Name: intra-tracheal administration of haemophilus influenzae in mouse models to study airway inflammation
Uploaded: 2016-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
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We thank Dr. Carson Harrod for critical reading of the manuscript. We also thank Mr. Minghui Zeng and Drs. Mahesh Kathania and Prashant Khare for their contributions. This work was supported by grants from the American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) and the Sammons Cancer Center (Pilot Project grant) to K. Venuprasad.

全ての実験は、ベイラー研究所の施設内動物管理使用委員会（IACUC）のガイドラインに従って行いました。 1.培養非分類できるインフルエンザ菌 （のNTHi）及び接種物を準備<ol><li>チョコレート寒天プレート上にプレートのNTHiし、37℃で一晩、加湿CO 2インキュベーター内で逆さまにプレートを保持し、5％CO 2。次の日、文化ブレインハートインフュージョンブロス中の細菌。その後、滅菌1.5ミリリットルチューブに培養液の1ミリリットルを追加します。 </li><li>室温で5分間、4000×gで遠心分離します。その後、上清を破棄し、滅菌1×1mlのPBSにペレットを再懸濁。一度、この手順を繰り返します。 </li><li> 1×PBS900μlの中に再懸濁した溶液100μlを移し、分光光度計で600 nmの波長で希釈した培養の吸光度を測定します。 </li><li>生存率およびコロニー形成単位を決定しますチョコレート寒天プレート上で1：10の連続希釈を培養し、37℃、5％CO 2で一晩インキュベートすることによって接種物のS（のCFU）。 </li><li>前のステップから決定生存率およびCFUをに基づいて、20×10 6 CFU / mlの最終濃度になるように接種材料を調整します。 </li></ol> 2.気管内（it）点眼<ol><li> 150 mg / mlでケタミン+ 20 mg / mlとキシラジン溶液でマウスを0.1ml / 10g体重で腹腔内マウス（腹腔内）注射します。手順は、動物を暖かく保つために、光源とフードの中で行われるべきです。 </li><li>マウスが十分に麻酔をかけていることを確認するために、マウスのインターデジタルスペースピンチ。 </li><li>その背中の上でマウスを置きます。首の腹側領域を剃るとクロルヘキシジンと70％のエチルアルコールで消毒します。 </li><li>ラット歯鉗子を使用して、首の上部腹の部分の皮膚を持ち上げます。メスを用いて胸腺上記小切開（0.5〜1.0センチメートル）を作りますそして、慎重に気管を露出させるために筋肉を解剖。 <ol><li> 27 G針を1 mlシリンジを使用して、ゆっくりと別の0.05ミリリットルの空気が続くコントロールとして第1または生理食塩水から得られた0.05ミリリットルのNTHi続いて0.05​​ミリリットルの空気を、注入します。約1分間の垂直動物を保管してください。 </li></ol></li><li>手術用接着剤で切開を閉じます。約10分間横に横臥と暖かいマウスを保管してください。 </li></ol> 3. BALFコレクション<ol><li>感染後頸​​椎脱臼により24時間を、マウスを生け贄に捧げます。 </li><li>解剖学的はさみでマウスの腹腔を開き、出血腹大動脈を切りました。肺の腹の部分を公開します。 </li><li>気管を露出し、20ゲージのカテーテルとそれを挿管。 BALFバッファー（1×PBS、0.1％デキストロース、10 U / mlのヘパリン）の0.8ミリリットルを植え付けると穏やかな吸引によって洗浄を集めます。この手順を3回繰り返します。 </li><li> hemocytoを用いBALF懸濁液100μl中の細胞の総数を数えますトリパンブルー染色で倍率10倍の下メートル。 </li><li>修正されたギムザ染色のためのスライドを準備します。 5分間、500×gでサイトスピンし、遠心分離器の適切なウェルにBALFのアリコートを100μl。 10分間スライドを乾燥させ、製造業者のプロトコルに従って修正ギムザ染色を用いて細胞を染色します。 </li><li>このような選別（FACS）蛍光活性化細胞、共焦点顕微鏡、遺伝子発現およびウエスタンブロット11-13のように、その後の分析のために残りの細胞を使用してください。 </li></ol> 4.組織病理学の準備<ol><li>ステップ2.4​​で説明したように組織病理学的分析のために、のNTHiをマウスに感染させます。感染の24時間後、頸椎脱臼により動物を生け贄に捧げます。前述したように、肺や気管を露出するために、解剖学的はさみで胸腔を開いてカットします。その後、気管に20ゲージのカテーテルを挿入します。 </li><li> 4％ホルマリン中で調製2％温かいアガロース溶液で肺を埋めます。かつて肺が完全に膨張され、アガロース溶液を固化させるの肺の上部に氷を置きます。 </li><li>その後、慎重に胸部プラグを取り外し、それを、ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）切片用に処理されるまで、1×PBS中4％ホルマリン50mlの溶液に入れます。 </li></ol> BALF中の細胞を染色する5. FACS <ol><li> 96ウェルV底マイクロタイタープレートにBALF流体から1×10 5個の細胞を置きます。 </li><li> 4℃で3分間、4000×gで300の冷1×PBSμlのスピンで細胞を洗浄。 </li><li> （1：1,000希釈）100μlの1×PBSで細胞を染色溶液で細胞を染色し、室温で15分間保ちます。 </li><li> 4℃で3分間、4000×gでの冷1×PBS300μlで細胞を洗浄。 </li><li> 1を含有するFACS洗浄緩衝液[洗浄緩衝液（1×PBS、2％FBS、1mMのEDTA、0.1％アジ化ナトリウム]100μlに細胞を維持：100に希釈したFc-ブロックを4℃で15分間。 </li><li> 3分間の4000×gで遠心分離細胞とsupを捨てますernatant。 </li><li> 4℃で30分間、FACS洗浄緩衝液中（100希釈）100μlの表面染色カクテルで染色細胞。 </li><li> 4℃で3分間、4000×gでのFACS300μlの洗浄緩衝液で三回細胞を洗浄します。 </li><li>室温で15分間、4％パラホルムアルデヒド100μlの細胞を固定。 </li><li> 4℃で3分間400×gで300μlの1×PBSで2回細胞を洗浄し、FACS洗浄緩衝液300μlに再懸濁。 </li><li>ビーズ、フローサイトメトリーを用いて、単一色の染色のコントロールを行います。 <ol><li> 96ウェルV底マイクロタイタープレートにビーズの一滴を追加し、200μlの1×PBSで洗浄しました。 </li><li> 100μlの1×PBSおよびビーズに染色する抗体の1μl添加し、5分間室温でインキュベートします。 </li><li> 300μlの1×PBSで2回ビーズを洗浄してください。 </li></ol></li><li> 14フローサイトメトリーにより単染色コントロール細胞を分析します。 </li></ol> RNAを単離するために、肺組織の6.均質化<ol><li>感染後、肺の小片（20-40 mg）を収集し、4℃で一晩試薬を安定化RNAに保管してください。そして、次のステップまで-80℃で保管してください。 </li><li> RNA安定化試薬を取り除くために、冷1×PBSで肺組織を洗ってください。 </li><li>溶解バッファー（1ミリリットルの溶解バッファー+10μlのβメルカプトエタノール）を含む1.5 ml遠心チューブに組織を置きます。 </li><li>尖ったハサミを使用して小片に組織をみじん切りにし、20-40秒のためのコードレス電動機ペレット乳棒を用いて均質化します。 </li><li> 5分間氷上で溶解液を保持し、ステップ7.1に進みます。 </li></ol>肺から7 RNAの単離<ol><li> 3分間18,000×gで溶解液を遠心。ピペットで上清を除去し、慎重に新しい1.5 mlチューブに移します。 </li><li>溶解物に70％エタノールの1ボリュームを追加します。ピペッティングにより直ちに混合し、2-4分間待ちます。 </li><li>配置されたスピンカラムに溶解物の700μlにまで移します2 mlのコレクションチューブインチ</li><li> 15秒9600×gで遠心分離し、フロースルーを捨てます。 </li><li> 350μlの15秒間9600×gで厳しい洗浄バッファーと遠心を追加します。フロースルーを捨てます。 </li><li>私が直接スピンカラム・メンブレンに80μlのDNA分解酵素を加え、15分間室温で保管してください。 </li><li> 15秒間9600×gでスピンカラムや遠心に350μlの厳格な洗浄バッファーを追加します。フロースルーを捨てます。 </li><li> 15秒間9600×gで500μlのRNA洗浄緩衝液および遠心分離を追加します。フロースルーを捨てます。 </li><li> 2分間9600×gで500μlのRNAの洗浄バッファーとスピンを追加します。フロースルーを捨てます。 </li><li> 1分間9600×gで新しい2 mlのコレクションチューブと遠心分離機でスピンカラムを配置します。フロースルーを捨てます。 </li><li> 1分間9600×gでスピンカラムや遠心に直接30-50μlのRNaseフリー水を追加します。 -80℃で保存するRNA。 </li><li> RNAseq解析14を実行します 。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここで、我々は、細菌性の肺病原体にマウスの肺を接種するためにユニークな低侵襲の手順を説明します。我々は、この手順では、炎症性シグナル伝達経路の遺伝子が欠損しているマウスを用いて異なる遺伝子の機能を研究するために使用することができることを示しています。この手順はまた、ウイルスおよび真菌肺感染に対する炎症応答を研究するために使用することができます。このような鼻腔内またはエアロゾル吸入などの他の方法に比べて、この手順の利点は、（1）この手順では、病原性接種物は、直接下気道に点眼されています。 （2）接種材料のサイズを制御する能力を、 （3）ハンドラに対する細菌の曝露の危険性を減少させました。 外科的に細菌を浸透させるための気管の曝露は、ケアが周囲の組織、特に血管に損傷を与えないように注意しなければならない重要なステップです。 気管のshへの細菌の点滴窒息によるマウスの死亡の可能性を回避するために慎重に行うことがウルド。接種物（約50マイクロリットル）をゆっくりと放出され、空気が前と接種菌後に注入されていることが示唆されました。しばらく点眼後および横方向に早い回復を容易に横臥それらを維持する垂直マウスを維持します。この手順の主な欠点は、時間の短い期間内に複数回の露光が原因で手術の要求に可能ではないということです。潜在的な問題は、カテーテルが気管支に深すぎに配置されている場合は、BALF細胞数は低くなるということです。この問題は、わずかに上向きにチューブを引っ張ることによって解決することができます。 気道の炎症性疾患の発生率は、これらの疾患の病態生理を理解し、世界的に3,16増加しているので、最も重要です。この研究に記載された技術は、重要な調節経路を同定するのに役立つ可能性があり、開発を容易にすることができます新しい治療法の。

炎症は、感染性病原体に対する防御の基本的な免疫機構です。これは、病原体の根絶や損傷を受けた組織の修復を促進します。また、正常な健康状態1への回復を促進します。しかしながら、調節不全の炎症は、多くの場合、慢性炎症性疾患2に導きます。気道炎症は、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息および肺線維症3などの異なる肺疾患の初期のトリガーです。 非分類できる（カプセル化されていない） インフルエンザ菌 （のNTHi）は、慢性上下の肺の炎症性疾患4,5に関連しています。これは、慢性閉塞性肺疾患の4,6,7の小児および成人の下気道から単離された優占種です。 NTHi感染後の炎症反応は、（例えば、TNFおよびIL-1βなどの）炎症性サイトカインを上方制御することを特徴とする、それはB媒介されますyのマイトジェンは、Toll様受容体（TLR）8を介してタンパク質キナーゼ（MAPK）および核因子κB（NF-κB）を活性化しました。 マウスモデルが異なるため遺伝子欠損株の入手可能性の肺の炎症性疾患の根底にある病理を分析するために非常に便利なツールです。いくつかの方法は、生/弱毒化細菌および鼻腔内滴下し、エアロゾル化した吸入9,10などの細菌産物を、接種するために使用されています。ここでは、気管内点滴注入を実証します。あまり頻繁に使用されますが、このアプローチは、より効率的であるため下気道への接種物の直接送達の再現性が高いです。

<table><tbody><tr><td>Chocolate agar plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose Anhydrous</td><td>Themo Scientific</td><td>R01300</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Hospira,Inc</td><td>RL-3010</td><td></td></tr><tr><td>Deft quick solution</td><td>Sigma</td><td>GS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Syringe needle 20/26G&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>(REF305115/175)</td><td></td></tr><tr><td>Iml syringe</td><td>BD</td><td>REF 309602</td><td></td></tr><tr><td>Catheter 20GA</td><td>BD</td><td>REF 381433</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Scissors, straight, 10 cm long</td><td>kentscientific</td><td>INS600393</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps, serrated, 10cm long</td><td>kentscientific</td><td>INS650915</td><td></td></tr><tr><td>Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long</td><td>kentscientific</td><td>INS600095</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>5ml polystyrene round-bottom tubes</td><td>BD</td><td>REF 352058</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge tubes</td><td>Light Labs</td><td>A-7001-R</td><td></td></tr><tr><td>Reasy Mini&amp;nbsp; kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Pellet pestile motor (Tissue homoginizer)</td><td>Sigma</td><td>Z359971-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96 well microtiter plates V bottom</td><td>Thermo</td><td>2605</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0454-81</td><td>Working dilution 1:100</td></tr><tr><td>Ly-6G-eFlor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Working dilution 1:100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>HyClone</td><td>SH30574.03</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10X)</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit</td><td>Invitrogen</td><td>L-34957</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5M)</td><td>lifetechnologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32 FcBlock</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Facs tubes polystyrene round bottom tube</td><td>BD</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Polyscience</td><td>4018</td><td></td></tr></tbody></table>

intra-tracheal administration of haemophilus influenzae in mouse models to study airway inflammation

ここでは、効率的かつ直接的にインフルエンザ菌を提供するための詳細な手順について説明します マウスの下気道へ。我々は、Hを調製するための手順を示しますインフルエンザ接種 、Hの気管内点滴注入示差遺伝子発現分析のために、肺、気管支肺胞洗浄液（BALF）を収集、BALF中の免疫細胞の分析、およびRNA単離にインフルエンザ 。この手順は、任意の細菌、ウイルスまたは真菌に対する肺の炎症反応を研究するために使用することができます。あまり曖昧で、それがより効率的に下気道への細菌接種を実現しているため直接気管点滴注入は、主に鼻腔内またはエアロゾル吸入手順よりも好ましいです。

気管内点滴注入は、生理食塩水を使用してインストールよりもBALF（ 図1A、左パネル）中の白血球の著しく増加数をもたらしました。白血球の差分カウント分析は明らかに増加した好中球浸潤（ 図1、右パネル）を示しました。 BALF中の細胞のFACS分析は、さらに、好中球数の増加（ 図1B）を確認しました。肺組織のH＆E染色切片の組織学的分析は、気道炎症（ 図1C）の増加を示しました。これらのデータは、一括して気管内点滴注入がマウスにおいて気道炎症を誘導することを示唆しています。気道病因を制御するシグナル伝達経路を研究するためのこのアプローチの使用をサポートするために、我々は、E3ユビキチンリガーゼの浮気のために欠損しているマウスを使用していました。かゆみは、炎症性シグナル伝達経路15の調節に関与することが知られています。私たちは、接種しました年齢と性別をマッチさせた野生型C57BL / 6コントロールとかゆみ - / - のNTHiでのマウス。 / - - 私たちは、対照WTとの浮気の肺組織からRNAを単離したマウスと示差的に発現している炎症性遺伝子を同定するために全トランスクリプトームシーケンシングを行いました。 図2に示すように、かゆみ欠損は、いくつかの遺伝子の示差的発現をもたらしました。これは、気管内点滴注入は、肺の炎症、遺伝子発現プロファイルおよびシグナル伝達経路を研究するために使用することができることを示唆しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53964/53964fig1.jpg" /> 図1：のNTHiの気管内接種は、マウスの肺の炎症を誘導するマウスをのNTHi（10 6 CFU /マウス）または生理食塩水コントロールを接種しました。 24時間接種後、マウスを（A）BALFを採取し屠殺しました。総白血球、単球及び好中球数を測定しました。データが提示されています±SEMを意味します。 n = 4のマウス/群。 *生理食塩水を投与したマウスと比較してp &lt;0.05を示します。 BALF中の（B）細胞は、抗群Gr1抗体で染色し、FACSによって分析しました。 （C）白血球浸潤や炎症を示すH＆E染色した肺切片は<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53964/53964fig1large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53964/53964fig2.jpg" /> 図2：WTとかゆみの肺における遺伝子発現差- / -気管内のNTHi接種のNTHi接種後24時間は、RNAは2 WTの肺から分離した後のマウス （1、2）と2つのかゆみ- / - 。 （1、2）マウス。 （A）RNAの質は、バイオアナライザーを用いて分析しました。 （B）熱マップから離れてSDの尺度として解釈さ（Zスコアを示します万人あたりのログ2カウントの平均）は（かゆみにedgeRとを用いて同定された172示差的に発現される遺伝子の2 CPM）をログ- / - 。WTマウスと比較して、 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53964/53964fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

の気管内の管理<em&gt;インフルエンザ菌</em&gt;マウスモデルにおいて気道炎症を研究します

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

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Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

10.1K ビュー.  Baylor Research Institute. We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models. 

ビデオ: Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

フローサイトメトリーによる肺および肺リンパ節の分析とマウスの非外科的気管内注入

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

免疫・感染学

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

マウス肺の病理生理学を研究するための非侵襲的気管内挿管

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

医学

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内PAMP管理および気管支肺胞の活用

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

微生物群集を学びます<em&gt;インビボ</em&gt;：ホスト間の媒介の相互作用のモデル<em&gt;カンジダ</em&gt;と<em&gt;緑膿菌</em&gt;航空で

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

挿管媒介気管内（IMIT）点眼：非侵襲的、肺特異的送達システム

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

マウスにおける実験的細菌性肺炎の誘導と表現型のための非侵襲的および技術的に非集中的な方法

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

マウスの気管の迅速な挿管のための改善された方法

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

イメージング 2 光子生体顕微鏡を用いたインフルエンザ ウイルス感染症の中に気管粘膜の細胞相互作用

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

の気管内の管理

要約

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フローサイトメトリーによる肺および肺リンパ節の分析とマウスの非外科的気管内注入

マウス肺の病理生理学を研究するための非侵襲的気管内挿管

マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内PAMP管理および気管支肺胞の活用

キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、

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挿管媒介気管内（IMIT）点眼：非侵襲的、肺特異的送達システム

マウスにおける実験的細菌性肺炎の誘導と表現型のための非侵襲的および技術的に非集中的な方法

マウスの気管の迅速な挿管のための改善された方法

イメージング 2 光子生体顕微鏡を用いたインフルエンザウイルス感染症の中に気管粘膜の細胞相互作用

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

の気管内の管理

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マウスにおける実験的細菌性肺炎の誘導と表現型のための非侵襲的および技術的に非集中的な方法

マウスの気管の迅速な挿管のための改善された方法

イメージング 2 光子生体顕微鏡を用いたインフルエンザ ウイルス感染症の中に気管粘膜の細胞相互作用

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

イメージング 2 光子生体顕微鏡を用いたインフルエンザウイルス感染症の中に気管粘膜の細胞相互作用