Name: a simple dewar/cryostat for thermally equilibrating samples at known temperatures for accurate cryogenic luminescence measurements
Uploaded: 2016-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Dewar/Cryostat for Thermally Equilibrating Samples at Known Temperatures for Accurate Cryogenic Luminescence Measurements at JoVE.com

本研究の支援のための芸術と科学とコンコルディア大学の学長のオフィスの学校の学部長のオフィスを承認する喜びです。 作者は、この調査への彼の多くの貢献のためのGAクロスビーに感謝したいです。

極低温分光法1.試料の調製と読み込み<ol><li>適切な溶媒中で発光発色団の〜10 -3〜10 -4 M溶液を〜3ミリリットルを準備します。 注：多くの溶媒を用いることができるが、水および種々のアルコール系溶媒（ 例えば 、エタノール、エタノール/メタノールの混合物、エチレングリコール、及びグリセロール）が低温の作業の溶解性、表面張力特性の優れた組み合わせを提供します。 </li><li>爪の周りに直径0.4ミリメートル〜裸銅線の長さをねじることにより、サンプルループを準備するか、編組銅線の〜30ミリメートルストレート長さが続く直径シングルループ〜3ミリメートルを与えることをねじ込みます。 </li><li>指の油や他の汚染物質を除去し、乾燥させるために95％エタノールでサンプルループをすすぎます。ループの清浄度を確保するために、蒸留水で二、硝酸を有する第1すすぎ、最後にエタノール。 </li><li>第浸漬してサンプルループにサンプル溶液をロード溶液の表面張力をさせる試料溶液（ステップ1.1）にEループは、ループ内の溶液の薄膜を保持します。 </li><li>すぐに眼の保護（安全ゴーグル）と手の保護（手袋）を使用するように注意しながら、ループ内の薄膜試料溶液を凍結し、安定させるために液体窒素中にロードされたサンプルループを浸します。 </li></ol> 2.熱電対の準備、アライメントやセットアップ<ol><li>サンプルジャンクショ​​ンと標準：2つの銅 - コンスタンタン接合を形成することにより絶縁されていない0.4ミリメートルの直径の銅線と0.4ミリメートルの直径絶縁されていないコンスタンタン（銅ニッケル合金）ワイヤーの1の長さの2つの長さから、銅 - コンスタンタン（タイプT）の熱電対を準備基準接点（0 ℃の氷/水混合物）。 注：接合は銀を一緒にはんだ付けすることができるが、接合部を形成するために一緒に銅とコンスタンタン線をねじるために完全に満足のいくものです。 <ol><li> togeth銅とコンスタンタン線をクランプ〜90°の角度でラジオペンチでえー。 2本のワイヤをしっかり引っ張りながら、ぴったりと五から六ターンのためにそれらを一緒に三つ編み。 </li></ol></li><li>彼らは2接合部以外での任意の時点では触れないように、すべての熱電対の配線を配置します。熱電対ワイヤは薄い絶縁被膜で覆われている場合は、タッチして接合以外の点もよいです。 <ol><li>絶縁された熱電対ワイヤを使用する場合は、電圧計の端子と接合部との電気接点が形成され、ワイヤの端部の絶縁を削り取ります。配線上に絶縁材料が発光していないことを確認するように注意してください。選択された波長の光でサンプルループ内の絶縁電線の小片、エキサイティングなサンプルを配置し、何のサンプルが存在しないときに発光信号を探すことにより、スプリアス発光の潜在的な供給源としての熱電対線の絶縁をテストします。 </li></ol></li><li> SAMからの2つの銅の熱電対線を接続ハイインピーダンス51/2桁デジタル電圧計の入力端子にPLEと基準接点。 </li><li> 0°Cの水/氷浴中で試料と基準接点の両方を配置し、電圧計をゼロ。 </li><li>適切な高さと励起光ビームの方向と一致するようにロードされたサンプルループと液体窒素で満たされた光学デュワー内の熱電対のサンプルの接合部を合わせます。熱電対接合部とできるだけ一緒に近く、デュワーで正確に​​同じ高さでサンプルループを保管してください。 </li></ol>光デュワー3.一般的な機械のサポートとサンプルループのアラインメントと熱電対ジャンクショ​​ン<ol><li>合わせて、光学デュワー内の所望の高さでサンプルループを保持するために、直径5mmのx 30ミリメートルの長さの木のダボに小さな電気ワニ口クリップを取り付けることによって、調整可能な高保持クランプを準備します。 <ol><li> snuglに合ったコルクで5ミリメートルの直径よりもわずかに小さい穴を産ん光学デュワーの上部にyの。ワニ口クリップでサンプルループの編組線部をクランプし、その後デュワー内の所望の試料の高さを達成するためにコルクで上下にダボをスライドさせます。 </li></ol></li><li>光学デュワー内の所望の高さで熱電対接合部を整列させ、保持するために、別の5 mmの直径の木のダボを使用しています。それはダボの底下の10〜20ミリメートルをはみ出すように、熱電対接合部を合わせます。ダボの両側に銅とコンスタンタン線を合わせ、しっかりと所定の位置にこれらのワイヤを保持するために12.5ミリメートル幅のポリテトラフルオロエチレン（PTFE）配管工のテープでしっかりと包みます。 </li><li>この第二のダボを収容し、サンプルループの近くに熱電対接合部の垂直方向の高さ調整を可能にするためにデュワーの上部にあるコルクにある直径5ミリメートルよりもわずかに小さい別の穴を産みました。 </li><li>窒素ガスのボイルオフベントホールとして機能するようにデュワーの上部にあるコルクにある第三の小さな穴を産みました。 </li></ol><pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 4。光デュワー内の温度依存性の極低温分光<ol><li>電子機器がウォームアップすることを可能にするために、事前にCCDの分光器は、少なくとも1時間上のすべての電子機器の電源をオンにし、ペルチェ冷却CCDカメラは、安定した動作温度に到達します。 </li><li>ウォームアップ期間が終わった後、波長は原子輝線またはバンド知らシリーズに対するCCD分光器を校正します。既知の波長帯域を放出低圧原子発光ランプのスペクトルを測定し、既知の帯域波長のバンドによって活性化されるCCDの画素数を関連付けます。 注：本研究で用いたアンドールのCCD分光器を含むほとんどの近代的なCCD分光器では、波長校正処理はソフトウェアで自動化されています。 <ol><li>強度は密接に3200 Kのblaを近似ランプ、既知のスペクトルプロファイルに3200 Kで動作する石英ハロゲンランプのスペクトルを測定し比較することによって、分光器を校正しますckの本体。 </li></ol></li><li>励起光は、ループ内の試料に当たっており、試料から放出された光は、CCD、分光器の入射スリット上に収集し、衝突していることを保証するために、励起および発光光学系を予備整列させます。 注：これは、二段階の機械的なプロセスです。最初のステップは、発光シグナルがCCDによって検出されるように、分光器の入射スリットに照射光を得るために、光学系の初期粗アライメントです。第二段階は、励起光ビーム、デュワー、ループ内の試料自体、及び発光集光光学素子の位置を系統的に調整することにより、サンプルの発光信号強度の慎重な最適化で構成されています。 </li><li> 4.3で説明したように光学系が整列し、最適化された後、サンプルの77 Kの液体窒素の基準発光スペクトルを測定します。このスペクトルは、その銅線ループで凍結薄膜試料、目を確保しますループに隣接ermocouple、デュワー、励起光、及び発光集光光学系は、全ての最終的な最適化された位置にあり、サンプルは完全に液体窒素で覆われています。 </li><li>ちょうど接合があるサンプルとしてPTFEテープに包まれた電線と木のダボに熱電対の基準接点を設定します。これは、基準接点を保護し、望ましくないワイヤ接触を防止します。 </li><li> 0℃基準の熱電対接合部を水 - 氷スラッシュに浸漬されていることを確認します。頻繁に基準接点における氷のレベルを確認してください。氷が融解する速度を低減するために、小さな、広口実験室デュワーに基準接点を設定します。 </li><li>タイプT銅 - コンスタンタン熱電対のためにリストされている77 Kで文学電圧に対して77 Kで測定された熱電対の電圧を確認してください。 2熱電対の電圧が非常に近い合意でなければなりません。圧力のための適切な修正を行い（ 例えば 、クラウジウス-クラペイロンEQUAを使用して、ン）大気圧が1気圧未満である場合。 </li><li>液体窒素をゆっくりと沸騰することを可能にします。 注：サンプルの液体窒素のレベルとの間の距離hが徐々に液体窒素の沸騰の結果として増加するように、試料の温度は（数時間かけて）ゆっくりと上昇します。デジタル電圧計は、サンプルの熱電対接合部が完全に冷たい窒素蒸気中に浸漬されているため、正確な温度測定を提供し、この温度上昇に応答します。 </li><li>瞬間的にオンまたは励起光のブロックを解除し、製造業者のプロトコルを使用して、発光スペクトルを取得するためのCCD分光器を使用しています。それはほんの数秒かかるように、スペクトルデータの取得処理が最適化されるべきです。 <ol><li>ただ、すぐにデータ収集プロセスが不要な励起光誘起サンプル光化学および/または励起光に起因する誤差を最小限にするために終了したように励起光をオフにするか、再ブロックサンプル加熱を誘発。 </li><li>スペクトルデータ取得間隔の開始時と終了時の熱電対の電圧を記録します。熱電対電圧は、スペクトルデータが所定の温度で取得された上で、非常に短い時間間隔（〜1-10秒）の間（0.0から0.1 K以内、すなわち 、関連する温度変化ΔT）をかなり変更しないでください。電圧テーブル対タイプT銅 - コンスタンタンの温度を参照することにより、温度による電圧測定値に変換します。 </li></ol></li><li>試料温度がこれらの温度依存スペクトル測定の過程で光学、エレクトロニクスや励起光強度の変更を加えない〜5 K.によって増加した場合、液体窒素は別のスペクトルを継続するために沸騰し、測定を許可します。 注意：光学デュワーの品質に応じて、このウォームアッププロセスは、5から〜5 K間隔あたり15分にかかります。 </li><li>強度正しい減算することにより、CCDスペクトルデータセットはダークフレーム強度（ すなわち 、入射スリットがブロックされたときのCCDにより記録されたスペクトル強度）と波長依存スペクトル応答を占めています。各試料スペクトルからベースラインダークカウント強度カウントレベルを引きます。 <ol><li>それぞれの検体の測定された強度を補正するような3200 Kタングステンハロゲン標準ランプのような既知の強度の標準の強度を測定し、測定された強度に公知の強度の比を用いて、波長依存のスペクトル応答の正しいです波長。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Baker, D. C., Crosby, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+and+magnetic+evidence+for+multiple-state+emission+from+tris(2,2'-bipyridine)ruthenium(II)+sulfate.">Spectroscopic and magnetic evidence for multiple-state emission from tris(2,2'-bipyridine)ruthenium(II) sulfate.</a> Chem. Phys. 4 (3), 428-433 (1974).</li><li>Crosby, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+investigations+of+excited+states+of+transition+metal+complexes.">Spectroscopic investigations of excited states of transition metal complexes.</a> Acc. Chem. Res. 8 (7), 231-238 (1975).</li><li>Hager, G. D., Watts, R. J., Crosby, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+transfer+excited+states+of+ruthenium(II)+complexes+II.+Relationships+of+level+parameters+to+molecular+structure.">Charge transfer excited states of ruthenium(II) complexes II. Relationships of level parameters to molecular structure.</a> J. Am. Chem. Soc. 97 (24), 7037-7042 (1975).</li><li>Elfring, W. H., Crosby, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excited+states+of+mixed-ligand+chelates+of+ruthenium(II)+and+rhodium(III).">Excited states of mixed-ligand chelates of ruthenium(II) and rhodium(III).</a> J. Phys. Chem. 80 (20), 2206-2211 (1976).</li><li>Elfring, W. H., Crosby, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excited+states+of+mixed-ligand+chelates+of+ruthenium(II).+Quantum+yield+and+decay+time+measurements.">Excited states of mixed-ligand chelates of ruthenium(II). Quantum yield and decay time measurements.</a> J. Am. Chem. Soc. 103 (10), 2683-2687 (1976).</li><li>Fordyce, W. A., Rau, H., Stone, M. L., Crosby, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+state+emission+from+rhodium(I)+and+iridium(I)+complexes.">Multiple state emission from rhodium(I) and iridium(I) complexes.</a> Chem. Phys. Lett. 77 (2), 405-408 (1981).</li><li>Pankuch, B., Crosby, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+measurements+of+solutions+and+rigid+glasses.">Spectroscopic measurements of solutions and rigid glasses.</a> Chem. Instrum. 2 (3), 329-335 (1970).</li><li>Landee, C. P., Greeney, R. E., Lamas, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+helium+cryostat+for+a+vibrating+sample+magnetometer.">Improved helium cryostat for a vibrating sample magnetometer.</a> Rev. Sci. Instrum. 58 (10), 1957-1958 (1987).</li><li>Fairman, R. A., Spence, K. V. N., Kahwa, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+liquid+nitrogen+gas-flow+cryostat+for+variable+temperature+laser+luminescence.">A simple liquid nitrogen gas-flow cryostat for variable temperature laser luminescence.</a> Rev. Sci. Instrum. 65 (2), 503-504 (1994).</li><li>Meyer, G. D., Ortiz, T. P., Costello, A. L., Kenney, J. W., Brozik, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+fiber-optic+coupled+luminescence+cryostat.">A simple fiber-optic coupled luminescence cryostat.</a> Rev. Sci. Instrum. 73 (12), 4369-4374 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

低温発光分光分析のために、この装置の開発が必要に迫られて生まれました。関心のある発色団を含有し、酸素で過飽和溶液は、凍結したロードされ、すべてのデュワー/クライオスタットサンプル温度が十分に定義された設計、安定、そしてゆっくりと変更可能で瞬時に分析法のために配置することができることが重要でした。事実上すべての市販のクライオスタットは、これらの実験の制...

極低温ドメイン内では、発光分子の電子発光スペクトルと発光寿命の温度依存性の研究は、これらの分子の励起電子状態とこれらの状態から生じる光化学および光物理現象に関する豊富な情報を提供しています。ルテニウム（II）、ロジウム（I）、およびロジウム（III）のクロスビーと共同研究者の先駆的な温度依存性の光物理調査1,10-フェナントロリン、2,2&#39;-ビピリジン錯体、他の配位子がよく例証構造、対称性、エネルギー論、および発光励起電子状態のマニホールドの化学的挙動を解明するために、温度依存性分光法の本来のパワー。1-6 しかし、よく温度依存極低温分光法を行うためには、些細な問題ではありません。これは、熱的にEQUではない分光尋問中のサンプルのため、あまりにも簡単です。<html> ilibratedしたがって、温度勾配を横切って、広い温度範囲を明示すること。得られた測定されたスペクトルは、実際に、温度範囲にわたって放射の重ね合わせです。また、この温度範囲にわたるでも平均気温は、試料に上または近くに配置された温度プローブ（ 例えば 、熱電対や抵抗温度デバイス）の読み出しとは全く異なる場合があります。時間になるとこのように、温度依存性の低温分光法を実行することは正しく調整可能な、試料温度が知られている実験条件の確立を必要とする、安定、均一、かつ。これらの条件は非常に控えめなCCD分光器から成る装置、励起光源、光学デュワー、簡単な、直接的な実験プロトコルの下で動作する熱電対（ 図1参照）を用いて達成することができます。 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 54267 / 54267fig1.jpg &quot;/&gt; 図低温分光法1.発光分光セットアップこの上面図に示すように、システムが含まれています。（。）CCD検出器、分光器、入口スリットやフィルタ、（D）発光集光光学系（B）（C。） 、（E）レーザーまたはアークランプ励起源、（fは）励起ビームは、（G）XYZ変換の溶融シリカ光学デュワーは、（時間）マウント熱電対サンプル接合を、（I）試料、（J 。）、熱電対の基準接点：0°C = 273.15 K氷/水浴、（k）のデジタル電圧計。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54267/54267fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> サンプルの片側は、試料の反対側ながら極低温「コールドフィンガー」面と物理的に接触するように配置されている場合は、サンプル中の望ましくない熱勾配と誤った平均サンプル温度が生じることはほとんど確実です真空中です。完全なサンプルが均一な測定可能な温度Tであることを保証するための最も実用的な方法は、 完全に温度T（ 例えば 、液体窒素や液体ヘリウム）で、または温度Tでの低温蒸気で極低温液体中のサンプルおよび温度プローブを浸漬することです（ 例えば、低温窒素または冷たいヘリウム蒸気）。可変温度クライオスタットは、所望の低温試料温度を達成するために、電気抵抗加熱と低温流体の流れのバランスをとることで、一定の温度サンプル環境を実現する。7-9熱交換ガスは、試料温度が均一であることを確認するために使用され得ます。アイデアは、順番にクライオスタットと熱平衡状態にある交換ガスと熱平衡でサンプルを持つことです。クライオスタットの設計は、それが単にの液面より上の試料の高さHを調整することにより、種々の温度での試料の熱平衡を達成する浮上していますストレージデュワー内の寒剤10サンプルを励起し、発光を光ファイバケーブルやレンズ系を介して検出されます。与えられたサンプル/プローブの高さhで、寒剤蒸気温度は、（蒸気、 すなわち 、デュワーがスムーズに熱勾配のdT / DHを提供&gt; 0）T（H）およびhの増加に伴って、この温度上昇である。上記の寒剤ガス効果中の液体は、交換ガスとなります。 hで小さなサンプルおよび温度プローブを配置することは、T（H）で試料の熱平衡を保証します。試料温度を増加させるために、 時間が増加します。試料温度を低下させるために、 時間が減少します。そのようなクライオスタットの低温限界は、この低い温度限界は、圧力を低下させることによってさらに減少させることができる時間 = 0での液体寒剤の温度です。大規模なストレージデュワー（ 例えば 、100-L液体ヘリウムデュワーまたは10-L液体窒素デュワー）、寒剤ボイルオフRATEは、このように試料温度における既知の調整になるための液体寒剤上記のサンプル高さhでの調整を可能にする分光測定の一連の時間枠の間にごくわずかです。 遷移金属錯体からの発光の酸素によって誘発される焼入れの温度依存性のこの研究室で分光調査は77から300 Kの範囲内の液体窒素を用いて温度可変分光研究のための小さな溶融シリカの適応光学デュワーにつながった（参照図2）。 <img alt="図2" fo:display-align="middle" src="/files/ftp_upload/54267/54267fig2.jpg" /> 温度可変（77から300 K）極低温発光分光図2.溶融石英光デュワーセットアップ。光デュワーのこの図は、完全な温度可変システムを示しています。 （。）、液体窒素、（B。）のtransparent（4.0センチ）デュワーデュワーの、（C）銅サンプルループ、（D）熱電対接合部、（E）銀色地域のunsilvered光アクセス領域、（F）ワニ口クリップ、（G。）木のダボ、 （H）、距離、液体窒素のレベルと試料の間に、内側と外側のデュワー壁との間に（I。）避難地域、（J。）コルク栓、（K。）、窒素ガス通気孔、（L。）熱電対の配線、（メートル。）熱電対線分離し、PTFEテープで木のダボに固定。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54267/54267fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 溶融シリカは、非発光であり、目に見える、とのうち近赤外（〜200〜2000 nm）を介して、近紫外から高い光透過率を提供します。大規模なストレージデュワーシステムで動作する基本的な概念は、以前に10、液体寒剤上記のサンプルの高さは、試料温度を決定する場合について説明し、成功裏に持ち越されましたこの小さな光デュワーを使用して小規模。しかし、代わりに機械的試料温度T、デュワー自体に対する試料位置を調整するために、静止液体寒剤レベルより上の試料の高さHを調整するの固定（ 図2）です。数時間の期間にわたって光デュワー内の液体窒素のオフ遅い沸騰は徐々に下降する液体窒素のレベル（ 図3）上記のサンプルの距離hを増加させます。 <img alt="図3" fo:display-align="middle" src="/files/ftp_upload/54267/54267fig3.jpg" /> 図3. 閉じる光デュワーのサンプル領域のアップ 。気温：サンプルは、T 0 = 77 Kを与えるために、レベルh 0に液体窒素中に浸漬し、レベルhにおける低温窒素蒸気中に浸漬した試料1 &lt;H 2 &lt;H 3 &lt;/サブ&gt;サンプルの温度T 1 &lt;T 2 &lt;T 3を与えるために、液体窒素レベルを超える。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54267/54267fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> サンプルと冷たい窒素蒸気と熱平衡状態にある温度プローブ、銅 - コンスタンタン熱電対接合部、両方を維持しながら、これは時間をかけて（数時間まで）サンプル温度でゆっくりと、制御された増加を可能にします。可視および近赤外領域にわたる発光スペクトルは、各スペクトルとして、試料温度が実質的に一定である間にCCDを搭載した発光分光器とわずか数スペクトルあたりミリ秒（毎秒スペクトル数百）（ΔT&lt;0.1 K）で取得されますデータセットが取得されます。温度〜5 Kでのスペクトルとの間の典型的な待機時間が離れて〜5-15分です。 Moreo励起光のみのスペクトルあたりのサンプルを数秒に衝突させるため版、試料加熱または励起光による試料の光化学的劣化の影響が最小限に抑えられます。シンプルさ、移植性、および試料負荷の素早さの利益のために、光ファイバーケーブルが使用されていません。サンプルは、水銀アークランプまたはダイオードレーザーの405nmのラインから365nmの帯域のいずれかで直接励起されます。試料から放出された光は、集光レンズによってデュワーにおける発光サンプルから直接ピックアップされ、集束レンズにより分光器の入射スリットに入射されます。調査中のルテニウム及びロジウム錯体のサンプルは、酸素飽和溶液中〜10 -3〜10 -4 Mの溶質の分光研究としての薄膜のために用意されています。溶液は、小さな銅線ループ（DIAで0.0150から形成され〜3mmのループ直径銅線）で表面張力によって保持されています。熱電対接合部の高さは、その後ですadjusteD 図2及び図 3に示すように、サンプルの高さ（H = 熱電対 時間サンプル ）およびサンプルループに近接して同一であるので。温度は熱電対サンプル接合とハイインピーダンスデジタル電圧計を使用し、タイプT銅/コンスタンタン熱電対のための電圧テーブル対温度と比較する0℃の水/氷の熱電対の基準接点の間の電圧差を測定することによって決定されます。ワイヤループに取り込まれ、薄膜試料溶液は、光学デュワー内の液体窒素中に素早く浸漬することによって急速冷凍しています。その後、凍結溶液は、その発光スペクトルは、温度の関数として測定されている間、凍結されたまま、時間をかけて非常に徐々に温めています。温度データ対発光強度は、以下のモデルに従って分析されます。 温度での試料の総発光強度&lt;em&gt;のTは、酸素とunoxygenated複合体に起因する強度の和として与えられます。 <img alt="式（2）" fo:display-align="middle" src="/files/ftp_upload/54267/54267eq2.jpg" /> 。 （1） 酸素なし錯体からの発光強度は温度に依存しないと仮定されます。しかし、酸素錯体の発光強度は、酸素消光に起因する温度上昇と共に指数関数的に減少します。これは、フォームのアレニウスの式によって記述することができます<img alt="式3" fo:vertical-align="middle" src="/files/ftp_upload/54267/54267eq3.jpg" /> 。 （2） 式（2）において、E aは消光活性化エネルギー、kはボルツマン定数です。最大発光強度は、低温領域で観察され、ここで、T（ 図5参照）<html>ここでクエンチング活性化障壁を克服するのに十分な熱エネルギーである（ すなわち、酸素の複合体からのエネルギー移動）。式（2）式、（式1）に代入された場合<img alt="式（5）" fo:display-align="middle" src="/files/ftp_upload/54267/54267eq5.jpg" /> （3） 得られます。式（3）において、 <img alt="式6" fo:display-align="middle" src="/files/ftp_upload/54267/54267eq6.jpg" />低温領域における酸素の複合体に起因する強度です。式の転位（3）利回り<img alt="式（7）" fo:display-align="middle" src="/files/ftp_upload/54267/54267eq7.jpg" /> 。 （4） 式の両辺の自然対数をとると（4）式を与えます7eq8.jpg &quot;/&gt;（5） 式（5）からは明らかであるのプロット<img alt="式9" fo:display-align="middle" src="/files/ftp_upload/54267/54267eq9.jpg" />対<img alt="式10" fo:display-align="middle" src="/files/ftp_upload/54267/54267eq10.jpg" />と直線を与えます<img alt="式11" fo:display-align="middle" src="/files/ftp_upload/54267/54267eq11.jpg" /> 、ルミネセンス消光活性化エネルギーは、以下のように取得されます<img alt="式12" fo:display-align="middle" src="/files/ftp_upload/54267/54267eq12.jpg" /> 。 （6）

<table><tbody><tr><td>Diode laser 405 nm</td><td>Generic</td><td></td><td>Generic pencil-type laser pointer for luminescence excitation: 5 mW at 405&amp;nbsp;nm</td></tr><tr><td>Quartz optical dewar</td><td>Custom fabrication</td><td></td><td>3.5 cm id. x 25.0 cm length with 4.5 cm unsilvered region for optical access</td></tr><tr><td>Programmable 5 1/2 digit DMM</td><td>Keithley</td><td>Model 192</td><td>High impedence DMM for reading thermocouple voltages</td></tr><tr><td>Copper thermocouple wire</td><td>Omega Engineering</td><td>SPCP-010</td><td>0.010 in. diameter bare copper thermocouple wire</td></tr><tr><td>Constantan thermocouple wire</td><td>Omega Engineering</td><td>SPCC-010</td><td>0.010 in. diameter bare Constantan (copper/nickel) thermocouple wire</td></tr><tr><td>Polychromator/Spectrograph</td><td>Jarrell-Ash</td><td>82-415</td><td>0.25 m Ebert monochromator with back slit assembly removed to enable operation as a polychromator</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Andor</td><td>DV-401-UV</td><td>Thermoelectrically cooled (-35 &amp;#176;C) CCD camera for detecting emitted light</td></tr><tr><td>Copper wire for sample loop</td><td>Generic</td><td></td><td>0.0150 in. diameter bare copper wire for sample loop</td></tr></tbody></table>

a simple dewar/cryostat for thermally equilibrating samples at known temperatures for accurate cryogenic luminescence measurements

小さな溶融シリカ光学デュワー、熱電対アセンブリに基づく単純な液体窒素デュワー/クライオスタット装置、及びCCD分光器の設計および動作について説明します。このデュワー/クライオスタットが設計されている実験は、高速サンプルローディング、速いサンプル凍結、サンプルの高速整列、正確で安定したサンプル温度、およびデュワー/クライオスタット極低温ユニットの小型化と移植を必要とします。 CCD分光器の高速データ取得レートと組み合わせると、このデュワー/クライオスタットは、77から300 Kの範囲内の既知の、安定した温度の一連で発光サンプルの低温の発光分光測定をサポートすることができます。ロジウム（III）の遷移金属錯体における発光の酸素消光の温度依存性の研究は、このデュワー/クライオスタットとの可能な調査の種類の例として提示されています。この装置の文脈では、極低温spectrosのための安定した温度でコピーは、熱CCDにより分光測定の短い時間スケール（〜1-10秒）の間（ΔT&lt;0.1 K）を変化しない既知の測定可能温度で液体窒素または気体窒素のいずれかで平衡化された発光サンプルを意味します。デュワー/クライオスタットは、hは液体窒素レベルを超えるサンプルの高さでデュワー内の液体窒素レベルを超えて展開する正の熱勾配のdT / DHを利用することによって動作します。数時間にわたる時間がゆっくり上昇し、この期間にわたって試料温度Tにおける結果としての遅い増加液体窒素結果のゆっくりと蒸発させます。迅速に取得発光スペクトルを効果的定数、熱的に平衡化した温度でサンプルをキャッチします。

発光性化合物トリス （4,7-ジメチル-1,10-フェナントロリン）ロジウム（III）の77から200 Kの領域の温度依存性ルミネセンス消光研究のための上述の装置で得られた代表的な結果[RH（4 、7-Meの2 -1,10-フェン）3] 3+、酸素飽和グリセロールに溶解し、 表1に列挙し、 図4、図5、および図7にプロットされてい...

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A Simple Dewar/Cryostat for Thermally Equilibrating Samples at Known Temperatures for Accurate Cryogenic Luminescence Measurements

A simple liquid nitrogen Dewar/cryostat apparatus comprised of a small fused silica optical Dewar, a thermocouple, and a charge-coupled device (CCD) spectrograph are described. The experiments for which this Dewar/cryostat is designed require fast sample loading, freezing, and alignment, accurate and stable sample temperatures, and small size/portability.

正確な低温ルミネッセンス測定のための既知の温度で熱的に平衡化サンプルのための簡単​​なデュワー/クライオスタット

The design and operation of a simple liquid nitrogen Dewar/cryostat apparatus based upon a small fused silica optical Dewar, a thermocouple assembly, and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Engineering

9.5K ビュー.  Concordia University. A simple liquid nitrogen Dewar/cryostat apparatus comprised of a small fused silica optical Dewar, a thermocouple, and a charge-coupled device (CCD) spectrograph are described. The experiments for which this Dewar/cryostat is designed require fast sample loading, freezing, and alignment, accurate and stable sample temperatures, and small size/portability.

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

相関ライト/電子顕微鏡のための低コストクライオ光学顕微鏡のステージの作製

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

生物工学

High-resolution Thermal Micro-imaging Using Europium Chelate Luminescent Coatings

Micro-electronic devices often undergo significant self-heating when biased to their typical operating conditions. This paper describes a convenient optical micro-imaging technique which can be used to map and quantify such behavior. Europium thenoyltrifluoroacetonate (EuTFC) has a 612 nm luminescence line whose activation efficiency drops strongly with increasing temperature, due to T-dependent interactions between the Eu3+ ion and the organic chelating compound. This material may be readily coated on to a sample surface by thermal sublimation in vacuum. When the coating is excited with ultraviolet light (337 nm) an optical micro-image of the 612 nm luminescent response can be converted directly into a map of the sample surface temperature. This technique offers spatial resolution limited only by the microscope optics (about 1 micron) and time resolution limited by the speed of the camera employed. It offers the additional advantages of only requiring comparatively simple and non-specialized equipment, and giving a quantitative probe of sample temperature.

Europium thenoyltrifluoroacetonate (EuTFC) has an optical luminescence line at 612 nm, whose activation efficiency decreases strongly with temperature. If a sample coated with a thin film of this material is micro-imaged, the 612 nm luminescent response intensity may be converted into a direct map of sample surface temperature.

ユーロピウムキレート発光塗料を用いた高解像度サーマルマイクロイメージング

Micro-electronic devices often undergo significant self-heating when biased to their typical operating conditions. This paper describes a convenient ...

工学

Measuring the Densities of Aqueous Glasses at Cryogenic Temperatures

We demonstrate a method for determining the vitreous phase cryogenic temperature densities of aqueous mixtures, and other samples that require rapid cooling, to prepare the desired cryogenic temperature phase. Microliter to picoliter size drops are cooled by projection into a liquid nitrogen-argon (N2-Ar) mixture. The cryogenic temperature phase of the drop is evaluated using a visual assay that correlates with X-ray diffraction measurements. The density of the liquid N2-Ar mixture is adjusted by adding N2 or Ar until the drop becomes neutrally buoyant. The density of this mixture and thus of the drop is determined using a test mass and Archimedes principle. With appropriate care in drop preparation, management of gas above the liquid cryogen mixture to minimize icing, and regular mixing of the cryogenic mixture to prevent density stratification and phase separation, densities accurate to &#60;0.5% of drops as small as 50 pL can readily be determined. Measurements on aqueous cryoprotectant mixtures provide insight into cryoprotectant action, and provide quantitative data to facilitate thermal contraction matching in biological cryopreservation.

A protocol for determining the vitreous phase densities of micro- to pico-liter size drops of aqueous mixtures at cryogenic temperatures is described.

低温での水性ガラスの密度の測定

We demonstrate a method for determining the vitreous phase cryogenic temperature densities of aqueous mixtures, and other samples that require rapid ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, chlorine, or calcium, that are often natively present in macromolecules. This enables the direct structure solution of proteins and nucleic acids via experimental phasing without the need of additional labelling. To eliminate the significant air absorption of X-rays in this wavelength regime, these experiments are performed in a vacuum environment. Beamline I23 at Diamond Light Source, UK, is the first synchrotron instrument of its kind, designed and optimized for MX experiments in the long wavelength range towards 5 &#197;. 
To make this possible, a large vacuum vessel encloses all endstation components of the sample environment. The necessity to maintain samples at cryogenic temperatures during storage and data collection in vacuum requires the use of thermally conductive sample holders. This facilitates efficient heat removal to ensure sample cooling to approximately 50 K. The current protocol describes the procedures used for sample preparation and transfer of samples into vacuum on beamline I23. Ensuring uniformity in practices and methods already established within the macromolecular crystallography community, sample cooling to liquid nitrogen temperature can be performed in any laboratory setting equipped with standard MX tools. 
Cryogenic storage and transport of samples only require standard commercially available equipment. Specialized equipment is required for the transfer of cryogenically cooled crystals from liquid nitrogen into the vacuum endstation. Bespoke sample handling tools and a dedicated Cryogenic Transfer System (CTS) have been developed in house. Diffraction data collected on samples prepared using this protocol show excellent merging statistics, indicating that the quality of samples is unaltered during the procedure. This opens unique opportunities for in-vacuum MX in a wavelength range beyond standard synchrotron beamlines.

Here, we present a protocol for cryogenic sample preparation and transfer of crystals into the vacuum endstation on beamline I23 at Diamond Light Source, for long-wavelength macromolecular X-ray crystallography experiments.

ダイヤモンド光源におけるビームラインI23上の真空中長波長結晶構造解析のためのサンプル調製および移送プロトコル

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

生化学

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample preparation is a key and often complex procedure, particularly for biological samples. Although X-ray speciation techniques are widely used, no detailed protocol has been yet disseminated for users of the technique. Further, chemical state modification is of concern, and cryo-based techniques are recommended to analyze the biological samples in their near-native hydrated state to provide the maximum preservation of chemical integrity of the cells or tissues. Here, we propose a cellular preparation protocol based on cryo-preserved samples. It is demonstrated in a high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy study of selenium in cancer cells and a study of iron in phytoplankton. This protocol can be used with other biological samples and other X-ray techniques that can be damaged by irradiation.

This protocol presents a detailed procedure to prepare biological cryosamples for synchrotron-based X-ray absorption spectroscopy experiments. We describe all the steps required to optimize sample preparation and cryopreservation with examples of the protocol with cancer and phytoplankton cells. This method provides a universal standard of sample cryo-preparation.

高分解能X線吸収分光法を用いた極低温でのスペシエーションのための生体試料調製

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...

化学

Optimizing Sample Preparation for Cryogenic Electron Microscopy

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native conditions, suspended in vitreous ice. This technique allows for the high-resolution visualization of proteins and other biomolecules without the need for crystallization, offering significant insights into their function and mechanism. Recent advancements in single-particle analysis, coupled with improved computational data processing, have made cryo-EM an indispensable tool in modern structural biology. Despite its growing adoption, cryo-EM faces persistent challenges that can limit its effectiveness, particularly uneven particle distribution. This issue often leads to poor resolution and reduced accuracy in reconstructed protein structures. This article outlines a simple, practical approach to address this challenge, using the small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example. The method optimizes sample preparation to minimize preferential adsorption, ensuring more homogeneous particle distribution and higher-quality protein cryo-EM structures. This technique offers valuable guidance for researchers aiming to overcome similar challenges in structural studies.

This protocol presents a practical method using Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example to address uneven particle distribution through sample preparation optimization, providing a reference for researchers to efficiently elucidate macromolecular structures using cryogenic electron microscopy (cryo-EM).

極低温電子顕微鏡のためのサンプル調製の最適化

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

集束イオンビームを用いて低温電子顕微鏡標本の準備

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

生物学

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

細胞生存率を維持するマジックアングル回転核磁気共鳴分光計への低温サンプルローディング

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than conventional fluorescence microscopy. This super-resolution (SR) technique enables visualization of molecular processes in whole cells and has the potential to be used in conjunction with electron microscopy and X-ray tomography to correlate structural and functional information. A SIM microscope for cryogenically preserved samples (cryoSIM) has recently been commissioned at the correlative cryo-imaging beamline B24 at the UK synchrotron. 
It was designed specifically for 3D imaging of biological samples at cryogenic temperatures in a manner compatible with subsequent imaging of the same samples by X-ray microscopy methods such as cryo-soft X-ray tomography. This video article provides detailed methods and protocols for successful imaging using the cryoSIM. In addition to instructions on the operation of the cryoSIM microscope, recommendations have been included regarding the choice of samples, fluorophores, and parameter settings. The protocol is demonstrated in U2OS cell samples whose mitochondria and tubulin have been fluorescently labelled.

This protocol demonstrates how to image biological cryo-preserved samples using cryo-structured illumination microscopy. We demonstrate the methodology by imaging the cytoskeleton of U2OS cells.

極低温保存細胞からの微視的データ収集

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

Regulating Temperature in the Lab: Preserving Samples Using Cold

Preservation of laboratory samples, specimens, and reagents using extreme cold is routinely performed in biomedical research labs. This video will discuss some of the methods for keeping laboratory samples cold and will explain the correct cooling method to use for each experimental requirement.
For example, cooling agents, such as ice and dry ice, are typically used when keeping samples cold during experiments. This video discusses the physical properties of the most commonly used cooling agents, as well as safety precautions for working with them.
When it comes to keeping samples cold in between experiments, cooling equipment, including laboratory grade refrigerators and freezers can be used to preserve samples for extended period of time. Also discussed in this video are types of samples and reagents that can be stored in the commonly-available laboratory cooling equipment.
Finally, the concept of cryopreservation is introduced as a process through which tissues, cells, and biomolecules are cooled to sub-zero temperatures, thereby effectively stopping all sample-degrading biological activity. Several methods of cryopreservation are discussed that minimize or eliminate the formation of damaging ice crystals.

Preserving Samples Using Cold: Cooling Agents and Instruments, and Cryopreservation

研究室での温度コントロール:サンプルの冷却保存

Preservation of laboratory samples, specimens, and reagents using extreme cold is routinely performed in biomedical research labs.  This video will ...

正確な低温ルミネッセンス測定のための既知の温度で熱的に平衡化サンプルのための簡単なデュワー/クライオスタット

要約

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相関ライト/電子顕微鏡のための低コストクライオ光学顕微鏡のステージの作製

ユーロピウムキレート発光塗料を用いた高解像度サーマルマイクロイメージング

低温での水性ガラスの密度の測定

ダイヤモンド光源におけるビームラインI23上の真空中長波長結晶構造解析のためのサンプル調製および移送プロトコル

高分解能X線吸収分光法を用いた極低温でのスペシエーションのための生体試料調製

極低温電子顕微鏡のためのサンプル調製の最適化

集束イオンビームを用いて低温電子顕微鏡標本の準備

細胞生存率を維持するマジックアングル回転核磁気共鳴分光計への低温サンプルローディング

極低温保存細胞からの微視的データ収集

研究室での温度コントロール:サンプルの冷却保存

正確な低温ルミネッセンス測定のための既知の温度で熱的に平衡化サンプルのための簡単​​なデュワー/クライオスタット

要約

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相関ライト/電子顕微鏡のための低コストクライオ光学顕微鏡のステージの作製

ユーロピウムキレート発光塗料を用いた高解像度サーマルマイクロイメージング

低温での水性ガラスの密度の測定

ダイヤモンド光源におけるビームラインI23上の真空中長波長結晶構造解析のためのサンプル調製および移送プロトコル

高分解能X線吸収分光法を用いた極低温でのスペシエーションのための生体試料調製

極低温電子顕微鏡のためのサンプル調製の最適化

集束イオンビームを用いて低温電子顕微鏡標本の準備

細胞生存率を維持するマジックアングル回転核磁気共鳴分光計への低温サンプルローディング

極低温保存細胞からの微視的データ収集

研究室での温度コントロール:サンプルの冷却保存

正確な低温ルミネッセンス測定のための既知の温度で熱的に平衡化サンプルのための簡単なデュワー/クライオスタット