Name: continuous iv infusion is the choice treatment route for arginine-vasopressin receptor blocker conivaptan in mice to study stroke-evoked brain edema
Uploaded: 2016-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous IV Infusion is the Choice Treatment Route for Arginine-vasopressin Receptor Blocker Conivaptan in Mice to Study Stroke-evoked Brain Edema at JoVE.c

私たちは、資金調達と設備を提供するためのスウェーデンの医療センターに感謝します。また、研究スペースの寛大な使用のためのクレイグ病院に感謝します。

実験は、研究における動物の管理と使用のための国立衛生研究所のガイドラインに従って実施したとスウェーデンの医療センター動物実験委員会によって承認されました。すべての手順は、適切な無菌技術を用いて実施しました。研究のために利用した実験動物は、25から27グラムに体重を持つ野生型C57マウス、3ヶ月齢、男性でした。 インビボストローク誘導1. <ol><li>手術前に歯科用レジンとのプレコートフィラメント。 <ol><li> 7-0ナイロン縫合糸からのフィラメントの12ミリメートル長い部分をカットします。硬化剤の1部を樹脂2部を混合し、その後すぐに、約1/3全長のをカバーするために混合物中にフィラメントの先端を浸し。すぐにそれを削除し、それは歯科用レジンの滑らかな表面のコートで覆われていることを確認します。 </li><li>空気は使用前に2時間フィラメントを乾燥します。 </li></ol></li><li>上にマウスを置きますnは麻酔導入室（2 L容量）、及びチャンバに入る2リットル/分で25％の酸素富化室内空気中1.5％イソフルランの流れを設定します。 </li><li>尾のピンチへの応答の欠如によって決定されるように、完全に、8を麻酔まで、マウスは、誘導チャンバ内に残ることを許可します。 </li><li>加熱パッドで手術台の上にマウスを置き、ノーズ​​コーンを介して自然に配信麻酔の維持のために1％のイソフルラン濃度を設定します。 </li><li>フロントや首の後ろで髪をクリップし、消毒用アルコールで首をスプレー。両眼に獣医の眼軟膏を適用します。 </li><li>継続的に体温を監視するには、手術中にデジタルディスプレイに接続直腸温度プローブを使用します。 </li><li>仰臥位でマウスを置き、消毒用ポビドンヨード10％スクラブ溶液を塗布、滅菌ドレープで覆い、その後、サイズ10手術用メスの刃で首に沿って正中切開を行います。 </li> &lt;李&gt;は一時的に6.0絹縫合糸で左総頸動脈（CCA）を連結します。 </li><li>左外頸動脈（ECA）上の別のネクタイを置きます。 </li><li>内頸動脈（ICA）上の微小血管クリップを配置します。 </li><li>微小血管はさみで外頸動脈に小さな穴をカット。 ECAの開口部に歯科用レジンで被覆した7-0ナイロン縫合糸から作られたフィラメントを挿入し、クリップを除去しながら抵抗（CCAの分岐点から約5〜7 mm）の感じられるまで、cephalicallyそれを進めます。 </li><li>位置にフィラメントを確保するために内頸動脈上に一時的なネクタイを置きます。図、 図1（a）を参照してください。絹縫合糸で皮膚を閉じて、ステップ2.6のように、0.5％ブピバカイン0.2ミリリットルと首の前面に傷を浸透させます。 </li><li>マウスは麻酔から目覚め、60分間回収室で意識を取り戻すことを可能にします。それは取り戻したまで無人の動物を放置しないでください胸骨横臥を維持するのに十分な意識。 </li><li> 0 =正常な運動機能を3 =対側に傾いて、2 =安静時、反対側が、通常の姿勢に旋回、テールリフトの胴体のと反対側の前肢の1 =屈曲、次のように神経学的欠損スコアリング（NDS）のためのマウスをテストします残り4時側=なし自発運動。4,9 <ol><li> NDSのテストのための観察のための平らな面に尾と場所によって、リフトマウス（2-3分）。また、回収室でマウスを観察します。 MCAの不十分な閉塞に実験から2よりも低いNDSを示すマウスを除外します。 注：レーザードップラー流量測定技術は、MCA閉塞を確認するために使用することができる9-11。 </li></ol></li><li>上記のように誘導室に回復の60分後に動物を麻酔-再、10％ポビドンヨードスクラブ溶液で前の皮膚切開を再滅菌し、上の手術創を再開絹縫合糸を切断して除去することにより、首の前面。 </li><li> ECAからフィラメントを削除するには、次の手順を実行します。 <ol><li> ICA上の微小血管クリップを配置します。 ICAに縫合糸をほどくとオープンクリップを保持しながら、フィラメントを引き出します。 </li><li>クリップを閉じて、近位にカットにECAにネクタイを配置します。 </li><li>クリップを削除し、脳への血流を回復するためにCCAから合字を削除します。図、 図1Bを参照してください。 </li></ol></li></ol>連続48時間の治療のための頸静脈に静脈カテーテルの2.インストール注：マウスの​​覚醒せずにすぐにステップ1.16.3後、カテーテルのインストールに進んでください。 <ol><li>フレキシブルチューブの2つの異なるサイズを使用します（外径0.94ミリメートル、注入される薬剤を含むように）インナーチューブを挿入し、外チューブ（外径3.18ミリメートル、インナーチューブの保護のため）に。 </li><li> P、腹臥位でマウスをレース消毒に10％のポビドンヨードスクラブソリューションを適用し、サイズ10手術用メスの刃で首の後ろに1cmの切開を行います。仰臥位にマウスを回し、10％ポビドンヨードスクラブ溶液と首の前面を再滅菌し、首の前面に外科創傷を再開。首の前面に背面の切開から皮膚の下のトンネルチューブを、と開いた傷口1センチメートルからそれを体外に出します。 </li><li>正中線から横方向に約1cm首の前面の左側から皮下脂肪組織を削除します。 、左頸静脈を見つけて5ミリメートル離れた静脈に沿って2絆を置き、わずかに静脈を伸ばします。微小血管はさみで2絆間の頚静脈に小さな穴を開けます。 （心臓に向かって）インナーチューブ5ミリメートル、深尾側の先端を挿入します。 </li><li>頚静脈の両方にタイでチューブを固定します。と首の前面に皮膚を閉じます3-0絹縫合糸。図、 図1Cを参照してください。 </li><li>縫合糸で首の後ろに皮膚にチューブを固定して、スイベルを介してマイクロインフュージョンのIVポンプにチューブを接続します。スイベルは、食料や水へのフルアクセス権を持つケージの中にマウスの自由な移動を可能にします。 </li><li>術後の痛みを防ぐために、0.5％ブピバカイン0.2ミリリットルと前面の皮膚切開と首の後ろを潜入。 注：機関特定の動物のプロトコルに応じて、動物は、オピオイド、NSAID類、または抗生物質前および術後で処理することができます。しかし、上記の治療は、虚血性脳卒中のアウトカムの結果を変更することができます （ ディスカッションセクションを参照してください）。11月14日 </li><li>動物は、実験の終了点まで別々のケージに動物を回復室で目覚め、その後収容することができます。それは胸骨を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください横臥。 </li><li> 1.5ミリリットル/ kg /時間、4で連続48時間のIVコニバプタンの治療（5％デキストロースで0.14 mg / mlで）または車両の注入速度を設定し、注入を開始します。 注：IV注入コニバプタンの総量は1.44ミリリットルの全容量で約0.2ミリグラム/マウス/日であるべきです。 注：5％デキストロースの1.44ミリリットル中0.2ミリグラムの合計量1日2回コニバプタンの腹腔内（IP）注射を行います。 IP注射は、先に説明した実装します。15は、本体とテールの後面の皮を把持して、マウスを抑えます。 26 G / 1/2インチ針を使用して、左下腹部にコニバプタンまたは車両を注入する。15 </li><li>実験（48時間）の全期間1日2回、動物を観察します。動物が食料や水へのフルアクセスを許可。動物が苦痛または呼吸困難の兆候を示す場合獣医師に相談してください。安楽死は、重度のdistに動物のために必要な場合RESSは、以下のステップ3.1を参照してください、そして研究から動物を除外します。 </li></ol>エンドポイントでの脳卒中誘発脳浮腫の3評価<ol><li> 5％イソフルランでオーバー麻酔によりマウスを生け贄に捧げます。 </li><li>正中線に沿って頭蓋骨の上に皮膚切開を行い、脳の上に全体の頭蓋骨を露出させ、皮膚を撤回するためにメスを使用してください。大後頭孔で始まり、それぞれの側の脳の周囲に沿って横方向に頭蓋骨を切断し、その下に脳に触れることなく慎重に持ち上げます。脊柱から脳と頭蓋骨のベースに取り付けられた神経を切断します。 </li><li>前述したように、脳を取り外し嗅球および小脳から分離し、虚血性および非虚血性大脳半球に半球間裂に沿って大脳を分析。9 </li><li>以前に4,9記載されているように、ウェット-乾燥比（WDR）を比較することによって、脳浮腫を評価します。組織の重量を測定前とオーブンで100℃で3日間乾燥させた後。 ％のH 2 O =として脳含水量（BWC）を計算（1乾燥重量/湿潤重量）×100％。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

この研究は、前臨床脳卒中研究のための重要な値を有します。この研究では、マウスにおける実験的脳卒中後のコニバプタン（0.2 mg /日）の連続IV注入を効率的に処理の48時間後に脳浮腫を減少させることが明らかになりました。脳浮腫のコニバプタンの同じ用量の腹腔内注射の効果も調べました。で示されるようにIVおよびIPルートの両方によるコニバプタン処理は、マウスで自由水利尿を生成します。少し生理的レベル以上の血漿浸透圧の1）の増加。及び2）による腎臓における水の再吸収の閉塞に尿浸透圧の減少。従って、処理結果に基づいて、我々は、IV送達方法は、脳卒中誘発浮腫形成の追加の重要な有益な効果を有することを報告しています。 当社の主要な発見は、IV治療はコニバプタンのIPルートよりも脳浮腫の軽減に優れた効果を生じたということです。臨床用途はCORするコニバプタンは、利用可能な組み合わせのV1a及びV2受容体拮抗薬でありますRECT低ナトリウム血症、血液量及び重量オスモル濃度16コニバプタンは、様々な条件を有する患者における低ナトリウム血症を修正することが示されている。コニバプタンの17臨床的利用可能性は、脳浮腫の文脈において、その探索は、高速ベンチ・ツー・ベッドサイド翻訳をもたらすことができることを示唆しています。脳室内送達実験選択V1a受容体遮断薬の使用は、他の研究者によって記載虚血後脳浮腫の形成を減少させることが証明されている。3,18しかしながら、これらの研究で使用される薬剤も、薬物の治療経路のいずれもの可能な臨床応用を提案しています近い将来。 脳虚血とAVP原因の脳浮腫によりメカニズムは複雑です。しかし、いくつかの重要な分子選手は、BBBの界面で血管壁に局在するナトリウムと塩化共同輸送体19,20とのV1a受容体です。コニバプタンの影響を遮断V2はexcesの排泄のために責任がありますコニバプタンがコニバプタンの利用可能性を減らすことができる組織の障壁を回避するために、循環に直接配信されたときに腎臓および脳浮腫の発症を防ぐのに役立つかもしれ血液浸透圧の上昇。21これらの機構によってsの水はまだプレイしていてもよいです。しかし、用量および治療 ​​期間の正当化は、以前に公開された観察に基づいていた。4これはコニバプタン地域血流の損傷によって誘発される減少した後、脳の虚血部位に到達したか否かが判断されていません。それはまた、脳が脳動脈内のV1a受容体を遮断することによって、このような血管収縮の防止などの望ましい局所的効果を生成するコニバプタンのに十分な量を受信するかどうかを検討する必要があります。 実験プロトコルはコニバプタンの処理経路の選択の問題に対処するために設計されました。結果に基づいて、研究がコニバプタン広告のIV経路のための強力なサポートを提供しています奉仕。しかしながら、プロトコルの最も重要なステップは、確立されたマウスにおける脳卒中後の治療結果に有意差を検出するために微調整することが必要。これらの工程の中には、MCAO（60分）の1）期間; 2）毎日の用量（0.2 mg）を、および注入速度（1.5ミリリットル/ kg /時間）。および3）治療（48時間）の長さ。 MCAOの期間は不可逆的損害脳組織ためのプロトコルのために極めて重要である虚血性発作の程度を決定します。傷害の厳しすぎるが、それが困難な動物は48時間生き残るためになるだろう、または動物は脳浮腫に対するコニバプタン治療にあまり反応しなくなる可能性があります。一方、MCAOの持続時間未満で60分マウスにおいて虚血性傷害を誘導するのに不十分な場合があり、そして、従って、脳浮腫を生じないであろう。用量および治療 ​​期間は、コニバプタン用FDAの推奨に基づいて選択した。16しかし、ことが報告されていますコニバプタンのためのヒト用量は、脳卒中後の脳浮腫を減少させるためにマウスでは効率的ではありませんでした。従って、用量は、虚血後の脳浮腫に対する有意な防御を誘導したマウスは10倍に増加しなければならなかった。4正確な注入速度を選択することの重要性があれば、それは全血液量、血圧、および間質液の蓄積に影響を与えることができるということです率は大幅に提案したレートを超えます。しかし、全血液量と血圧の測定は、非常に有益であろう。 MCAOの外科的誘導は、侵襲的な処置であり、プロトコルのすべてのステップに正確な注意が必要であり、技術のためのトラブルシューティングのヒントを知ることが重要です。原因誤って引き裂かれた動脈への過剰な動脈出血​​などのいくつかの予期しない外科手術の合併症は、実験のための成功率を低下させ、死亡率を増加させます。しかし、静脈出血、光圧力Wを適用することにより停止することができます滅菌スポンジi番目。 このプロトコルは、MCA閉塞が右または左MCAのいずれかで生成されることを意味する脳虚血の一方的な誘導を説明します。しかしながら、このプロトコルはMCA閉塞およびIVカテーテル設置の外科医の好ましい側面に応じて変更することができる。1図図 MCAO手順の最も重要な部分の図を示す、 図1AおよびB、IVカテーテルインストールプロトコル、 図1C、およびMCAO誘発性脳梗塞の代表的な脳スライス実験（48時間）の終了時点で、以前に公開されたように、10 図1D。図と代表的な脳スライスは、MCAOは、脳の左側に誘導されたことを意味しているがMCAOは、エン全体の一貫性である限り、脳の右側に誘導された場合、我々は結果の劇的な違いを考えていませんタイヤ試験が維持されます。 手術や麻酔後の回復期間中、動物が原因で術後の痛みや重度の神経障害に苦痛を経験するかもしれません。多くの場合、術後の疼痛管理には、0.5％のブピバカインなどの局所麻酔薬のみの使用に限定することができます。マウスでのヒトにおける脳血管障害だけでなく、実験的脳卒中に起因する脳卒中、炎症、脳梗塞、脳浮腫などの病態生理学的要因が関与する。9これらの病態生理学的なイベントは、このようなシクロオキシゲナーゼなどの重要な分子プレーヤーが従事している（COX）13およびGタンパク質関連受容体。彼らは、これらの設定に使用された13場合はCOXが関与する分子経路と22の干渉は、NSAID薬によって引き起こされることがあります。オピオイドは、Gタンパク質とセカンドメッセンジャー12に連結されており、脳卒中、11結果の病態生理学的結果を変更することができ、それらの受容体に作用します本研究の秒。これらの要因は、術後マウスにおける鎮痛薬の使用を制限します。 要約すると、我々の研究は、これまで到達目標としてコニバプタンを再利用の可能性を探ります。コニバプタンの連続IV注入に続く実験的脳卒中誘発の我々の動物モデルは、脳卒中患者におけるその潜在的な使用を示唆して一貫性のある結果を生成することが示されています。より具体的には、二次的脳損傷を防ぐために、脳卒中後コニバプタンの連続IV治療のモデルマウスでの前臨床研究のために使用することができることを実証しました。臨床現場への高速変換はICU患者のために救命することができるので、この研究は、脳卒中後のマウスに脳浮腫を研究するための追加のツールと​​してコニバプタン治療の代替アプリケーションを提供することを意図していました。

Stroke continues to be an enormous burden for patients and clinicians. Animal stroke models have been used in the laboratory setting for nearly two decades.1 Nevertheless, experimental treatments that work in animals often fail in humans.2 This discrepancy in treatment outcomes may be due to various factors, such as administration routes for drugs used in animal research, drug metabolism and elimination rate, and many other aspects. One of the major complications of stroke, brain edema, is a focus of current research in neuroscience. Mechanisms of brain edema formation involve disturbances in water and electrolyte balance triggered by the arginine-vasopressin (AVP) response to ischemic brain injury.3 Therefore, AVP and its receptors (V1a and V2) are a major focus of research studies of post-ischemic brain edema formation.3
We have developed a methodology to study the effects of mixed arginine-vasopressin (V1a and V2) receptor blocker conivaptan on post-ischemic brain edema in mice.4 Molecular targets of conivaptan5 make the drug a suitable candidate for exploration of its properties in alleviation of brain edema. Furthermore, conivaptan needs to be studied in the context of pathophysiological events of stroke.6 In designing this study, we considered comparing treatment outcomes using two different routes of administration for conivaptan: intravenous (IV)4 and intraperitoneal (IP).7 Effects of the treatments on stroke-induced brain edema were evaluated. Here detailed protocols are described for surgical induction of experimental stroke by middle cerebral artery occlusion (MCAO), and followed by continuous conivaptan treatment using the installation of a jugular IV catheter. After induction of stroke, animals were randomly allocated into the following groups: vehicle or conivaptan (0.2 mg/day) treated IV or IP.

<table><tbody><tr><td>Heated Pad</td><td>K&amp;amp;H Manufacturing Inc</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Monitor with Rectal Probe</td><td>Physitemp</td><td>7029</td><td></td></tr><tr><td>Silk Suture Spool, 6-0</td><td>Surgical Specialties Corporation</td><td>SP114</td><td></td></tr><tr><td>Silk Suture on a Needle, 3-0</td><td>Ethicon</td><td>1684G</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Suture, 7-0</td><td>Ethicon</td><td>1696G</td><td></td></tr><tr><td>Dental Resin Polysiloxane with Hardener</td><td>Heraeus Kulzer</td><td>65817930</td><td></td></tr><tr><td>Microinfusion IV Pump</td><td>Kent Scietific</td><td>GT0897</td><td></td></tr><tr><td>Swivel 22GA</td><td>Instech</td><td>375/22PS</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Tubing, 0.94 mm x 0.51 mm</td><td>Dow Corning</td><td>508-002</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Tubing, 3.18 mm x 1.98 mm</td><td>Dow Corning</td><td>508-009</td><td></td></tr></tbody></table>

continuous iv infusion is the choice treatment route for arginine-vasopressin receptor blocker conivaptan in mice to study stroke-evoked brain edema

脳卒中は世界中で罹患率および死亡率の主要な原因の一つです。脳卒中は、脳浮腫およびその他の病態生理学的事象によって複雑になります。脳卒中誘発脳浮腫の開発と進化の中で最も重要な選手の中でホルモンのアルギニンバソプレシンおよびその受容体、のV1a及びV2があります。最近、のV1a及びV2受容体ブロッカーコニバプタンは、脳卒中後の脳浮腫を減少させるための潜在的薬物として注目されています。しかし、脳卒中研究におけるコニバプタンアプリケーションを含む動物モデルは、投与の実現可能な経路に基づいて変更される必要があります。ここでは48時間の連続静脈内（IV）の成果は、マウスにおける実験的脳卒中後の腹腔内（IP）コニバプタン治療と比較されます。我々は、中大脳動脈閉塞がコニバプタン（0.2 mg）を、または車両のIV治療のための頸静脈にカテーテルのインストールと組み合わせされたプロトコルを開発しました。動物の異なる集団は0.2で処理しました毎日コニバプタンまたは車両IP mgのボーラス。実験的脳卒中誘発脳浮腫は、連続IVおよびIP処置後のマウスにおいて評価しました。結果の比較はコニバプタンの連続IV投与がコニバプタンのIP投与とは異なり、マウスにおける虚血後脳浮腫を軽減することを明らかにしました。我々は、我々のモデルは、脳卒中や脳浮腫の文脈でコニバプタンアプリケーションの将来の研究のために使用することができると結論します。

動物の体温が生理的範囲内であったとストローク誘導の外科的手順を通じて安定。 MCAOは、研究から除外した直後に2よりも低いNDSを示した2匹のマウス。 マウスにおけるMCAOは、48時間で同側半球で梗塞容積を生成します。 TTC染色した切片の評価は、脳虚血性脳卒中の発症が深刻な原因となる2009年10 Zeynalov、E.およびドレ、S.、によって発行された半球の約50％は、MCAO（ 図1D）後の梗塞の影響を受けていることを示しています酸素や栄養素が脳組織の剥奪。この局所脳組織の低酸素症の結果として、ニューロンおよびグリア細胞は、脳の梗塞部分を形成する、死ぬ。 図1Dは、MCAO誘発性梗塞により影響を受ける代表的なマウスの脳切片を示しており、傷害の大きさの推定値を与えます。 <suP&gt; 10 48時間60分後MCAO誘導で脳の水分含量（BWC）の評価はコニバプタンIV投与（0.2 mg /日）を大幅に両方の同側および対側半球における脳浮腫、（ 図2A）を減少させることを明らかにしました。これとは対照的に、0.2 mgのボーラスによってコニバプタンのIP-治療は、毎日、脳卒中誘発脳浮腫（ 図2B）に同様のプラスの効果を生み出すことができませんでした。 血漿および尿浸透圧にコニバプタン効果の確認実験の終了時点ですべての実験動物において達成されました。コニバプタンはIV処置または次のようにIPは、プラズマを増加し、全てのマウスにおいて尿浸透圧の減少4血漿浸透圧の値をマウスであった：313±4.4ミリオスモル/キログラム（車両、IV）対355±7.5 *ミリオスモル/キログラム（コニバプタン、IV） 、以前に公開されたように、4と340±7.7ミリオスモル/キログラム（車両、IP）対383±8.8 *ミリオスモル/キログラム（コニバプタン、IP）。次のように、マウスにおける尿浸透圧の値は以下のとおりであった：1210.6±13.4ミリオスモル/キログラム（車両、IV）対595.0±57.4 *ミリオスモル/キログラム（コニバプタン、IV）、以前に公開されたように、4および1535.0±80.9ミリオスモル/キログラム（車両、 IP）対242.0±23.2 *ミリオスモル/キログラム（コニバプタン、IP）。提示されたすべてのデータは平均±SEM、コントロールを対応する* P≤0.05対を意味します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54170/54170fig1.jpg" /> 図1： 脳卒中後の実験的脳卒中モデル、IVカテーテルのインストール、および48時間での代表的な梗塞体積のダイアグラムは、（青で表示）フィラメントの位置が左内頸動脈（ICA）における樹脂（緑）でプレコーティングオクルージョン（A）及び再灌流時間（B）の間。左頸静脈（C）におけるフレキシブルチューブ先端の正しい位置。エクスペリマウスにおけるリットルのストロークは48時間で同側半球における梗塞体積を生成します。プロトコールに記載されているように（3.1-3.3ステップ）、マウスMCAO後48時間で屠殺し、脳を取り出しました。脳を2mm厚の切片に切断し、TTC（D）で染色しました。図1DはZeynalov、E.およびドレ、S.、2009年までに元の記事から変更されている10 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54170/54170fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54170/54170fig2.jpg" /> 図2： 連続静脈内（IV）および腹腔内（IP）コニバプタン（0.2 mg /日）脳卒中誘発脳浮腫に対する治療コニバプタンIV治療は48時間投与したの影響 。 IV投与コニバプタン処理は、同側および対時間で虚血後脳浮腫を減少させましたemisphere（A）。図2Aは、Zeynalov らによるオリジナル記事から変更されている。、48時間2015年4コニバプタンIP処理は実験的脳卒中によって引き起こされる脳浮腫を軽減するために失敗し、各群においてn = 10。 （ステップ1.1.1-1.15.3）上記のプロトコルに記載されているようにしたマウスは、再灌流でMCAOを受けました。その後コニバプタンのIP注射（0.2 mg）を22時間再灌流の46時間で、すぐに投与しました。マウスを屠殺しました。プロトコル（3.1〜3.4ステップ）で説明したように脳を、オーブン中で除去し、乾燥させました。 （B）全てのデータは平均±SEMとして提示され、* P &lt;0.05、対応する制御対。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54170/54170fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Continuous IV Infusion is the Choice Treatment Route for Arginine-vasopressin Receptor Blocker Conivaptan in Mice to Study Stroke-evoked Brain Edema

Our studies have revealed that the beneficial effects of conivaptan are dependent on the method of delivery after experimental stroke in mice. We have developed a research protocol for delivery of the receptor blocker via IV catheter on stroke-evoked brain edema formation in mice.

連続IV注入は、脳卒中誘発脳浮腫を研究するためにマウスにおけるアルギニンバソプレシン受容体拮抗コニバプタンのための選択の治療のルートであります

Stroke is one of the major causes of morbidity and mortality in the world. Stroke is complicated by brain edema and other pathophysiological events. Among ...

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Research

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Medicine

8.8K ビュー.  Swedish Medical Center. Our studies have revealed that the beneficial effects of conivaptan are dependent on the method of delivery after experimental stroke in mice. We have developed a research protocol for delivery of the receptor blocker via IV catheter on stroke-evoked brain edema formation in mice. 

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Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

マウスにおける反復低酸素プレコンディショニングと過渡中大脳動脈閉塞後に神経血管保護の定量

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

医学

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

神経科学

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke involves middle cerebral artery occlusion (MCAO). Infarct zone, brain edema and blood-brain barrier (BBB) breakdown are measured as parameters that reflect the extent of brain injury after MCAO. A significant limitation to this method is that these measurements are normally obtained in different rat brain samples, leading to ethical and financial burdens due to the large number of rats that need to be euthanized for an appropriate sample size. Here we present a method to accurately assess brain injury following MCAO by measuring infarct zone, brain edema and BBB permeability in the same set of rat brains. This novel technique provides a more efficient way to evaluate the pathophysiology of stroke.

This protocol describes a novel technique of measuring the three most important parameters of ischemic brain injury on the same set of rodent brain samples. Using only one brain sample is highly advantageous in terms of ethical and economic costs.

げっ歯類の脳サンプルの単一のセットで脳卒中後脳浮腫、梗塞ゾーンおよび血液脳関門破壊を測定する

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional deficits. Numerous studies by our group and others have shown that mTBI stimulates cytokine expression and activates microglia, decreases cerebral blood flow and metabolism, and impairs cerebrovascular reactivity. Moreover, several works have reported an association between derangements in these neuroinflammatory and hemodynamic markers and cognitive impairments. Herein we detail methods to characterize the neuroinflammatory and hemodynamic tissue response to mTBI in mice. Specifically, we describe how to perform a weight-drop model of mTBI, how to longitudinally measure cerebral blood flow using a non-invasive optical technique called diffuse correlation spectroscopy, and how to perform a Luminex multiplexed immunoassay on brain tissue samples to quantify cytokines and immunomodulatory phospho-proteins (e.g., within the MAPK and NF&#954;B pathways) that respond to and regulate activity of microglia and other neural immune cells. Finally, we detail how to integrate these data using a multivariate systems analysis approach to understand the relationships between all of these variables. Understanding the relationships between these physiologic and molecular variables will ultimately enable us to identify mechanisms responsible for mTBI.

This protocol presents methods to characterize the neuroinflammatory and hemodynamic response to mild traumatic brain injury and to integrate these data as part of a multivariate systems analysis using partial least squares regression.

外傷性脳損傷に対する神経炎症および血行動態応答のシステム解析

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional ...

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent infarction size and location, precipitation of platelet:fibrin intermixed blood clots similar to those in patients, and an adequate sensitivity to fibrinolytic treatment. The rose bengal (RB) dye-based photothrombotic stroke model meets the first two requirements but is highly refractory to tPA-mediated lytic treatment, presumably due to its platelet-rich, but fibrin-poor clot composition. We reason that combination of RB dye (50 mg/kg) and a sub-thrombotic dose of thrombin (80 U/kg) for photoactivation aimed at the proximal branch of middle cerebral artery (MCA) may produce fibrin-enriched and tPA-sensitive clots. Indeed, the thrombin and RB (T+RB)-combined photothrombosis model triggered mixed platelet:fibrin blood clots, as shown by immunostaining and immunoblots, and maintained consistent infarct sizes and locations plus low mortality. Moreover, intravenous injection of tPA (Alteplase, 10 mg/kg) within 2 h post-photoactivation significantly decreased the infarct size in T+RB photothrombosis. Thus, the thrombin-enhanced photothrombotic stroke model may be a useful experimental model to test novel thrombolytic therapies.

Traditional photothrombotic stroke (PTS) models mainly induce dense platelet aggregates of a high resistance to tissue plasminogen activator (tPA)-lytic treatment. Here a modified murine PTS model is introduced by co-injecting thrombin and photosensitive dye for photoactivation. The thrombin-enhanced PTS model produces mixed platelet:fibrin clots and is highly sensitive to tPA-thrombolysis.

フィブリン富化およびtPA感受性光血栓性脳卒中モデル

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

Intracranial Pressure Monitoring In Nontraumatic Intraventricular Hemorrhage Rodent Model

Survivors of intraventricular hemorrhage are often left with significant long-term memory impairment; thus, research utilizing intraventricular hemorrhage animal models is essential. In this study, we sought out ways to measure intracranial pressure, mean arterial pressure, and cerebral perfusion pressure during nontraumatic intraventricular hemorrhage in rats. The experimental design included three Sprague Dawley groups: sham, standard 200 &#181;l intraventricular hemorrhage, and vehicle control groups. By introducing an intraparenchymal fiberoptic pressure sensor, precise intracranial pressure measurements were obtained in all groups. Cerebral perfusion pressures were calculated with the knowledge of intracranial pressure and mean arterial pressure values. As expected, the intraventricular hemorrhage and vehicle control groups both experienced a rise in the intracranial pressure and subsequent decline in cerebral perfusion pressure during intraventricular injection of autologous blood and artificial cerebrospinal fluid, respectively. The addition of an intraparenchymal fiberoptic pressure sensor is beneficial in monitoring precise intracranial pressure changes.

Monitoring intracranial pressure in rodent&#160;models of nontraumatic intraventricular hemorrhage is not common in the current literature. Herein, we demonstrate a technique for measuring intracranial pressure, mean arterial pressure, and cerebral perfusion pressure during intraventricular hemorrhage in a rat&#160;animal model.

非外傷性脳室内出血げっ歯類モデルにおける頭蓋内圧モニタリング

Survivors of intraventricular hemorrhage are often left with significant long-term memory impairment; thus, research utilizing intraventricular hemorrhage ...

Intraventricular Drug Delivery and Sampling for Pharmacokinetics and Pharmacodynamics Study

Although the blood-brain barrier (BBB) protects the brain from foreign entities, it also prevents some therapeutics from crossing into the central nervous system (CNS) to ameliorate diseases or infections. Drugs are administered directly into the CNS in animals and humans to circumvent the BBB. The present protocol describes a unique way of treating brain infections through intraventricular delivery of antibiotics, i.e., polymyxins, the last-line antibiotics to treat multi-drug resistant Gram-negative bacteria. A straightforward stereotaxic surgery protocol was developed to implant a guide cannula reaching into the lateral ventricle in rats. After a recovery period of 24 h, rats can be injected consciously and repeatedly through a cannula that is fitted to the guide. Injections can be delivered manually as a bolus or infusion using a microinjection pump to obtain a slow and controlled flow rate. The intraventricular injection was successfully confirmed with Evans Blue dye. Cerebrospinal fluid (CSF) can be drained, and the brain and other organs can be collected. This approach is highly amenable for studies involving drug delivery to the CNS and subsequent assessment of pharmacokinetic and pharmacodynamic activity.

Delivery of therapeutics directly into the central nervous system is one way of circumventing the blood-brain barrier. The present protocol demonstrates intracerebroventricular injection for subsequent collection of cerebrospinal fluid and bodily organs. This facilitates the investigation of drug pharmacokinetics and pharmacodynamics in animal models for developing new treatments.

Although the blood-brain barrier (BBB) protects the brain from foreign entities, it also prevents some therapeutics from crossing into the central nervous ...

A Model for Encephalomyosynangiosis Treatment after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice

There is no effective treatment available for most patients suffering with ischemic stroke, making development of novel therapeutics imperative. The brain's ability to self-heal after ischemic stroke is limited by inadequate blood supply in the impacted area. Encephalomyosynangiosis (EMS) is a neurosurgical procedure that achieves angiogenesis in patients with moyamoya disease. It involves craniotomy with placement of a vascular temporalis muscle graft on the ischemic brain surface. EMS has never been studied in the setting of acute ischemic stroke in mice. The hypothesis driving this study is that EMS enhances cerebral angiogenesis at the cortical surface surrounding the muscle graft. The protocol shown here describes the procedure and provides initial data supporting the feasibility and efficacy of the EMS approach. In this protocol, after 60 min of transient middle cerebral artery occlusion (MCAo), mice were randomized to either MCAo or MCAo + EMS treatment. The EMS was performed 3-4 h after occlusion. The mice were sacrificed 7 or 21 days after MCAo or MCAo + EMS treatment. Temporalis graft viability was measured using nicotinamide adenine dinucleotide reduced-tetrazolium reductase assay. A mouse angiogenesis array quantified angiogenic and neuromodulating protein expression. Immunohistochemistry was used to visualize graft bonding with brain cortex and change in vessel density. The preliminary data here suggest that grafted muscle remained viable 21 days after EMS. Immunostaining showed successful graft implantation and increase in vessel density near the muscle graft, indicating increased angiogenesis. Data show that EMS increases fibroblast growth factor (FGF) and decreases osteopontin levels after stroke. Additionally, EMS after stroke did not increase mortality suggesting that protocol is safe and reliable. This novel procedure is effective and well-tolerated and has the potential to provide information of novel interventions for enhanced angiogenesis after acute ischemic stroke.

The protocol aims to provide methods for encephalomyosynangiosis-grafting of a vascular temporalis muscle flap on the pial surface of ischemic brain tissue-for the treatment of non-moyamoya acute ischemic stroke. The approach's efficacy in increasing angiogenesis is evaluated using a transient middle cerebral artery occlusion model in mice.

マウスにおける中大脳動脈閉塞性脳卒中後の脳筋シナジア症治療モデル

There is no effective treatment available for most patients suffering with ischemic stroke, making development of novel therapeutics imperative. The ...

<meta charset="utf8"></head><body>蛍光色素を用いたマウスの血液脳関門破壊の可視化

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is a complex process influenced by several factors, such as the concentration of dyes in the blood, permeability of brain vessels, duration of dye extravasation, and reduction in dye concentration in the tissue due to degradation and diffusion. In a mild traumatic brain injury model, exposure to blast-induced shock waves (BSWs) triggers BBB breakdown within a limited time window. To determine the precise sequence of BBB breakdown, Evans blue, and fluorescein isothiocyanate-dextran were injected intravascularly and intracardially into mice at various time points relative to BSW exposure. The distribution of dye fluorescence in brain slices was then recorded. Differences in the distribution and intensity between the two dyes revealed the spatiotemporal sequence of BBB breakdown. Immunostaining of the brain slices showed that astrocytic and microglial responses correlated with the sites of BBB breakdown. This protocol has broad potential for application in studies involving different BBB breakdown models.

<meta charset="utf8"></head><body>軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

A method was developed to visualize dye extravasation due to blood-brain barrier (BBB) breakdown by administering two fluorescent dyes to mice at different time points. The use of glycerol as a cryoprotectant facilitated immunohistochemistry on the same sample.

軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is ...

連続IV注入は、脳卒中誘発脳浮腫を研究するためにマウスにおけるアルギニンバソプレシン受容体拮抗コニバプタンのための選択の治療のルートであります

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マウスにおける反復低酸素プレコンディショニングと過渡中大脳動脈閉塞後に神経血管保護の定量

くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積

げっ歯類の脳サンプルの単一のセットで脳卒中後脳浮腫、梗塞ゾーンおよび血液脳関門破壊を測定する

外傷性脳損傷に対する神経炎症および血行動態応答のシステム解析

フィブリン富化およびtPA感受性光血栓性脳卒中モデル

非外傷性脳室内出血げっ歯類モデルにおける頭蓋内圧モニタリング

Intraventricular Drug Delivery and Sampling for Pharmacokinetics and Pharmacodynamics Study

マウスにおける中大脳動脈閉塞性脳卒中後の脳筋シナジア症治療モデル

軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価