This study was funded by grants from the National Institutes of Health (NIH), Heart, Lung, and Blood Institute (NIHLB): K01-HL-121045, K08-HL-094703, 5T32HL007411-35, P20 HL101425, U01 HL100398. 
Imaging and tissue processing (after NaOH maceration) were performed through the use of the Vanderbilt University Medical Center (VUMC) Cell Imaging Shared Resource (CISR) (supported by NIH grants CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 and EY08126). We are especially grateful to the VUMC CISR core directors (Dr. Sam Wells and Dr. W. Gray (Jay) Jerome) for valuable technical advice and also for providing core space and resources for the purposes of filming the technique highlighted in this paper. 
We would like to extend our deepest appreciation to Dr. Yan Ru Su and Ms. Kelsey Tomasek in the Cardiology Core Lab for Translational and Clinical Research at Vanderbilt University for providing technical expertise and for collecting human tissue samples used in this study.

倫理文：動物取扱プロトコルはヴァンダービルト施設内動物管理使用委員会（IACUCによって承認されたが数M / 117分の10（豚）とM / 219分の10（マウス）プロトコルとAAALACインターナショナルの基準に従って行いました。バンクヒト心筋組織の使用法は、ヴァンダービルト大学医療センターIRB（プロトコル番号100887）によって承認されました。 1.サンプルの収集と保管<ol><li> 0.1Mリン酸緩衝液（PB）溶液中の新鮮な4％グルタルアルデヒドを行います。 注意：グルタルアルデヒドは毒性があり、ヒュームフード内で手袋や作業を着用してください。 <ol><li>千ミリリットルのdH 2 Oに21.8グラムの Na 2 HPO 4および6.4グラムののNaH 2 PO 4。 量子サティス （適量）を使用して、PB、pH7.4の0.2Mの原液を作ります</li><li> PBストック溶液の2.5ミリリットルと2.1ミリリットルのdH 2 Oに50％グルタルアルデヒドの400μLを追加</li></ol></li><li> 2 cより（も大きくチャンクを浸していません4％グルタルアルデヒド溶液中に組織のM 2）。注：より小さな断片も使用することができるが、簡単にプロトコルの後工程を容易にするために、眼によって視覚化されるのに十分なサイズ（無5mm未満2）であるべきです。 </li><li> 4℃で無期限に保存した後、1時間室温でインキュベートします。 </li></ol>心臓組織の脱細胞化2。 <ol><li> 10gのNaOHペレット/ 100mlでのdH 2 Oを用いて新鮮な10％NaOH水溶液を加えます 注意：NaOHのソリューションは、腐食性であり、アルカリ火傷を引き起こす可能性があり、手袋を着用してください。 </li><li> dH 2 Oに組織をすすぎます</li><li> （オフホワイトや白に赤茶色から組織変化まで）10日 - 6のために室温で10％NaOH溶液中でインキュベートします。 </li><li>組織が ​​透明になるまでの dH 2 Oですすいでください。 </li><li>室温で4時間、1％タンニン酸で組織を浸し。 4ミリリットルのdH 2 Oあたり1ミリリットル5％原液を使用して 注意：タンニン酸強い刺激で、手袋を着用してください。 </li><li>一晩のdH 2 Oですすいでください。 </li></ol> 3.オスミウム酸染色法と（安全のためのドラフトチャンバー内）心臓組織の脱水<ol><li> 21.4グラムのカコジル酸ナトリウム、10.0グラムの塩化カルシウムと450ミリリットルのdH 2 Oを使用してカコジル酸ナトリウム緩衝液の0.2Mの原液を作りますpHを7.4に調整するために必要な混合物は、その後、塩酸を加える。Qsを500 mlまでのdH 2 Oで 注意：ナトリウムカコジル酸および塩酸がヒュームフードに手袋や作業を着用し、有毒です。 </li><li> 50ミリリットルのdH 2 O中に1グラム四酸化オスミウム結晶を溶解することにより、安全性のためのヒュームフード内で四酸化オスミウムの2％水性原液を作ります 注意：四酸化オスミウムが厳しい吸入の危険性です。粘膜や眼球の蒸気固定が可能であり、それゆえにのみ手袋とドラフト内で取り扱います。スプラッシュガードをお勧めします。 </li><li> dHで1：（原液1を混ぜ、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中で組織をすすぎます<su回転子（または穏やかな撹拌に5分間、B&gt; 2 O））。 </li><li> 3バッファリンス、合計二回前の手順を繰り返します。 </li><li>回転子に1時間：（1株カコジル酸ナトリウムおよび株式四酸化オスミウム1を混ぜる）、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中の1％四酸化オスミウムで組織を浸し。 </li><li> 0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中で回転体上で5分間、3回組織をすすぎます。 </li><li>ローテーター上で15分ごとに、エタノールの増加濃度（30％、50％、75％、85％、95％、および最終的に100％）を用いて組織をすすぎます。 </li></ol> SEM 4.断面表面の準備<ol><li>また、100％のエタノールを含む浅いペトリ皿に100％エタノール中に組織を移します。 </li><li>両側の平坦部が互いに接触していると、切刃が試料上等辺三角形の二辺を形成するように交差するように2つの非常に鋭利なカミソリ刃を保持します。これを達成するために、試料の右端側つのブレードを配置するために左手を使用してカットが左方向。同時に、これまでのサンプルとスライス右方向の左側の2番目のブレードを配置するために右手を使用しています。このように、ブレードは、単一の滑らかなカットを作るために、反対方向から互いに対してスライドさせることになります。 </li><li>好ましくは、試料を損傷することなく、可能な限り大きな表面積を露出し、最小限の歪みや引き裂く力で試料の非常にきれいにカットを作るためにお互いに対してフラットブレード側面をスライドさせます。 </li><li> SEMでの検査のために可能な限りクリーンな断面の表面を露出するために、各試験片について、この手順を繰り返します。 </li></ol>心臓組織の5臨界点乾燥（CPD） <ol><li>組織は常に100％エタノールに残っていることを確認して、臨界点乾燥機（CPD）のサンプルホルダーに組織を転送するためにへらやピンセットを使用してください。ホルダーをエタノールに浸漬し、転送は数秒を超えない空気に露出した組織で達成されていることをされていることを確認してください。 </li><li>私たち当たりのCPDを操作液体二酸化炭素とエタノールを置き換えるために3パージ・アンド・フィルサイクルを完了するために、小胞体のマニュアル。 </li><li>サンプルの臨界点乾燥を達成し、CO 2の制御されたガス抜きで大気圧に戻すことユーザーズマニュアル当たりのCPDを操作します。 </li></ol> SEMのための心臓組織標本の6取付<ol><li>アルミスタブの上面にカーボン接着剤タブを付着させることにより、各検体のためのSEMの試料スタブを準備します。 </li><li>実体顕微鏡の助けを借りて、慎重に関心の断面表面が（離れてタブから、目に見える）上に向けて接着剤タブに試料を付着し、サンプルのスタブ表面の平面に平行にできるだけ近いです。プローブまたは関心の表面に触れないでください。 </li><li>ペイントアプリケーションのための理想的な、テーパー状のブラシを達成するために木製のアプリケータースティックを破ります。スタブへの密着性を向上させるために、ベースと試料の側面に銀やカーボン塗料を適用します。 </li><li>地面に目的物の表面からの電荷の経路を提供するために、関心の表面の端部に銀やカーボンペイントまでの非常に細い線を拡張します。 </li><li>地面にこのように金属スタブの炭素タブ表面から導電性経路を提供するために、炭素タブの周囲に銀やカーボン塗料の2または3小さな描点を適用し、。 </li><li>導電性塗料は2時間乾燥することができます。 </li><li>金 - パラジウム合金または金の - 比較的重いコーティング（40〜30nm程度の目標範囲）を適用するユーザのマニュアルあたりのスパッタコーターを操作します。約0.1ミリバールに試料室ポンプ。 40秒にタイマーを設定します。 8時位置（中程度のアルゴンガス流量）にオープンセットバルブ。 Startを押し30mAでスパッタコーティングを開始します。パープルグロー放電は、試料室に表示されるはずです。 </li></ol>ハートの組織標本の7 SEM検査<ol><li>イメージングpを最小にするために比較的低加速電圧での走査型電子顕微鏡を行いますサンプル（充電）に乏しい電荷散逸に関連したroblems。推奨初期撮像条件である：加速電圧が5kV、10ミリメートル作動距離。 </li><li>経験豊富なオペレータの支援を受けて、採用は、z次元でかなりの長さのために延びた複数の焦点面における繊維、または繊維のフォーカスを必要とする撮影条件で被写界深度を拡張するために作動距離の増加しました。 <ol><li>ここで使用される顕微鏡のためのユーザインタフェースへのアクセスで、右上の[ナビゲーション]タブを（ 材料の表を参照してください）。 </li><li>ステージ]メニューから[座標]タブにアクセスします。 、作動距離を増加させるZ座標のためのミリメートルで、より大きな値を入力するには、次に入力された作動距離に試料ステージを移動するタブに移動をクリックします。 </li></ol></li><li>経験豊富なオペレータの支援を受けて、電子ビームに関心直交の表面を配置するために、試料の傾きや回転を採用しています。 10〜30 DEGRの追加の傾きEESこの位置からマトリクス構造の観察やドキュメントを改善することができます。 <ol><li>フォーカスされた作動距離に注意して、ここで使用される顕微鏡のために、（ 材料の表を参照）ユーザーインターフェイスで、関心の調製された表面面の外周付近の標本を集中するために、その後、左または右にスライドをクリックし、マウスの右ボタンを押したまま。 </li><li>表面の反対側の端部付近に移動し、フォーカスを繰り返すマニュアルユーザーインターフェースのジョイスティックで移動します。作動距離が第一の位置にほぼ等しくない場合には、傾斜試料を（7.2を参照）、Tにおける傾き値が座標入力ステージメニューの座標タブを使用して、両方の場所に近似合意を達成します。 </li><li>試料を90度回転（フィールド座標Rに値を入力します）と、すべての位置はほぼ同じ作動距離に集束されるまで、プロセスを繰り返します。 注：可変圧力SEMは、電荷散逸を改善するために使用することができます可能な場合は。高真空走査電子顕微鏡のための標準的な動作モードです。 </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

クロスセクションの表面調製は、プロトコル中に最も重要なステップです。臨界点乾燥工程に導入されるまで、微細構造を維持するために、脱水標本はすべての回で100％エタノールのままでなければなりません。標本は浅い皿にエタノールに浸されている間そこでEM検査のための表面を達成するための検体のスライスを行わなければなりません。露出面に触れたり、その後の取り扱い中にプローブされていないことも重要です。プロトコルのSEM部は関係なく、サンプル起源の基本的な電子顕微鏡のトラブルシューティングが必要な場合がありますが、重大な修正は、同様の行列観測のための他の組織タイプへのこの技術の適用のために予想されていません。繊維状のサンプルから収集した画像は、貧しい電荷散逸（「充電」）によって導入されたアーティファクトを起こしやすいです。充電の問題は、通常、走査速度を増加させる、加速電圧（別名滞留時間を減少させることによって最小化することができます）電子ビームのスポットサイズを小さくします。いくつかのスキャンの統合が遅くなり、より高品質な単一のスキャン画像内に存在する電荷アーティファクトなしでノイズの品質に匹敵する信号の画像を生成するチャージアーチファクトを回避するのに十分に迅速に収集しました。 この技術は、本質的に定性的であり、したがって、可視化の構造的な違いは、種々の発生または疾患状態に関連するかもしれない方法を確認するために（ 例えば 、マッソンの三重またはpicoseriusレッド染色、ヒドロキシプロリン含量の測定、質量分析およびRNASeq）定量的測定と一緒に考えたときに補完します。細胞外マトリックスは、体内のほとんどすべての器官の必須成分であるため、この制限にもかかわらず、この方法は、特に心臓の線維症を超えて重要です。心臓では、心臓マトリックスは、ストレッチ複合体によって特徴付けられる連続ポンピングのための重要な機械的支持を提供ひねり、およびデフ人間の平均寿命にわたって発生&gt; 25億ビートのための酸素と脱酸素化血液49の最適なエントリや流出を与えるormation、。心臓組織の極めて低い再生能力を考えると、文脈のニーズに応じて改造することができますダイナミック行列は論理的な意味があります。想像力のわずかな伸びで、一つの有害な線維症を制限しながら、治癒過程を強化するために、マトリックスのリモデリングを操作するための治療標的が存在することが推測かもしれません。最低でも実証された技術の適用は、心臓マトリックスの精巧さと美しさを紹介し、そうすることで、さらにその機能的重要性を強調しています。 定量的な測定値は、実質的にすべての実験的研究の評価のコア原則であるが、技術は、ここで強調表示されただけでなく、標準的な行列の測定を補完する定性的超微細構造の変化を明らかにするために使用することができしかし、質的な変化を強調する基本的な生化学的変化を理解するための代替調査パスを示唆している可能性があります。この技術の予想される将来のアプリケーションは、マトリックスの変化が疾患プロセスの構成要素であるため、他の臓器を研究するための心疾患モデルとマトリックスの変化を評価するための補完的なツールとしてのヒト組織における使用、ならびに広く使用されています。

Fibrosis disrupts the normal myocardial collagen network, which is critical for normal mechanistic functions of cardiomyocytes 1,2 as well as for inter-cellular communication, intracellular signaling, and cell survival 3. The development of fibrosis is a major determinant of cardiac function, and fibrotic remodeling of the cardiac interstitium arising from a variety of etiologies leads to increased left ventricular stiffness and diastolic dysfunction 4. Myocardial fibrosis may also lead to arrhythmias, and whether the progression of fibrotic remodeling is a general or local phenomenon, it is highly associated with a poor prognosis in patients with ischemic and non-ischemic cardiomyopathy 5. Likewise, the absence of myocardial fibrosis is a strong predictor of ventricular functional recovery and long-term survival 6. 
The hallmark of fibrosis is the deposition of excess collagen, which has the tensile strength of steel 7 and can adversely affect cardiomyocyte function on multiple levels. Mechanical forces resulting from an excessively collagenous matrix can lead to cardiomyocyte atrophy 8,9, passive tissue stiffness 10, tonic contraction-induced myocardial stiffness 11-13, and reduced delivery of oxygen to the remaining population of cardiomyocytes. Gap junction coupling of cardiomyocytes and myoFbs can also compromise the heart's electrical characteristics, creating a greater risk for the development of arrhythmias 14-16. Perivascular fibrosis alters vasomotor reactivity of intramural coronary arteries and arterioles 17 and contributes to luminal narrowing that reduces the supply of oxygen and thus the survival of cardiomyocytes 17-22. Pathogenic fibrotic and electrical remodeling, emanating from an initial site of ischemic injury or energy imbalance, inevitably progresses to heart failure. 
Cardiomyocyte necrosis initiates the fibrotic response, and subsequent adverse fibrotic remodeling can occur irrespective of etiology. Finding a way to control cardiac fibrosis would be clinically beneficial for the treatment of ischemic and idiopathic cardiomyopathies, hypertensive heart disease, hypertrophic cardiomyopathy, valvular heart disease and dystrophinopathies 23-42. Regardless of how the fibrotic disease process begins, soluble, profibrotic factors can cross the interstitial space and provoke activation of interstitial and adventitial fibroblasts at sites remote to the initial fibrotic scar, creating a cascade effect that ultimately leads to heart failure. The optimum scenario would be to exploit the fibrillogenic process using a targeted therapeutic that can be applied during the compensative hypertrophic stage of cardiomyopathy before it progresses to systolic pump failure, diastolic heart failure, or other end-stage outcomes. The ultimate goal would be to reverse fibrosis so that dead cardiomyocytes can be replaced and heart function restored completely. 
The importance of the matrix is widely understood, yet methods to study the matrix are limited mainly to quantitative measurements of major structural components, particularly collagen, and relative levels of different matrix and matricellular proteins. This protocol highlights a rarely used technique that is useful for assessing qualitative differences in the cardiac matrix. This technique has been recently used to compare and contrast fundamental differences in heart matrices from different etiologies of heart disease (in human explants), to examine hearts from post-infarcted pigs treated with the glial growth factor (GGF) isoform of neuregulin-1&#946;, relative to untreated animals 43, and to probe for differences in the matrices of cardiac tissues from mdx mice (a commonly used animal model of Duchenne Muscular Dystrophy) at different ages and compared to wild-type controls. This technique was first introduced by Drs. Caulfield and Borg in 1979 44, but few studies have since employed this powerful technique 45-47, re-introduced here with only slight modification. This methodology is a valuable research tool, because it provides qualitative information about extracellular matrix ultrastructure that might otherwise be overlooked when simply measuring matrix component content and/or level of fibrosis.

<table><tbody><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12340</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Carbon Adhesive</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12664</td><td>30 g</td></tr><tr><td>Carbon Adhesive Tabs</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77825</td><td>order to fit stubs</td></tr><tr><td>Double Edge Razor Blades Stainless Steel</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td>250/pkg</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15055</td><td>450 ml</td></tr><tr><td>Gluteraldehyde, 50% Solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16310</td><td>EM grade, distillation purified</td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16760 or 16770</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Monosodium Phosphate NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251-250G</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19100</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Silver Conductive Adhesive</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12686-15</td><td>15 g</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Tannic Acid, 5% Aqueous&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>21702-5</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Trihydrate Sodium Cacodylate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12300</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Gold-palladium Alloy or Gold</td><td>Refining Systems, Inc.&amp;nbsp;</td><td>varies</td><td>specific to the sputter coater make and model</td></tr><tr><td>Critical Point Dryer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>850</td><td></td></tr><tr><td>Plain Wooden Applicators</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-102</td><td></td></tr><tr><td>Quanta 250 Environmental SEM</td><td>FEI</td><td>Q250 SEM</td><td></td></tr><tr><td>Sputter Coater</td><td>Cressington Scientific Instruments Ltd.</td><td>Model 108</td><td></td></tr><tr><td>Alluminum SEM Sample Stubs</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>75220-12</td><td>specific to the miscroscope</td></tr></tbody></table>

scanning electron microscopy of macerated tissue to visualize the extracellular matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

強調表示された技術は、ブタから未使用のヒト心臓移植ドナーからの心臓組織（ 図1）は 、移植レシピエントからの外植組織を、野生型およびジストロフィーマウスの心臓（ 図3）に、および心筋梗塞後の心臓サンプルにおいて適用されました心臓傷害のモデル（ 図2）。 図1に示すように 、人間の心臓のマトリックスは、断面で見たときに、ハニカム状のパターンを表示する架橋されたタンパク質の複雑な織り方です。 図1の平面図を検討する際に各「ハニカム」構造は、通常、単一の筋細胞を回避し、約40μmの幅である。介在板で接続されたときに、いくつかの心筋細胞はメタファー「トンネル」を通って縦方向に実行されているロッドとして想定することができます三次元に拡張される。また、1ハイライト図切断工程（ 図1、右上）の間に「強打」されたセクションよりも高い精度がより多くの啓示地形的なデータが得られると切断手順の重要性、（ 図1、左上）。 常駐心臓細胞、血管、およびSEMの処理の前に、循環細胞の除去は、全体の心臓組織ブロックをSEMにより少ないかなりあろう追加の超構造の詳細が明らかに。各個々のコラーゲン「ストラット」は、例えば（ 図1、下のパネル）が明らかに等間隔で整列しサルコメアを筋原線維に垂直です。この配置は、延伸に対して布体と形を維持するのに役立つ織物の「縦糸と横糸」に類似の収縮と弛緩のサイクルの間に及ぼされる反作用変形によって心臓構造を維持する助けにも適しています。 FO：= &quot;1&quot;&gt;キープtogether.withinページ<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54005/54005fig1.jpg" /> 図1：未使用のヒトドナー心臓から得られた脱細胞化左心室組織における細胞外マトリックスの三次元配置の代表的な走査型電子顕微鏡写真は、上の2つのパネルは、低倍率（バー= 500μm）とで断面の行列を示します正常なヒト心臓組織のアーキテクチャの空中写真を提供します。より高い倍率では、人はよりよい規則的な間隔の筋線維（中央左と右のパネルバー=100μmから50μmで、それぞれ）のための機械的支持を提供支え繊維の典型的なハニカム状の構造を観察することができます。精密検査の際に、それぞれの「ハニカム」居住者心筋細胞（底がそれぞれ、= 10ミクロンと5ミクロンを左と右のパネルバー）に垂直に互いにしばらくと並行して編成された繊維で構成されています。ttps：//www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54005/54005fig1large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 構造情報の提供に加えて、脱細胞化組織のSEMは、心筋の損傷又は非有害な形態に応じて、細胞外マトリックスの変化の意味のある、定性的評価を可能にすることができます。例えば、この技術は、最近後梗塞ブタ心臓組織43の細胞外マトリックスを調べました。この大動物実験の過程で、心臓マトリックスの変化を打つ呈し、心不全、静脈内NRG-1β投与した後の梗塞豚のための潜在的な治療として、NRG-1βのGGF2アイソフォームの有効性を評価するために特別に設計されました、ポスト梗塞動物の未処理の心臓組織に比べ。これらの結果は、その後、43を発表し、TEましたchniqueはこの最初の、偶然の発見時に構築するための貴重なツールとなってきた。 図2は、未処理とNRG-1βで処理した行列間の抜本的な行列の違いを強調表示し、その研究の過程で生成され例の顕微鏡写真を含みます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54005/54005fig2.jpg" /> 図2：未処理及びNRG-1β -処置豚 における左心室細胞外マトリックスの代表的な走査型電子顕微鏡写真は 、NaOHのマセラシオン後 、断面がマトリックスは、未処理、心筋梗塞後における繊維の定期的な空間的配置を強調（MI後）豚（左上）、（右上）、MI後NRG-1βで処理した動物と比較。経度で表示すると、未処理のブタにおけるマトリックスは、NRG-1βで処理した豚の行列に対し、厚く、マット状の外観（左下）を示します繊維の定期的な空間的配置（右下）が表示されます。ホワイトバー=40μmの（すべての4つのパネル）。より詳細な結果および図面は、関連原稿43に含まれている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54005/54005fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ジストロフィーの心の中に起こるマトリックスの変化の探査もデュシェンヌ型筋ジストロフィーの心筋症（DMD）の動物モデルの進行と開発に定性的な洞察をもたらしました。 mdxマウス、DMDの一般的に使用されるマウスモデルでは、野生型および固定及びNaOH処理後のSEMによって観察MDX心間で有意な年齢依存性の違いがあります。 図3に示すように 、マトリックス成 ​​分は、正常マウスに機能的なジストロフィンを相対的に欠く6週齢のmdx心臓比較的正常でした。もっとint型eresting、細胞外マトリクス組織は、心臓内のDMDの進行性の性質を示す、明確に破壊または若いmdxマウスと比較して、古いジストロフィン欠損マウスでは、おそらく劣化しました。 mdxマウスは、それらが多くのより穏やかな心筋症の表現型とDMD 48を有するヒトよりも遅い死亡率を示すという事実に人間のDMD心筋症の不十分代表的なものであるため、このような深遠な違いは、予想されませんでした。これは、心臓機能の小さな変化が本稿で示さ可視化技術を使用してキャプチャすることができることを示唆しています。この方法論はまた、全く現在、同様に利用可能な線維症を標的とする治療法が存在しないいる他の器官の細胞外マトリックス、に容易に適合すべきです。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54005/54005fig3.jpg" /> 図3：左ヴェンの代表的な走査型電子顕微鏡写真mdx マウス 対野生型tricular細胞外マトリックスは 、野生型マウスにおける左心室心臓マトリックス（上部パネル）は、他の種で観察されたものと同様です。外観（中央のパネル）で、わずかに「ふわふわ」が、生後6週でmdxマウスにおけるマトリックスは、比較的正常に見えます。逆に、より古いmdxマウスの心臓のマトリックスは、ジストロフィープロセスは定性的に固定、NaOHを、浸軟組織におけるSEMを用いて捕捉され得ることを示す（下のパネル）激しく変性現れます。ホワイトバー=10μmの（すべての3つのパネル）。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54005/54005fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

細胞外マトリックスを視覚化するために浸軟組織の電子顕微鏡をスキャンします

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

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Universidad San Sebastian

Research

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Biology

9.9K ビュー.  Vanderbilt University Medical Center. Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

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Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). Using proteomics, we have previously identified more than 150 ECM and ECM-associated proteins in cardiovascular tissues. Notably, many ECM proteins are glycosylated. This post-translational modification affects protein folding, solubility, binding, and degradation. We have developed a sequential extraction and enrichment method for ECM proteins that is compatible with the subsequent liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis of intact glycopeptides. The strategy is based on sequential incubations with NaCl, SDS for tissue decellularization, and guanidine hydrochloride for the solubilization of ECM proteins. Recent advances in LC-MS/MS include fragmentation methods, such as combinations of higher-energy collision dissociation (HCD) and electron transfer dissociation (ETD), which allow for the direct compositional analysis of glycopeptides of ECM proteins. In the present paper, we describe a method to prepare the ECM from tissue samples. The method not only allows for protein profiling but also the assessment and characterization of glycosylation by MS analysis.

This paper describes a methodology to prepare cardiovascular tissue samples for MS analysis that allows for (1) the analysis of ECM protein composition, (2) the identification of glycosylation sites, and (3) the compositional characterization of glycan forms. This methodology can be applied, with minor modifications, to the study of the ECM in other tissues.

細胞外マトリックスのグライコ：質量分析法を用いて無傷の糖ペプチドの分析のための方法

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

生化学

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global reorganization and realignment of the gel microstructure. This process proceeds in a complex manner that is dependent in part on the interplay between the location of the cells, the geometry of the gel, and the mechanical constraints on the gel. To better understand how these variables produce global fiber alignment patterns, we use time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy coupled with an environmentally controlled bioreactor to observe the compaction process between geometrically spaced explants (clusters of fibroblasts). The images are then analyzed with a custom image processing algorithm to obtain maps of the strain. The information obtained from this technique can be used to probe the mechanobiology of various cell-matrix interactions, which has important implications for understanding processes in wound healing, disease development, and tissue engineering applications.

Time-lapse microscopy and image processing techniques were used to observe and analyze fibroblast-mediated gel compaction and fibrin fiber realignment in an environmentally controlled bioreactor over a 48 hr&#160;period.

線維芽細胞媒介フィブリンゲル圧縮の観察と定量

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

生物工学

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

落射蛍光による組織マトリックスのコンポーネントと二光子顕微鏡の長期生体内免疫蛍光イメージング

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

2Dと3Dの肌の改善<em&gt;インビトロ</em分子クラウディングの使用&gt;モデル

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

免疫・感染学

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

シングルおよび多細胞コンテキストでInvadopodia媒介細胞外マトリックスタンパク分解の定量測定

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

生物学

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

質量分析のためのペプチドに組織および消化から細胞外マトリックスタンパク質の濃縮

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

細胞由来の細胞外マトリックスの急速な、単離、機能性研究のためのスケーラブルな方法、および分析

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

<meta charset="utf8"></head><body>穿刺創止血とモンタージュ電子顕微鏡法

Puncture Wound Hemostasis and Preparation of Samples for Montaged Wide-Area Electron Microscopy Analysis

Hemostasis, the process of normal physiological control of vascular damage, is fundamental to human life. We all suffer minor cuts and puncture wounds from time to time. In hemostasis, self-limiting platelet aggregation leads to the formation of a structured thrombus in which bleeding cessation comes from capping the hole from the outside. Detailed characterization of this structure could lead to distinctions between hemostasis and thrombosis, a case of excessive platelet aggregation leading to occlusive clotting. An imaging-based approach to puncture wound thrombus structure is presented here that draws upon the ability of thin-section electron microscopy to visualize the interior of hemostatic thrombi. The most basic step in any imaging-based experimental protocol is good sample preparation. The protocol provides detailed procedures for preparing puncture wounds and platelet-rich thrombi in mice for subsequent electron microscopy. A detailed procedure is given for in situ fixation of the forming puncture wound thrombus and its subsequent processing for staining and embedding for electron microscopy. Electron microscopy is presented as the end imaging technique because of its ability, when combined with sequential sectioning, to visualize the details of the thrombus interior at high resolution. As an imaging method, electron microscopy gives unbiased sampling and an experimental output that scales from nanometer to millimeters in 2 or 3 dimensions. Appropriate freeware electron microscopy software is cited that will support wide-area electron microscopy in which hundreds of frames can be blended to give nanometer-scale imaging of entire puncture wound thrombi cross-sections. Hence, any subregion of the image file can be placed easily into the context of the full cross-section.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:構造血液学の進歩による血小板動態の解明

A puncture wound procedure for hemostatic thrombus formation is presented here. The formed thrombi are large and are hundreds of microns in diameter. Hence, volume imaging approaches are appropriate. We suggest montaged wide-area transmission electron microscopy as a high-resolution approach available to many and detail a preparative protocol.

穿刺創の止血とモンタージュ広域電子顕微鏡分析のためのサンプルの準備

Hemostasis, the process of normal physiological control of vascular damage, is fundamental to human life. We all suffer minor cuts and puncture wounds ...

細胞外マトリックスを視覚化するために浸軟組織の電子顕微鏡をスキャンします

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細胞外マトリックスのグライコ：質量分析法を用いて無傷の糖ペプチドの分析のための方法

線維芽細胞媒介フィブリンゲル圧縮の観察と定量

落射蛍光による組織マトリックスのコンポーネントと二光子顕微鏡の長期生体内免疫蛍光イメージング

2Dと3Dの肌の改善

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

シングルおよび多細胞コンテキストでInvadopodia媒介細胞外マトリックスタンパク分解の定量測定

質量分析のためのペプチドに組織および消化から細胞外マトリックスタンパク質の濃縮

細胞由来の細胞外マトリックスの急速な、単離、機能性研究のためのスケーラブルな方法、および分析

穿刺創の止血とモンタージュ広域電子顕微鏡分析のためのサンプルの準備

穿刺創の止血とモンタージュ広域電子顕微鏡分析のためのサンプルの準備