重陽性細胞（CD11C + / CD14 +）、高い割合を示しているか、また、MDDCの異なる段階の存在が原因である可能性があり分化。 かかわらず、収率および純度のin vitro MDDC世代のもう一つの重要な側面は、生存および増殖MDDCsを生成する能力です。現在の研究は、培養中の7日間、細胞の代謝活性の増加によって示されるように、両方の精製方法は、MDDCs（ 図3）の増殖を誘導することを実証する証拠を提供します。また、磁気分離により精製単球からMDDCsの発生は、増殖の有意に高い率が密着（ 図3）により精製単球から生成さMDDCsに比較を示しました。これらの知見は、Gを示す先行研究と一致していますCD34 +細胞からのDCのenerationが原因ヒトの血液27、33における増殖DC前駆細胞の存在に対する増殖過程です。しかし、単球も増殖34,35の証拠なしのDCに分化することができることを実証論争の知見があります。 DCのin vitroでの生成についての論争とDCを前駆体を増殖するから、または単球の分化から生成されているかどうかについてのがたくさんあることを指摘することが適切です。例えば、接着性末梢血細胞からのDCのインビトロ産生はまた、GM-CSF 27への曝露後に増殖することができる前駆細胞を濃縮することが示されており、DCの収率はの存在下で誘導されることを実証する証拠もありますGM-CSFおよびIL-4は、単球33の起動回数を超えて拡張することができません。全体的に、現在の研究では、月の増殖に増加を示しています7日までに&gt; 70％のCD11c +表現型を有する総MDDCs人口につながる文化の中でocytic細胞（遵守= 19±= 79％の磁気対72％±11）。より高い二重陽性表現型（遵守= 49％で、さらに表現型解析を行ったところ、有意ではないものの、磁気分離法によって単離された単球がMDDCsをもたらしたことを磁気= 73％に対し±7のCD11c + / CD14 +指摘する関連性があります±15のCD11c + / CD14 +）の接着によって単離された単球が高く、単一の陽性表現型（遵守= 23％、6％=磁気±7のCD11c + / CD14-）対±7のCD11c + / CD14-とMDDCsをもたらしました。高い単一の陽性表現型を持つMDDCsは分化の後期段階下にあってもよい一方で、より高い二重陽性表現型（のCD11c + / CD14 +）を持つMDDCsは、分化の初期段階下にあってもよいです。 要約すると、本研究では、ネガティブ選択磁気分離ということを支持する証拠を提供しprocedur接着方法によって単離された単球と比較した場合、単球を分離する電子は、単球の生存率に有意な差を有する単球の最も高い収量を生成します。ターンでは、7日後、磁気分離によって単離された単球は、MDDCの生存率に影響を与えることなく、有意に高い増殖能と二重陽性（のCD11c + / CD14 +）の表現型を発現する細胞の高い量とMDDCsに分化しました。両方の方法を比較すると、両方の方法は&gt; 70％のCD11c + MDDCsが得られたので、調査結果は、同時に文化の中で7日後のCD11c + MDDCsに（ 図3）を 、増殖および分化することができる単球（ 図4）を生成するための両方の技術の能力を実証しています。しかし、成熟マーカーを見て、さらに分析が完全に機能MDDC集団を特徴付けるために有用であろう。結論として、両方の方法は、CD11cの+ MDDCsおよびプロブの単離のための有利な代替物であります研究用途のために十分な収率をIDEとも将来の臨床応用に有用であり得ます。ラボは現在、MDDCの表現型および機能を変更するためにこれらの物質の特に能力で、アルコール乱用および先天性免疫システム上の他の乱用物質の影響を研究するためにMDDCsの世代に焦点を当てています。したがって、現在の研究では、MDDCの特性評価のベースラインを提供し、薬物乱用のコンテキストで単球由来樹状細胞機能を媒介する分子メカニズムを解明するために、さらなる実験を続行する能力を強化します。

樹状細胞（DC）は、先天性および適応免疫系の重要なメディエーターです。それらは、一次免疫応答を誘導し、免疫記憶の発達を促進するように機能します。これらの細胞は、抗原捕捉、移動およびT細胞刺激の主な原因であり、したがって、DCの.Manipulation異なる治療するための研究分野の広範囲にわたって、臨床設定で利用できる1とプロフェッショナル抗原提示細胞（APC）と呼ばれますそのようなHIV 6,7、癌8などの炎症性疾患、自己免疫疾患9、およびアレルギー応答10。 DCはまた、アルコール依存11-14、薬物依存13,15、及びHIV感染および物質乱用16-19の組み合わせに関連するものなどの未知のメカニズムおよび経路を解決するために、薬物乱用の研究に使用されています。これらの継続的な研究と今後の調査研究Inは免疫学の分野は、研究のために非常に重要なDCの試験管内世代で行います。総血単核細胞20の1％ -しかし、彼らは0.1を構成するように、ヒトの血液からのDCの単離に関連するいくつかの困難があります。 現在までに、樹状細胞のインビトロ生成のための十分に確立された方法のいくつかは、22の選別、磁気活性化細胞、蛍光活性化セルソーティングとして単球21,22のプラスチックまたはガラス付着、密度勾配遠心分離23、特定のマーカーに基づく分離で構成され24、デキストラン被覆磁性ナノ粒子25、および完全に自動化された負の細胞選択26を使用して高度に精製された単球の迅速な単離を使用して、CD14 +単球の陽性選択。しかし、選択の最良の方法は、議論の余地が。したがって、DCの生成技術を改善するために、いくつかの方法は、開発されていますこれらの細胞の純度が大きく、末梢血単核細胞（PBMC）27から単離され精製されたCD34 +前駆細胞と単球から分化により増加させることができます。前に述べたように、単球由来樹状細胞（MDDCs）を生成するために広く使用され、人気の方法は、ガラスやプラスチック（接着法）21,22,27に接着する単球の能力を探ることです。付着方法は、複雑な装置の使用を必要としない迅速かつ簡単な方法です。しかし、この方法のいくつかの欠点は、リンパ球汚染、低柔軟性、および単球過渡操作28を含みます。付着方法に代わる方法としては、特にネガティブ選択26によってPBMCから単球を単離するために設計されたヒト単球濃縮キットを使用して、総PBMCから単球の磁気分離です。この手順の間、不要な細胞には、四量体による除去の対象とされています抗体複合体とデキストラン被覆磁性粒子。この分離方法の利点は、不要な標識された細胞は、標的細胞が自由に列を必要とすることなく、新たなチューブに注ぎ出しすることができるが、磁石を用いて分離されることです。現在までに、ユニークな細胞集団にラベルを付けることができ、特定のモノクローナル抗体の利用可能性と、磁気分離技術は、単に追加の方法が、免疫学の分野では珍しい細胞の単離の必要はないとなっています。例えば、市販の常磁性MACS-ナノ粒子とソーティングなど磁気細胞などの技術は、研究と臨床応用22,29のための新たなアプローチの開発を促進しました。さらに、単球の接着およびMACS技術方法からDCの生成を比較した最近の調査研究は、単球22,30分離MACSを使用して、より高いDC純度および生存率を示しました。 現在の研究のプレゼント市販のヒト単球濃縮キットを使用してネガティブ選択により付着および2）単球の単離によって1）単球の単離：PBMCから単離した単球からのヒトDCの生成のための2つの方法の間の比較。この研究は、接着方法によって単離された単球と比較した場合、単球を単離するためのネガティブ選択磁気分離手順は、単球の生存率に有意な差を有する単球の最も高い収量を生成することを示す証拠を提供します。ターンでは、7日後、磁気分離によって単離された単球は、MDDCの生存率に影響を与えることなく、有意に高い増殖能と二重陽性（のCD11c + / CD14 +）の表現型を発現する細胞の高い量とMDDCsに分化しました。それは同時に、増殖およびCD11cに分化することができる単球を生成するために、両方の技術の能力を実証するため、全体的に、現在の研究では、+上で参照した以前の研究とは異なり彼らの生存能力を損なうことなく、培養中7日後MDDCs（&gt; 70％）。また、現在のアプローチは、フローサイトメトリーを撮像して異なるのCD11c / CD14 MDDCs集団の初回の特徴付けを提供します。 DCは免疫学の分野の研究について焦点役割を果たしているので、それらが誘導されている方法を検討し、どのような方法は、 インビトロでそれらを分離し、培養するために使用されている場合要約すると、異なるパラメータを考慮しなければなりません。そこで、本研究では、二つの異なる単球の単離の方法とどのようにこれらの方法は差動で、最終的に、樹状細胞の生存率、増殖、および表現型に影響を与える単球の生存率および収量に影響を与えるの洞察を提供することを目的とします。これらの知見は、免疫学の分野に大きく貢献するとDCの単離、精製、およびキャラクタリゼーションの詳細なプロトコルを提供します。

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>Must be used at RT</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep buffer</td><td>StemCell</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human monocyte enrichment kit</td><td>StemCell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automated cell counter</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0101</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue stain (0.4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 multi-mode reader</td><td>Biotek</td><td>7131000</td><td></td></tr><tr><td>XTT Sodium salt bioreagent (XTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X4626-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>m5655-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Phenazine Methosulfate (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9626-1G</td><td></td></tr><tr><td>Inactivated (HI) Human Serum</td><td>Chemicon</td><td>S1-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 Flow Cytometer</td><td>BD Accuri</td><td>653119</td><td></td></tr><tr><td>FlowSight Amnis Flow Cytometer</td><td>EMD Millipore</td><td>100300</td><td></td></tr></tbody></table>

characterization of human monocyte-derived dendritic cells by imaging flow cytometry: a comparison between two monocyte isolation protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

<html> 磁気分離により単球の収量は遵守法による単球の収量に比べて高いです PBMCおよび単球の分離の分離の日にトリパンブルー排除法により図1の表示PBMCおよび単球細胞数で示されたデータ。磁気分離により単離された単球がPBMCの最大25％を占めながら、平均して、接着方法によって単離された単球は、全PBMCの約6.2％を占めました。統計分析は、磁気分離により得られた単球の割合が著しく高い（≥4倍）​​であることを明らかにしました。データは少なくとも3回の独立した実験の平均±SDとして表されます。両方の方法（0.0005≤p）を比較する場合、単球の収量の有意な差が認められた検定スチューデントのtを使用して統計分析。 1 &quot;&gt; 単球の単離順守によって、および磁気分離によって単球生存率に影響を与えません ：「キープtogether.withinページを= FO」_content 上記の二つの異なる技術によって、単球の単離後、生存率アッセイが使用される方法は、細胞傷害性および細胞の生存率に影響を与えなかったことを確認するために実施しました。 図2の表示のいずれかの付着方法によって、または磁気分離により単離し、生存単球の割合の平均で提示されたデータ。生存細胞は、単離の日に、トリパンブルー排除法を用いて計数しました。 2つの分離レベルの方法の間の単球のパーセント生存率を比較すると、両群間の差は統計的に有意ではなかったことを明らかにしました。また、密着性により単離し、生存単球の割合の平均は1.66±91.75パーセントであった、生存単球の割合の平均はMAGNにより単離しETIC分離は2.75±87.4パーセントでした。これらの生存率データは、少なくとも3つの独立した実験から評価しました。統計的有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定しました。 磁気分離によって分離された単球由来の細胞は、遵守方法によって獲得された単球由来の細胞と比較して細胞増殖の有意な増加を示します MTTは、細胞増殖を測定するための比色アッセイを用いました。生細胞における、MTTの黄色テトラゾール色を容易に分光光度計を用いて測定された紫色のホルマザンに還元されます。 0.22±0.02 対磁気方式：0.38±0、図3に示すデータは、0日目の吸光度の増加（付着法により測定される単球の分離の両方のプロセスは、7日の期間にわたり、より高い細胞増殖をもたらすことを実証します0.02）、3日目（密着法：0.28±0.02、磁気法：0.55±0.05）と7日目（密着法：0.36±0.01、磁気= 0.66±0.006）。しかし、XTTアッセイとは異なり（データは示していない）、MTTアッセイは、0日目（P = 0.003）、3日目に付着法によって取得された単球からMDDCsに比べ磁気分離によって単離した単球からMDDCsの細胞増殖の有意な増加を明らかにしました（P = 0.006）、および7日目（P = 0.002）。細胞増殖は0日と3（P = 0.003）との間に有意差があることが判明し、そして0日および単球からMDDCsのグループ内の7た（p &lt;0.001）との間で磁気分離により精製しました。また、密着性（P = 0.008）により精製した単球からMDDCsで0日目と7日目の間の細胞増殖の有意な差が観察されました。 MTTアッセイは、3つの異なる実験から得られたMDDCsを用いて行きました。統計的有意性は、wは≦0.05 ANOVA及びスチューデントのt検定、Pを用いて決定しました有意であるとみなされるように統計的有意差が認められなかった場合を除き、そしてp値は、グラフ上で指摘されています。 CD11cおよびCD14細胞表面染色によりMDDCsのキャラクタリゼーション IL-4およびGM-CSFで7日間単球を培養した後、密着性および磁気分離法によって単離された単球から得られたMDDCsを図4に特徴付けられた。特性評価は、両方の方法で低シングルCD14 + / CD11c-表現型または純粋に単球集団を明らかにし、磁気= 79％±19対0.0と高合計のCD11c +表現型、密着性= 72％±11±磁気= 1％対1.0±= 1％遵守しかし、総CD14 +集団をさらに分析したところ、高収量があったが、磁気分離との両方の方法でのCD11cおよびCD14のための二重陽性細胞二重陽性のCD11cおよびCD14の高い数を与えます人口接着方法に比べ、密着性= 49％の磁気に対し±7 = 73％±、MDDCsの磁気分離、正のCD11cおよびCD14陰性集団を介した二重陽性表現型を有するMDDCsの高い収量が高かったた15が、接着方法で、 図4Bで±7、各個別のマーカーの平均蛍光強度（MFI）はゲーテッド集団に見て、CD14 +集団におけるCD14の高輝度を示した= 6％の磁気に対し±7遵守= 23％、両方の同等の強度二重陽性集団およびCD11c +およびCD14-集団において高のCD11c強度ののCD11cおよびCD14。磁気分離は、まだ単球マーカー（CD14）を落としていないMDDCsを区別初期段階であってもよいのCD11c + / CD14 +細胞のより高い割合を与えるにもかかわらず、要約すると、付着方法は、のCD11c + / CD14-のより高い割合を与えますMDDC人口の分化後期であってもよいです。 ADDITでイオンは、DAPI染色は、生存率の結果を確認し、特性評価を生MDDCsで行った保証するために行われました。 DAPIネガティブ/生きている細胞の割合（磁気= 67±1対遵守= 76±7）は、両方の方法を確認する2つの方法の間に有意差はなかっある文化の中で7日後にMDDCsの生存率には影響しません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54296/54296fig1.jpg" /> 磁気分離によって 図1 単球の収率が付着法による単球の収量と比較して高くなっている。〜単球の25％は、磁気分離法を用いて得られた、一方の単球の約6.2％が付着法を用いてPBMCから単離しました。データは少なくとも3回の独立した実験の平均±SDとして表されます。両方の方法を比較した場合、スチューデントt検定を用いて統計的分析は、単球の収量の有意差を示しました。（P = 0。00005）。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54296/54296fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54296/54296fig2.jpg" /> 接着によっておよび磁気分離によって 図2. 単球の単離は、単球生存率に影響を与えません。遵守により単離し、生存単球の割合の平均は1.66±91.75パーセントであったと磁気分離により単離し、生存単球の割合の平均は87.4パーセント±ました2.75。データは、少なくとも3つの独立した実験の生存細胞の平均±SD百分率として表されます。両方の精製方法を比較した場合、有意な差は細胞生存率では観察されなかった。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54296/54296fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <html><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54296/54296fig3.jpg" /> 磁気分離によって分離された単球由来 図3. 細胞が順守法による単球を買収由来の細胞と比較して細胞増殖の有意な増加を示す。吸光度の有意な増加は、両方の3日目と7日目に両方の方法についても観察された値を比較した場合両方の方法（0.05≤p）を比較する際に加えて、0日目のそのそれぞれの対照に対して、ANOVAおよびスチューデントのt検定はまた、MTT取り込みの吸光度の有意な差が認められました。データは、3つの独立した実験の平均±SDとして表現されている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54296/54296fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 96 / 54296fig4.jpg &quot;/&gt; 異なる集団（単セルのゲートアウト％）を表すのCD11cおよびCD14細胞表面染色。A）バーグラフによりMDDCsの 図4. キャラクタリゼーション 。まず、DAPI-（生きている）細胞は、全単一細胞からゲートしました。その後、CD14 + / CD11c-、のCD11c +、のCD11c + / CD14 +およびCD11c + / CD14-はDAPI-（生きている）集団からゲートしました。 CD11c +集団2領域のCD11c + / CD14 +およびCD11c + / CD14-の合計です。B）細胞のすべての部分集団でのCD11cおよびCD14の両方の平均蛍光強度（MFI）の値を示す代表的グラフである。C）標識された細胞の代表的な散布図磁気および付着方法の両方のためにDAPI陰性（生きている）細胞集団にゲートのCD11c-APCおよびCD14-APCcy7と。ゲート細胞の各サブ母集団に属する（散布図に青色で選択）単一細胞の代表的な画像ギャラリー、のCD11c + / CD14-（オレンジ色にゲーティング）、のCD11c + / CD14 +（赤）、およびCD14 +（）紫色でゲートさ。単一細胞の画像ギャラリーでは、赤い色は、APCと黄色の色で標識したCD11cはAPCcy7で標識されたCD14を表します。散布図では、集団ゲートに選ばれた色がランダムであり、実際の細胞画像に相関関係はありません。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54296/54296fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K ビュー.  Florida International University. This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

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An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

不定冠詞<em&gt;インビトロ</emヒトマクロファージの分化と偏光の不均一性を研究するために&gt;モデル

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

免疫・感染学

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the transmigration of innate immune monocytes to inflammatory sites of deposited lipid called fatty streaks, which are present in arterial walls of medium to large arteries. The key pathogenic feature of lesions at this early stage of atherosclerosis is the maturation of monocytes which migrate into arteries to form foam cells or lipid-laden macrophages. Considerable evidence supports the hypothesis that risk of atherosclerosis is increased by chronic inflammatory conditions accompanying diseases such as rheumatoid arthritis and HIV, as well as general ageing, and that this risk is predicted by monocyte activation. While mouse models provide a good platform to investigate the role of monocytes in atherogenesis in vivo, they require genetic alteration of natural cholesterol metabolism and drastic alteration of normal mouse diets, and have limited suitability for the study of atherogenic influences of human comorbid diseases. This motivated us to develop a human in vitro model to measure the atherogenic potential of monocytes isolated from individuals with defined disease states. Currently, human in vitro models are limiting in that they evaluate monocyte transmigration and foam cell formation in isolation. Here we describe a protocol in which monocytes isolated from patient blood transmigrate across human endothelial cells into a type 1 collagen matrix, and their propensity to mature into foam cells in the presence or absence of exogenous lipid is measured. The protocol has been validated for the use of human monocytes purified from individuals with HIV infection and elderly HIV uninfected individuals. This model is versatile and allows monocyte transmigration and foam cell formation to be evaluated using either microscopy or flow cytometry as well as allowing the assessment of atherogenic factors present in serum or plasma.

We describe a protocol to measure transmigration by monocytes across human endothelial monolayers and their subsequent maturation into foam cells. This provides a versatile method to assess the atherogenic properties of monocytes isolated from people with different disease conditions and to evaluate factors in blood which may enhance this propensity.

単球輪廻と慢性炎症性疾患を持つ個人から泡沫細胞の形成の定量化

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

全血によって人間の Monocyte のサブセットの解析フローのフローサイトメトリー解析

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

解剖されたインプラント組織の免疫機能解析のための高次元フローサイトメトリー

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

生物工学

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. While antiretroviral therapy efficiently lowers systemic viral load and restores normal CD4+ T cell counts, it does not reconstitute a completely functional immune system. A dysfunctional immune system in HIV-infected individuals undergoing cART may be characterized by immune activation, early aging of immune cells, or persistent inflammation. These conditions, along with comorbid factors associated with HIV infection, add complexity to the disease, which cannot be easily reproduced in cellular and animal models. To investigate the molecular events underlying immune dysfunction in these patients, a system to culture and manipulate human primary monocytes in vitro is presented here. Specifically, the protocol allows for the culture and transfection of primary CD14+ monocytes obtained from HIV-infected individuals undergoing cART as well as from HIV-negative controls. The method involves isolation, culture, and transfection of monocytes and monocyte-derived macrophages. While commercially available kits and reagents are employed, the protocol provides important tips and optimized conditions for successful adherence and transfection of monocytes with miRNA mimics and inhibitors as well as with siRNAs.

Presented here is an optimized protocol for isolating, culturing, transfecting, and differentiating human primary monocytes from HIV-infected individuals and healthy controls.

原発性ヒト単球の単離、トランスフェクション、培養

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

シアリダーゼ処理を用いた単離PBMCからの脱シアル化単球誘導型DC

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical characteristics, they are involved in numerous biological processes, such as modulation of the immune response, recognition of self and non-self antigens, carbohydrate-protein interactions, etc. The cellular content of sialic acid is regulated by sialidase, which catalyzes the removal of sialic acid residues. Several studies have shown that sialo-glycans are critical in monitoring immune surveillance by engaging with cis and trans inhibitory Siglec receptors on immune cells. Likewise, glyco-immune checkpoints in cancer are becoming crucial targets for developing immunotherapies. Additionally, dendritic cells (DCs) are envisioned as an important component in immunotherapies, especially in cancer research, due to their unique role as professional antigen-presenting cells (APC) and their capacity to trigger adaptive immune responses and generate immunologic memory. Nevertheless, the function of DCs is dependent on their full maturation. Immature DCs have an opposing function to mature DCs and a high sialic acid content, which further dampens their maturation level. This downregulates the ability of immature DCs to activate T-cells, leading to a compromised immune response. Consequently, removing sialic acid from the cell surface of human DCs induces their maturation, thus increasing the expression of MHC molecules and antigen presentation. In addition, it can restore the expression of co-stimulatory molecules and IL-12, resulting in DCs having a higher ability to polarize T-cells toward a Th1 phenotype and specifically activate cytotoxic T-cells to kill tumor cells. Therefore, sialic acid has emerged as a key modulator of DCs and is being used as a novel target to advance their therapeutic use. This study provides a unique approach to treat in vitro monocyte-derived DCs with sialidase, aimed at generating DC populations with different cell surface sialic acid phenotypes and tailored maturation and co-stimulatory profiles.

著者スポットライト:細胞表面のシアリダーゼベースの酵素処理を使用した樹状細胞の成熟 

A unique, comprehensive protocol to generate de-sialylated human monocyte-derived dendritic cells (mo-DCs) from isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a sialidase treatment is presented. Further, methods to assess the phenotypic and functional characterization of mo-DCs and evaluate how sialidase treatment improves the maturation level of mo-DCs are described.

シアル化表現型の異なる単球由来樹状細胞の作製

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical ...

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

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ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

単球輪廻と慢性炎症性疾患を持つ個人から泡沫細胞の形成の定量化

全血によって人間の Monocyte のサブセットの解析フローのフローサイトメトリー解析

解剖されたインプラント組織の免疫機能解析のための高次元フローサイトメトリー

原発性ヒト単球の単離、トランスフェクション、培養

シアル化表現型の異なる単球由来樹状細胞の作製

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