Name: wet chemistry and peptide immobilization on polytetrafluoroethylene for improved cell-adhesion
Uploaded: 2016-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
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The authors would like to acknowledge the help of Walter Scholdei (Max-Planck-Institute for Polymer Research, Mainz, Germany.

1.ナトリウムナフタレニ活性化溶液の調製と表面活性化注：よく換気ドラフト内で反応を行います。金属ナトリウムなどの引火性の高い溶剤や腐食性の金属を処理するための一般的なルールに従ってください。ナフタリンは、非常に少量で、非常に不快な臭い（防虫剤）を持っています！特記しない場合の反応は室温で行われます。アジ化ナトリウムは非常に有毒です！ THF分子ふるい（体積）に対して約20％を保存した（99.9％は、マテリアルのリストを参照してください）​​。ナトリウムを超える顕著な含水量でTHFを蒸留。微量の水が存在する場合、ナトリウムナフタレニドの形成は起こりません。 <ol><li> （3オングストロームのモレキュラーシーブ上で乾燥THF）テトラヒドロフラン20ml中のナフタレンを1.4g（10.9ミリモル）の溶液に、PTFE-を備えたスクリューキャップ100mlのガラスボトル0.25グラム（10.9ミリモル）のナトリウム金属を加えますコー​​ティングされた磁気撹拌棒。 注：Dissolu（ - 40°C 35）化が大幅に小片と適度な加熱にナトリウムを切断することによって向上させることができます。最終溶液は暗い、わずかに緑がかった色を有しており、厳密な乾燥条件下で保存してもよいです。 </li><li>厚さ0.5mmの箔材料から直径12mmのPTFEディスクを打ち抜きます。マーク1の側（ 例えば 、文字スタンプパンチを使用）し、イソプロパノールできれいに。 </li><li>鉗子を使用して2分 - 1のための活性化溶液（ステップ1.1）で個別にPTFE-サンプルをインキュベートします。注：ダークブラウンに白から色の変化は、治療の成功を示しています。 </li><li>続いてイソプロパノールで二回THFで、次いですすぎます。 注：ナフタレニ溶液が排出されるときに淡い光の茶色の色が変化します。 （おそらく金属ナトリウムを含む）、未使用ナフタレニドの溶液をゆっくりと前処理にイソプロパノールを添加することにより分解されなければなりません。 </li><li> 3時間トリクロロ酢酸（w / v）の20％を含む過酸化水素水（30％）で処理した試料を酸化します。ウォッシュ水とドライで。表面は現在、わずか茶色がかった外観を有します。注意：表面の大幅増加濡れ性の活性化と酸化の結果を。この発見は、以前は14について詳細に検討しました。 </li><li> 、2時間の乾燥THF中の50％（v / v）のヘキサメチレンジイソシアネート（HMDI）で酸化したディスクを扱うTHFで洗浄し、乾燥するために残します。 </li><li> 3時間とドライ - 2水にイソシアネートベアリングサンプルを加水分解する。注：最終的なアミノ官能化PTFE表面は、はるかに安定したイソシアネート含有サンプルよりも、さらにカップリングのための多くの標準的な架橋剤と互換性があります。 </li></ol> 2.ペプチド固定化<ol><li>炭酸塩緩衝液、pH 9を50mMで20％（v / v）のジエチレングリコールジグリシジルエーテル（ジエポキシド）の溶液を調製します。 </li><li>個別に24ウェルプレートにマークされた側を上にしてアミノ化ディスクを置き、エポキシド溶液1.5mlを追加します。サンプルの完全なカバレッジを確認してください。 2時間インキュベートし、2を洗います回水で一度炭酸緩衝液と。 </li><li>新鮮な24ウェルプレートの個々のウェルの底には、NaN 3 0.01％を含む50mM中の0.5mg / mlのペプチド（ 例えば 、REDV）炭酸緩衝液、pH 9の50μlを添加して、慎重にエポキシ官能ディスクの利点を置きます-downペプチド溶液の液滴上に（ すなわち 、ダウンサイドマークされています）。井戸の底とPTFEディスクとの間のスペースが完全に毛細管現象に濡らされていることを確認します。 </li><li>少なくとも3時間または一晩（底にウエットティッシュペーパーを配置することによって）加湿雰囲気で湿った室（ 例えば、タイトな閉鎖蓋を持つ任意の密封可能なプラスチックの箱）でインキュベートします。 注：REDVモチーフが同様に特徴付けみなすことができるものの、スクランブル又は逆転アミノ酸配列は、追加の陰性対照として含まれてもよいです。 </li><li>水で3回洗浄し、少なくとも30分間、50％イソプロパノール/水中で滅菌します。細胞播種、rinsに先立ち滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に試料を電子。 </li></ol> 3.細胞播種<ol><li>標準的な細胞培養手順17,18を使用したHUVECを成長させます。 </li><li> 24ウェルプレートで修正された面を上にして、ペプチドコンジュゲートのサンプルを置きます。コントロールとして、未処理のPTFEディスクを使用してください。 </li><li>シード5×10ウェルあたり2 mlの培地中で4 HUVECを、37℃で4時間、インキュベーター中、5％CO 2インキュベートします。 </li><li>ディスクを取り出し、付着していない細胞を除去し、新鮮な24ウェルプレートに転送するために慎重にすすいでください。新鮮な培地の2ミリリットルを加え、所望の期間インキュベート（ 例えば、24時間、1ワット、 など ）。 2日毎に培地に変更します。 </li><li>ジメチルスルホキシド（DMSO）に1mg / mlのカルセインAMのストック溶液を準備します。 </li><li>培地を除去し、細胞を成長させた後、PBSで洗浄し、1μL/ mlのカルセインAM染色（ 例えば、mlのPBSあたり原液の1μl）を含むPBSを追加します。静かに攪拌し、incubat暗所で45分間、37℃での電子。 </li><li>標準FITCフィルターを備えた蛍光顕微鏡で顕微鏡写真を取る（例：488 nmの、エム515 nm）をすぐにPBSで洗浄し。 100倍の倍率を使用してください。変更されていないだけでなく、処理された試料からの三連を実行します。 </li><li> ImageJソフトウェアを使用すると、細胞が定着領域を決定します。あるいは、手動で細胞数をカウントしたり、ImageJのを使用しています。どちらの方法でも、それぞれの表面上の細胞の付着と成長についての同様の情報を提供します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

PTFEの表面改質のプロトコルの詳細な説明は、図6に示されるようにポリマー主鎖からのフッ素の除去から始まる連続したステップで構成され、その結果、層は、共役炭素-炭素二重結合の豊富な量が含まれて形成されています。ナフタレニの処理時に開発濃い茶色がかった色に応じて。酸性の過酸化水素による標準的な酸化が淡褐色に明るくすることにより伴うヒドロキシル表面が、これは二重結合の損失を反映して得られます。このプロセスは、明らかに、IR分光法によって証明されます。 より一般的に適用可能な機能性を達成するために、ペンダントOH基は、第一級アミンへのNCO成分のジイソシアネートおよびその後の加水分解との単純な処理により、アミノ官能性に変換しました。アミン含有物質は、HIG一方、長期間保存することができるので、これは、有利ですHLY反応性イソシアネートは、空気湿度の非常に存在に対して感受性です。 ケアは、ナトリウムナフタレニとイソシアネートの両方が加水分解を非常に受けやすいためであっても、初期活性化ステップとHMDI処理中の水の微量の回避に注意しなければなりません。試料が完全に溶液中に浸漬されている標準的な手順とは対照的に、本プロトコルは、試薬の少量のみを必要とします。したがって、この方法は、高価なペプチドの多くを保存します。 アミン軸受面は、多くの生体分子の結合のための理想的な出発点です。この作業に用いられるジエポキシドは、いくつかの点で興味深いものです：「生理的に不活性」のジオールに水性環境中で加水分解され、親水性、比較的安価アミンおよび未反応のエポキシドに対して高度に反応性です。ただ1つの反応基が存在oがあるホモ二官能性架橋剤は、適切な試薬でありますNペプチドが固定化されます。これは、（これは頻繁に使用されるシーケンスRGDSについても同様である）のN末端にただ1つの一級アミノ基を含むREDVに適用されます。 （側鎖アミンとの）リジン残基を含むペプチドを結合の結果は、適切なカップリングが定義された方法では起こらないことを意味し、曖昧です。この場合、ヘテロ架橋剤（ 例えば 、アミンおよびチオール反応性）およびシステイン（N末端 ​​またはC末端）を含むペプチドを用いる戦略が役に立つ18です。 細胞接着性の観点から、ペプチドの固定化の結果は、（ 図3及び4）明白です。ほとんどの細胞は裸のPTFEに付着しないのに対し、REDV-変更は、材料に優れた細胞接着性基材をレンダリングします。この技術はまた、同様の結果を有する多孔性（拡大）PTFE（ 図5に適用可能であることは前述したプロトコルの準備作業のショーに相補的な</stroNG&gt;）。これは、材料の血管移植片は、で作られているので、これは特に重要です。主にプラズマ処理（プラズマ活性化13、プラズマ重合19）を利用する技術を表面とは対照的に、このプロトコルは、容易に入手可能な化学物質および実験室手順を使用することによって、高度に洗練された設備を回避することによってPTFEの共有結合的修飾のための指針を提供します。反応種（ 例えば 、ラジカル）が材料と接触した際に不活性化のために、これらの構造に浸透することができませんので、このような反応性プラズマ（ など 、O 2、NH 3、）およびプラズマ重合などのプラズマ方法は、多孔性構築物またはチューブの中には適用されません表面。例えば、小口径​​人工血管（直径&lt;5ミリメートル）は、この方法で処理することはできません。これとは対照的に、湿式化学によって、装置の形状に関する制限はありません。このように、endothの形成を可能にすることにより、ePTFEの血管移植片、血栓形成および長期開存の腔側にelial層を向上させることができます。また、外科ヘルニアメッシュの細胞接着面は、より良好な組織統合をもたらすと考えられます。

いくつかを言及するためにいくつかの時間のために承認されている医学で使用される様々なポリマー強化された生体適合性を示さない、 すなわち 、細胞接着性の欠如、線維性カプセル化および血栓形成の誘導、。生体材料および生物学的システムとの間の相互作用は、主にインプラントの表面で起こります。その結果、研究は影響を受けない材料のバルク特性を残したまま、所望の用途に適切な特性を作成するために、表面改質に焦点を当てています。ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、生理学的に不活性なポリマーは、例えば、ヘルニア手術用メッシュ1、医療用ポート2のような多くの医療分野で使用されているように、最も重要なのは、血管移植片3。 特に血液に接触状況でPTFEの疎水性は、多くの場合、thrombotiその結果、非特異的血漿成分の吸着と結果の血小板接着としての原因となりますCイベントや移植片4の閉塞。さらに、PTFEは、ほとんどのポリマーのように、望ましい特徴は、血管移植片5の内側（管腔）表面上の内皮細胞（EC）の有益な層の形成を誘導することであろう細胞接着とカバレッジをサポートしていません。バイオミメティック内皮は、特にその抗血栓特性6、その自然同等の機能の多くを果たすことが期待されます。一般的なバイオミメティック修正戦略はバルク特性が影響を受けない材料を残しながら、もっぱら細胞接着性を有する材料を持たせるという概念に基づいています。また、血小板粘着、抗接着剤（防汚）7属性を組み込むことによって減少させることができます。種々のペプチド-主に細胞外マトリックスのタンパク質に由来する-は強くインテグリン8のクラスに属し、細胞受容体に結合することによって細胞接着を増強することが記載されています。ありますこの点の例をST知らほとんどの細胞型と相互作用するペプチドするArg-Gly-Asp（RGD）です。他のアミノ酸配列は、排他的に特定の細胞に発現インテグリンによって認識されます。例えば、Argの-のGlu-ASP-ヴァル（REDV）およびTyr-Ileの-Glyを-のSer-Argの（YIGSR）は、特定の方法9でのECに結 ​​合することが見出されてきました。このようなペプチドの共有結合固定化は、金属およびポリマー10,11を含む、本質的に非接着性材料の過剰に行われています。 多孔質PTFE、より正確には延伸PTFE（ePTFEの） -ポリエチレンテレフタレート（PET）と一緒に-血管移植片12を製造するための最も重要な材料です。このようなプラズマ改質13として、または光化学的方法14による適切な治療のために確立された物理的な技術は、多孔性および/ ​​または管状の構造は、それぞれの孔または管腔内容易に治療可能ではないという事実によって妨げられています。湿式化学PTFEであるため、ほとんどの化学的攻撃15に抵抗する含フッ素重合体の高度に不活性な性質のために困難な作業です。 本稿では、共有結合修飾戦略の​​比較的容易な方法を説明します。結合可能なPTFEをレンダリングする手順から適応、官能基は、生物学的に活性な分子のさらなる結合のためのアンカーポイントとして機能する材料の表面上に作成されました。

<table><tbody><tr><td>PTFE foil 0.5 mm</td><td>Cadillac Plastic&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>REDV peptide</td><td>Genecust</td><td>n/a</td><td>custom synthesis &gt;95% purity</td></tr><tr><td>iso-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34965</td><td></td></tr><tr><td>tetrahydrofurane (THF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>molecular sieve 3 &amp;Aring;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208574</td><td></td></tr><tr><td>sodium metal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>483745</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>naphthalene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>147141</td><td></td></tr><tr><td>hydrogen peroxide 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95321</td><td></td></tr><tr><td>trichloroacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>diethylene glycol diglycidyl ether</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17741</td><td></td></tr><tr><td>hexamethylene diisocyanate (HMDI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52650</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56496</td><td></td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>24 well plates</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662 160</td><td></td></tr><tr><td>ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850</td><td>&amp;nbsp;Nicolet</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence microscope Olympus X-70</td><td>Olympus</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>humbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ePTFE vascular graft</td><td>Gore</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

wet chemistry and peptide immobilization on polytetrafluoroethylene for improved cell-adhesion

細胞接着性を有する材料表面を持たせることは生体材料研究と組織工学における一般的な戦略です。これは、これらの材料が新たに合成されたポリマーの導入に関連した十分に特徴づけおよび法的問題を回避することができるされているので、医療に長年の使用を持っている既に承認されたポリマーのために特に興味深いです。ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）は、血管移植片の製造のために最も頻繁に用いられる材料の一つであるが、ポリマーの機能を促進、細胞接着を欠いています。内皮化、 すなわち、内皮細胞の融合層と移植片内面の完全なカバレッジは、主に人工的なインターフェイスの血栓形成を低減することにより、最適なパフォーマンスにキーをみなされています。 この研究は、ペプチド修飾PTFE上の内皮細胞の成長を調査し、未修飾基材上に得られたものと、これらの結果を比較します。とのカップリング内皮細胞接着ペプチドのArg-Gluの-ASP-ヴァル（REDV）は、後続の結合工程に続いて、試薬ナトリウムナフタレニドを使用して、含フッ素重合体の活性化を介して行われます。細胞培養は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を用いて達成され、ペプチド固定化材料の優れた細胞増殖は、2週間の期間にわたって示されています。

重要な化学反応工程の結果は、IR分光法（ 図1）によりモニターしました。マイナー程度まで - - OH-機能ナトリウムナフタレニドとの最初の活性化は、二重結合を生成します。信号を示すC = C結合は、ほぼ独占的にヒドロキシル基を有する表面が得られる、酸化により消滅します。さらに、標準的なコンジュゲーション工程の分析はここでは示されていません。活性化および酸化による色の変化が使用されると予想化学と一致する。共役二重結合系は、（ 図2）を明るくに、その損失をもたらす茶色がかったことが期待されます。また、表面形態の活性化及び酸化の可能な結果は、走査型電子顕微鏡を用いて調べました。事実上、治療の有害な影響は（ 図2）は観察されませんでした。 3及び図 4は、内皮細胞増殖に対するREDV、固定化の結果を示します。実質的には、細胞接着および増殖が未処理材に発生していないのに対し、修正が強く2週間にわたってコロニー形成をサポートしています。臨床応用（ すなわち、血管移植片）について例示し、修正は同じ一週間（ 図5）の期間にわたって、同様の結果を有する延伸PTFE製の市販のグラフトから元の材料で行いました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig1.jpg" /> 自然のままのPTFE（A）の二重結合の形成およびヒドロキシ機能（B）のある程度の結果のPTFE。治療の 図1. IR分光法 。続いてC = C結合が酸化による（Cに還元されます</stroNG&gt;）。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54272/54272fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig2.jpg" /> 裸の表面活性化したPTFEの 図2. 光学外観。（A）未処理のPTFEは（左）白色に見えるのに対し、ナトリウムナフタレニを使用して、活性化は、わずか（右）酸化時に明るくなる濃い茶色がかった色（真ん中）が得られます。未処理の（B）およびPTFE（C）サンプルをさらに走査型電子顕微鏡（倍率2,000X）を用いて検討した酸化。ディスクは直径12mmである。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54272/54272fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 自然のままのペプチドで修飾されたPTFE上 図3. 内皮細胞培養。ペプチド修飾材料上の接着と成長が大幅に強化されているのに対し、未処理の試料は電気部品（A、C、24時間後E、1ワットと2それぞれワット）によって植民地化されていません（それぞれW 24時間W 1及び2後のB、D及びF）。スケールバー：100μmであり、倍率100X <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54272/54272fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig4.jpg" /> ImageJの解析によるセルカバレッジの 図4. 定量。裸PTFE（A、C上の細胞の成長、E）およびREDV共役系高分子の表面に（B、D、F）は総面積の割合のカバレッジとして表現。固定化ペプチドは明らかに初期接着（B）を可能にし、2週間の期間（D、F）上でコロニー形成をサポートしています。 ）平均±標準偏差、決定をトリプリケート。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54272/54272fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig5.jpg" /> 図5. 内皮細胞は、延伸PTFEで1週間増殖させた。ePTFEの構造は、走査型電子顕微鏡（A）を用いて示されています。多孔質材料で得られた結果は、平らなPTFEの試料について得られたものと一致しています。見つかったいくつかの細胞とは対照的に裸の材料（B）に修正された表面（C）は 、細胞増殖のための優れた基板を提供します。スケールバーはそれぞれA、BとCのために100μmである。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54272/54272fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig6.jpg" /> ナトリウム-ナフタレニ処理によって生成された図6 の湿式化学を使用してPTFEの化学修飾の模式図。二重結合は、OH、官能基を生じる酸化されます。ヒドロキシル反応ジイソシアネートは、その後、固定化し、アミンに加水分解されます。最後に、二官能性ジエポキシドは、N末端 ​​アミノ基を使用して、REDVペプチドを結合するために適用されます。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54272/54272fig6large.jpg" target="_blank">Vにはこちらをクリックしてください</a>この図の拡大版をIEW。

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Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

改善された細胞接着のためのポリテトラフルオロエチレンにウェットケミストリーおよびペプチドの固定化

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.7K ビュー.  Sidra Cardiovascular Research. Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

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Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large variety of PEG molecular weights and configurations (arm number, arm length, and branching pattern) affords researchers tight control over resulting hydrogel structures and properties, including Young&#8217;s modulus and mesh size. This video will illustrate a rapid, efficient, solvent-free, microwave-assisted method to methacrylate PEG precursors into poly(ethylene glycol) dimethacrylate (PEGDM). This synthetic method provides much-needed starting materials for applications in drug delivery and regenerative medicine. The demonstrated method is superior to traditional methacrylation methods as it is significantly faster and simpler, as well as more economical and environmentally friendly, using smaller amounts of reagents and solvents. We will also demonstrate an adaptation of this technique for on-resin methacrylamide functionalization of peptides. This on-resin method allows the N-terminus of peptides to be functionalized with methacrylamide groups prior to deprotection and cleavage from resin. This allows for selective addition of methacrylamide groups to the N-termini of the peptides while amino acids with reactive side groups (e.g.&#160;primary amine of lysine, primary alcohol of serine, secondary alcohols of threonine, and phenol of tyrosine) remain protected, preventing functionalization at multiple sites. This article will detail common analytical methods (proton Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (;H-NMR) and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight mass spectrometry (MALDI-ToF)) to assess the efficiency of the functionalizations. Common pitfalls and suggested troubleshooting methods will be addressed, as will modifications of the technique which can be used to further tune macromer functionality and resulting hydrogel physical and chemical properties. Use of synthesized products for the formation of hydrogels for drug delivery and cell-material interaction studies will be demonstrated, with particular attention paid to modifying hydrogel composition to affect mesh size, controlling hydrogel stiffness and drug release.

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

This video will illustrate a rapid, efficient method to methacrylate poly(ethylene glycol), enabling chain polymerizations and hydrogel synthesis. It will demonstrate how to similarly introduce methacrylamide functionalities into peptides, detail common analytical methods to assess functionalization efficiency, provide suggestions for troubleshooting and advanced modifications, and demonstrate typical hydrogel characterization techniques.

マイクロ波支援ポリの機能化（エチレングリコール）と連鎖重合で使用するためには樹脂ペプチドおよびヒドロゲル形成

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

化学

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

生化学

Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. Compared to other analytical separation techniques, such as chromatography, CE is cheap, robust and effectively requires no sample preparation (for a number of complex natural matrices or polymeric samples). CE is fast and can be used to follow the evolution of mixtures in real time (e.g., chemical reaction kinetics), as the signals observed for the separated compounds are directly proportional to their quantity in solution.
Here, the efficiency of CE is demonstrated for monitoring the covalent grafting of peptides onto chitosan films for subsequent biomedical applications. Chitosan&#39;s antimicrobial and biocompatible properties make it an attractive material for biomedical applications such as cell growth substrates. Covalently grafting the peptide RGDS (arginine - glycine - aspartic acid - serine) onto the surface of chitosan films aims at improving cell attachment. Historically, chromatography and amino acid analysis have been used to provide a direct measurement of the amount of grafted peptide. However, the fast separation and absence of sample preparation provided by CE enables equally accurate yet real-time monitoring of the peptide grafting process. CE is able to separate and quantify the different components of the reaction mixture: the (non-grafted) peptide and the chemical coupling agents. In this way the use of CE results in improved films for downstream applications.
The chitosan films were characterized through solid-state NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy. This technique is more time-consuming and cannot be applied in real time, but yields a direct measurement of the peptide and thus validates the CE technique.

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

リアルタイムでのキトサンフィルム上にペプチドグラフトを監視するためのキャピラリー電気泳動

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

組織工学のための熱応答性ナノ構造表面の調製

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

生物工学

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and surfaces. For a true single molecule experiment, covalent attachment of the probe molecule is essential because only then can hundreds of force-extension traces with one and the same single molecule be obtained. Many traces are in turn necessary to prove that a single molecule alone is probed. Additionally, passivation is crucial for preventing unwanted interactions between the single probe molecule and the AFM cantilever tip as well as between the AFM cantilever tip and the underlying surface. The functionalization protocol presented here is reliable and can easily be applied to a variety of polymers. Characteristic single molecule events (i.e., stretches and plateaus) are detected in the force-extension traces. From these events, physical parameters such as stretching force, desorption force and desorption length can be obtained. This is particularly important for the precise investigation of stimuli-responsive systems at the single molecule level. As exemplary systems poly(ethylene glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) and polystyrene (PS) are stretched and desorbed from SiOx (for PEG and PNiPAM) and from hydrophobic self-assembled monolayer surfaces (for PS) in aqueous environment.

Covalent attachment of probe molecules to atomic force microscopy (AFM) cantilever tips is an essential technique for the investigation of their physical properties. This allows us to determine the stretching force, desorption force and length of polymers via AFM-based single molecule force spectroscopy with high reproducibility.

AFMベースの力分光法のための単一分子の共有結合

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

生理活性タンパク質や生物学的応用の光化学ハイドロゲルのペプチドをパターニング

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, improving the biocompatibility of metal stents remains a significant challenge. The goal of this protocol is to describe a robust technique of metal surface modification by biologically active peptides to increase biocompatibility of blood contacting medical implants, including endovascular stents. CD47 is an immunological species-specific marker of self and has anti-inflammatory properties. Studies have shown that a 22 amino acid peptide corresponding to the Ig domain of CD47 in the extracellular region (pepCD47), has anti-inflammatory properties like the full-length protein. In vivo studies in rats, and ex vivo studies in rabbit and human blood experimental systems from our lab have demonstrated that pepCD47 immobilization on metals improves their biocompatibility by preventing inflammatory cell attachment and activation. This paper describes the step-by step protocol for the functionalization of metal surfaces and peptide attachment. The metal surfaces are modified using polyallylamine bisphosphate with latent thiol groups (PABT) followed by deprotection of thiols and amplification of thiol-reactive sites via reaction with polyethyleneimine installed with pyridyldithio groups (PEI-PDT). Finally, pepCD47, incorporating terminal cysteine residues connected to the core peptide sequence through a dual 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl spacer, are attached to the metal surface via disulfide bonds. This methodology of peptide attachment to metal surface is efficient and relatively inexpensive and thus can be applied to improve biocompatibility of several metallic biomaterials.

Presented here is a protocol for appending peptide CD47 (pepCD47) to metal stents using polybisphosphonate chemistry. Functionalization of metal stents using pepCD47 prevents the attachment and activation of inflammatory cells thus improving their biocompatibility.

CD47由来ペプチド固定化による金属インプラントへの血液媒介性細胞の取り付けの軽減

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

細胞接着および形態学のための生体機能的自己組織化ペプチドの評価

Fabrication and Characterization of Colorectal Cancer Organoids from SW1222 Cell Line in Ultrashort Self&#45;Assembling Peptide Matrix

Ultrashort self-assembling peptides (SAPs) can spontaneously form nanofibers that resemble the extracellular matrix. These fibers allow the formation of hydrogels that are biocompatible, biodegradable, and non-immunogenic. We have previously proven that SAPs, when biofunctionalized with protein-derived motifs, can mimic the extracellular matrix characteristics that support colorectal organoid formation. These biofunctional peptide hydrogels retain the original parent peptide's mechanical properties, tunability, and printability while incorporating cues that allow cell-matrix interactions to increase cell adhesion. This paper presents the protocols needed to evaluate and characterize the effects of various biofunctional peptide hydrogels on cell adhesion and lumen formation using an adenocarcinoma cancer cell line able to form colorectal cancer organoids cost-effectively. These protocols will help evaluate biofunctional peptide hydrogel effects on cell adhesion and luminal formation using immunostaining and fluorescence image analysis. The cell line used in this study has been previously utilized for generating organoids in animal-derived matrices.

著者スポットライト:結腸直腸癌オルガノイドのための超短ペプチドマトリックスの最適化

This protocol aims to evaluate biofunctional self-assembling peptides for cell adhesion, organoid morphology, and gene expression by immunostaining. We will use a colorectal cancer cell line to provide a cost-effective way of obtaining organoids for intensive testing.

超短自己組織化ペプチドマトリックス中のSW1222細胞株由来結腸直腸癌オルガノイドの作製とキャラクタリゼーション

Ultrashort self-assembling peptides (SAPs) can spontaneously form nanofibers that resemble the extracellular matrix. These fibers allow the formation of ...