Name: a simplified method for ultra-low density, long-term primary hippocampal neuron culture
Uploaded: 2016-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture at JoVE.com

This study was supported by an NIH/NIMH grant to S.Q. (R00MH087628).

<ol>
	<li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cultureing Nerve Cells. , 339-370 (1998).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+microtubule-based+transport+of+dendritic+membrane+proteins+arises+in+concert+with+axon+specification.">Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification.</a> J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Shi, Y., Ethell, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+control+dendritic+spine+plasticity+in+hippocampal+neurons+through+NMDA+receptor+and+Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II-mediated+actin+reorganization.">Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization.</a> J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).</li><li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+and+primary+culture+of+embryonic+mouse+hippocampal+and+cortical+neurons.">Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures:+a+methodological+study.">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8, e83899 (2013).</li><li>Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP-dependent+protein+kinase+mediates+activity-regulated+synaptic+targeting+of+NMDA+receptors.">cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors.</a> J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).</li><li>Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+induces+synaptic+delivery+of+hnRNP+A2/B1+by+a+BDNF-dependent+mechanism+in+cultured+hippocampal+neurons.">Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons.</a> PLoS One. 9, e108175 (2014).</li><li>Clarke, L. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+astrocytes+in+neural+circuit+development.">Emerging roles of astrocytes in neural circuit development.</a> Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).</li><li>Kaneko, A., Sankai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+rat+hippocampal+neurons+at+low+density+in+serum-free+medium:+combination+of+the+sandwich+culture+technique+with+the+three-dimensional+nanofibrous+hydrogel+PuraMatrix.">Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix.</a> PLoS One. 9, e102703 (2014).</li><li>Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cellular+peptidomics+of+supraoptic+magnocellular+and+hippocampal+neurons+in+low-density+co-cultures.">Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures.</a> ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).</li><li>Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+dendrite+development+in+hippocampal+neurons+by+binding+to+p75NTR+and+modulating+the+cellular+targets+of+Notch.">NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch.</a> Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).</li><li>Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+culturing+primary+fetal+rat+cortical+neurons.">A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li><li>Qiu, S., Weeber, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reelin+signaling+facilitates+maturation+of+CA1+glutamatergic+synapses.">Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses.</a> J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).</li><li>Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MET+receptor+tyrosine+kinase+controls+dendritic+complexity,+spine+morphogenesis,+and+glutamatergic+synapse+maturation+in+the+hippocampus.">MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus.</a> J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

私たちは、無血清条件下での超低密度海馬グルタミン酸作動性ニューロンの長期培養のための詳細なプロトコルを提示します。 / cm 2の〜2000ニューロンでは、密度は、少なくとも2つの既存の文献2,3,11,13,14によって報告されたグリアサポートの有無にかかわらず、ほとんどの「低密度「文化の準備よりも倍低いです。超低密度であることに加えて、このプロトコルは、新規で2つの点で重要です。低密度ニューロンがないシナプス結合または異なる密度で培養ニューロン間の直接の接触がなくても、物理的に近接内にある高密度のニューロンからの栄養因子のサポートを得るように、まず、何のグリアフィーダー層は必要ありません。このプロトコルは、先に計画された培養実験のグリア単層を調製する必要がなくなり、高密度および低密度培養物を同時に成長することを可能にします。グリア単層の調製は時間がかかり、Lであることができますaborious、最も文献は新生ラット仔の皮質2を使用しています。したがって、マウスのみで作業ラボのために、これは重要な追加の努力が必要です。それは、ニューロン、グリア、または2つの細胞型10との間の相互作用に特異的に帰属観察された効果を防止するために、より重要なことには、ニューロン特異的なメカニズムを調査する実験において、共培養におけるグリアの存在は、望ましくありません。また、グリア培養のために、血清サプリメントは2,15必須であり、これはグリアニューロン共培養を汚染し、付加的な交絡因子を導入することができます。我々のプロトコルの1つの重要な特徴は、共培養は、定義された培地条件下であることです。我々は、厳密実験の大半を満たす必要がある、血清サプリメントなしで完全培地を使用し、培地交換スケジュールが厳しく続く場合、共培養は、3ヶ月を超えて持続させることができることがわかります。ノー事実があるのでグリア存在は、この技術の一つの制限は、グリア神経細胞の共培養を使用した文献の結果と比較する場合には注意が行使されるべきであることです。 このプロトコルの別の新規態様は、我々は24ウェルプレートの底上に成長した高密度ニューロン間の効果的なマイクロスペース、および真上に座ってカバーガラスに付着した低密度ニューロンを作成する簡単な方法を使用することです。以前の研究では、グリアフィーダー層2,8,9上記〜500ミクロンでカバースリップを高めるために、コーティングされたカバースリップに適用されるパラフィンドットを使用しています。パラフィンドットの調製は努力と練習の合理的な金額を要求する適切なサイズと適切な温度を必要とします。比較では、18 G針でウェル底プラスチック上の単純なエッチングは、ニューロンの2つの層の間のカバーグラスのサポートだけでなく、良好な分離を提供します。我々は、LINを決定するために、デジタルZ計でパッチクランプ記録リグを使用しています耳高密度にした後、60X水浸対物レンズを用いて低密度層に着目して、ニューロンの2層の間のスペース、およびスペースは、通常、150〜200ミクロン（179.4 +/- 25.3μmであり、n = 5であることがわかりました）。 （ワックスドットによって生成されたものと比較して）、この狭い空間したがって成長する低密度ニューロンのための十分な支持を提供し、より速く上昇、および神経栄養因子のより高い濃度に変換する可能性があります。この狭い空間は培地交換のレートについて、より小さなスペースが酸素と栄養補給を取得からニューロンを妨げるかどうかの質問を提起することができるが、我々の結果は、これはおそらく問題ではないことを示しています。逆に、我々はカバースリップの下で高密度ニューロンはまた、より良い成長することを見出した（NR1染色により高い生存率、より精巧な樹状突起とより多くのシナプス点を、データは示していない）と同じ準備からではなくせずに高密度ニューロンと比較しますオーバーレイCOVerslips。したがって、この単純なプロトコルだけではなく、高速、シンプルなだけでなく、高密度と低密度ニューロンの両方を維持する上で非常に有効です。 in vitroでの海馬神経細胞を培養し、ポリ-D-リジンおよび/ ​​またはラミニン/コラーゲン5,16のような基材を、成長促進のコーティングを必要とします。細心の選択およびガラスカバースリップの調製は、有効ニューロンの生存のために重要であるが、我々は、我々が選択したカバーガラスを、70％エタノールで徹底的に洗浄、したがって厳しい治療の必要性を否定する、十分であることを見出した（ 例えば 、酸中で煮沸）カバースリップの。カバーガラスをエタノールで洗浄し、真空乾燥させた後、ガラスは、元のコーティングのために疎水性であると思われます。しかし、0.1ミリグラムの成功コーティング/カバースリップを洗浄水、水の均一な層からピックアップされた場合には、均一になるように、ガラス表面を親水性にすべきであるホウ酸緩衝液中のmlのポリ-D-リジン全体のガラス表面を横切って拡散することを観察することができます。これは非常に重要であることを見出しました。そうしないとニューロンは、最も可能性の高い不十分コーティングによるめっき後死んでしまいます。唯一の低密度の海馬ニューロンは、このプロトコルで試験されているが、他のニューロンのタイプ（ 例えば 、皮質ニューロン、小脳顆粒ニューロン、または専門の神経集団）も高密度ニューロンフィーダの存在下で、低密度で維持できることが期待されます層。この単純なプロトコルが続いているときに最後に、1は、健康的な超低密度ニューロンを収穫することを期待することができます。このような免疫細胞化学標識などの幅広いアプリケーション、ライブイメージング、形態学的研究および電気生理学的記録は、すべての標準的な手順16,17を以下のこれらのニューロンに行うことができます。

インビトロ条件下での海馬神経細胞を成長させることは、観察し、 生体内で他の方法では不可能な、これらのニューロンの実験的操作を可能にします。この実験的なアプローチは、広く成長、極性、神経突起の仕様、輸送およびタンパク質の細胞内局在、シナプス形成および機能的成熟1の神経メカニズムを明らかにするために使用されます。後期胚期から採取するとき、これらのインビトロ培養海馬ニューロンは、錐体の形態2の比較的純粋な（&gt; 90％）グルタミン酸細胞です。ニューロンがインビトロ条件下で2-D表面で増殖させたため、この方法は、単一の焦点面3を介して染色ライブイメージングまたは免疫細胞化学（ICC）のように、容易に観察できます。または、そのような薬物治療やトランスフェクション3-6のような操作、。高い密度で増殖させた場合、ニューロンがあるため、より高い共同の生存率が高い傾向にあります増殖培地から栄養支持に加えて、またために、神経突起接触依存性機構7の分泌された成長因子のncentrations。しかし、低密度海馬ニューロンは、個々のニューロンは、その全体が撮像されたまたはICC分析のために染色することができる形態学的研究のために望ましいです。低密度ニューロンが原因パラクリンサポートの欠如に培養中で維持するのは難しいですので、多くの場合、前の神経細胞培養の2に用意する必要があるグリア（典型的には皮質アストロサイト）フィーダー層からの栄養サポートを必要とします。時共培養グリア細胞フィーダー層を有する、低密度ニューロンをカバーガラス上で増殖させ、かつ低密度ニューロンおよびグリアが互いに対向するように、その後グリア層の上に反転されます。グリア細胞と神経細胞の間に小さな限られた空間は、「サンドイッチ」レイアウト2,8,9を作成するため、カバースリップの隅にパラフィンワックスのドットを配置することによって作成されます。低密度ニューロンはワット成長しますニューロンとグリアによって分泌された濃厚な要因と寛容な微小環境を作成し、グリア細胞とカバーガラスの間の限られた空間を、ithin。このアプローチは、したがって、ICC標識やライブイメージング研究を促進する、合理的に離れている低密度、完全に発達神経細胞が得られます。 ニューロン - グリア共培養の見かけ上の欠点は、脇に時間がかかり、面倒であることから、それはニューロン特異的、または細胞自律的、機構の研究を防ぐことです。このシステムははるかに複雑なin vivoでの神経組織よりもですが、分泌され、未完全に定義された要素を介してニューロンの発生にグリアの影響は実験10を混乱することができます。したがって、ニューロン特異的なメカニズムの研究、血清およびグリア支持層が必要で除去定義培養条件を必要とする実験です。以前の研究では、目を使用して（〜9000細胞/ cm 2）のニューロンの低濃度を培養することに成功しましたREE次元ヒドロゲルマトリクス11。比較的純粋な神経細胞集団は、グリアサポートなしで無血清条件下で高密度に培養することができるので、我々は、海馬神経細胞の超低密度で、高密度ニューロンでそれらを共培養することによって、無血清規定された培養培地中で増殖させることができるという仮説を立て従来採用ニューロン - グリア共培養に類似した方法。実際、「サンドイッチ」構成で高密度海馬ニューロン培養物は、最近、特殊な大細胞内分泌ニューロン12の小さな数をサポートするために使用されています。 したがって、高密度の神経細胞との共培養は、低密度ニューロンが長期生存を可能にするのに十分である栄養因子のサポートを受けることを可能にします。超低密度ニューロンを培養するこのプロトコルは、このように配合し、検証しました。プロトコルは、高密度を調製することにより、単一の実験内で実施することができる（〜250,000細胞/ ml）をDISsociated海馬ニューロンは、最初に、その後密度〜万ニューロンを得るために希釈を行う/ mLの（〜3,000の神経細胞/カバースリップ、または〜2,000の神経細胞/ cm 2）で大部分が低密度培養物を報告したよりもはるかに低い、2,3,9 、11,13。この培養条件は緩く「超低密度」培養と呼ばれ、「低密度」相互交換可能で使用されています。高密度ニューロンをポリ-D-リジンコートした24ウェルプレート上にプレーティングされます。低密度ニューロンをポリ-D-リシン被覆した12mmのガラスカバースリップ上に播種され、一方、別の24ウェルプレートの内側に配置されます。ニューロンが下降し、カバーグラスに添付された後に低密度ニューロンを付着させるとカバーガラスを2時間後に高密度ニューロンの上に反転しています。また、代わりに高密度ニューロン層、上記カバーガラスを上昇させるためにパラフィンワックスのドットを使用する、18 Gの注射針は、二つの平行なストライプで24ウェルプレートの底部をエッチングするために使用しました。その結果displプラスチックはガラスカバースリップのための高められたサポートを提供する隣接、出し抜か。このスペースは、一貫して濃縮された栄養因子との微小環境を提供しながら、十分な酸素と培地交換を可能にする150〜200ミクロンで測定されます。この状態で、低密度ニューロンが広範囲に成長し、培養3ヶ月を超えて生き残ることができます。これらのニューロンは、培養3週間後にGFPプラスミドでトランスフェクトされる場合には、樹状突起は、やたらと樹状突起棘がちりばめられています。原理の証明として、データは、この共培養系は、神経細胞が細胞の調査を容易にすることができるautaptic接続を形成し、ポリ-D-リジン「マイクロアイランド &#39;上に播種した海馬神経細胞の超低密度培養物をサポートすることを示すために提示されています-autonomous、ネットワークに依存しないメカニズム。

<table><tbody><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>aliquot, store in 0.6ml size</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>dilute 100X&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>antibiotic-antimycotic (AA)</td><td>Life Technologies</td><td>15240-096</td><td>dilute 100X&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Complete Culture medium</td><td></td><td></td><td>Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I</td></tr><tr><td>Wash medium</td><td></td><td></td><td>same as &#039;Neurobasal medium&#039;</td></tr><tr><td>Feed medium</td><td></td><td></td><td>Neurobasal with 1X B27 supplement</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>prepare 100X stock at 0.6mg/ml</td></tr><tr><td>poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>M.W. 70000-150000</td></tr><tr><td>borate buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768 (boric acid); 71997(borax)</td><td>1.24g boric acid &amp;amp; 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl</td></tr><tr><td>12-mm round glass coverslips</td><td>Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH</td><td>1001/12</td><td>No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply</td></tr><tr><td>proFection transfection kit</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td>see&amp;nbsp; protocol for details</td></tr><tr><td>2X HEPES buffered saline (HBS)</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td>see&amp;nbsp; protocol for details</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Pall Corporation</td><td>4192</td><td>0.2um pore size</td></tr><tr><td>Endofree plasmid prep kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>for preparation of transfection grade plasmid DNA</td></tr><tr><td>anti-MAP2 antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB3418</td><td>mouse antibody, clone AP20</td></tr><tr><td>anti-p-Tau antibody</td><td>Millipore</td><td>AB10417</td><td>rabbit polyclonal antibody</td></tr><tr><td>anti-NR1 antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB1586</td><td>mouse antibody, clone R1JHL</td></tr><tr><td>anti-GluR1 antibody</td><td>Millipore</td><td>AB1504</td><td>rabbit polyclonal antibody</td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td>500ml size</td></tr></tbody></table>

a simplified method for ultra-low density, long-term primary hippocampal neuron culture

in vitroで初代海馬神経細胞を培養し、神経発達の多くの側面の機構的な尋問を容易にします。解離胚の海馬ニューロンは、多くの場合、無血清条件下で高密度にカバーガラス上で正常に成長することができますが、低密度培養は、通常、グリアフィーダー層でそれらを共培養することにより、栄養因子の供給を必要とする、の準備には時間がかかることがあります骨の折れます。また、グリアの存在は、ニューロン特異的メカニズムに関する結果と排除して研究の解釈を混乱させることができます。ここでは、簡略化された方法は、無血清条件下およびグリア細胞のサポートなしで、超低密度（〜2000ニューロン/ cm 2）で、長期（&gt; 3ヶ月）初代海馬神経細胞培養のために提示されています。低密度ニューロンをポリ-D-リシン被覆カバーガラス上で増殖させ、24ウェルプレート中で増殖させた高密度ニューロンに反転されます。代わりにbetweeスペースを作成するために、パラフィンドットを使用してのnは2ニューロン層、実験者は、単に低密度ニューロンの成長を助長する微小空間を作成するには、高密度のニューロンが存在する上、ウェルのプラスチック製の底をエッチングすることができます。共培養は、容易に、従って、これらのニューロンの形態学的および生理学的な研究を促進する、低密度ニューロンの有意な損失なし&gt; 3ヶ月間維持することができます。この成功した培養条件を説明するために、データは、長期培養後の低密度細胞における多量のシナプス形成を示すために提供されます。この共培養系はまた、ポリ-D-リジン基質したがってautaptic接続の形成の島で増殖させたスパース個々のニューロンの生存を促進します。

ここで説明するプロトコルは、フィーダー層としてのグリア細胞を必要とせずに成功した超低密度、純粋なグルタミン酸作動性ニューロンの長期培養を可能にします。プロトコルは、缶別々 （ポリ-D-リジンコーティングされたガラスカバースリップ上）（24ウェルをコーティングしたポリ-D-リジンで）高密度の調製および低密度ニューロンを含む図1に図解され、その後の共培養されます3ヶ月まで維持されます。 図2Aおよび2Bは、プレーティング後5日目に、高密度および低密度ニューロンの図です。低密度培養物は、密度の約30倍以下です。 Kaechとバンカー（2006）によって概説されるように、両方の神経細胞は、典型的な発達段階を経ます。 DIC画像（ 図2Cによって明らかにされるように14日目に、高密度および低密度ニューロンの両方が、精巧な樹枝状構造を示し、D、エッチの位置によって示されるように、両方のパネルは、異なる焦点面と同じフィールドからのものであるに注意してください）。これらのニューロンは、樹状突起を明らかにするためにMAP2抗体で染色していない樹状突起の数に有意な差（T 13 = 1.27、P&gt; 0.05;樹状チップ数で測定）されたときに、総樹状長さ（T 16 = 1.41、P&gt; 0.05 ）、高密度および低密度ニューロン間のニューロンあたりは（ 図2E、F）発見されました。 免疫細胞化学標識は、機能的なグルタミン酸作動性シナプスを明らかにするために使用されます。我々は、NMDA受容体サブユニットNR1およびAMPA受容体サブユニットのGluR1（ 図3A）、および容易に識別することができる機能的シナプス（ 黄色で共局在涙点）を標識するために二重染色を使用して、ImageJのを使用して定量。低密度ニューロンはまた、樹状タンパク質マーカーMAP2に対する抗体で標識されています軸索タンパク質マーカーのpタウと組み合わせて含みます。この二重標識は、樹状突起と軸索（ 図3B）の明確な区別を可能にします。 （DIV21でトランスフェクトされた場合、&lt;0.2％の神経細胞）のトランスフェクション率は、後の段階で、典型的には非常に低いが、低密度培養物も成功、リン酸カルシウム法を用いて、DNAプラスミドでトランスフェクトすることができる。 図3Cは、EGFPのトランスフェクションは、ニューロンの形態を明らかにすることができることを示し、そして目に見える細かい樹状突起棘の構造をレンダリングします。最後に、概念の証明として、超低密度ニューロンはautapse形成（ 図3D）を促進する条件下で増殖させることができます。ポリ-D-リジンコーティングした「マイクロ島の上に成長させたこれらの超低密度autapticニューロンは、この共培養プロトコルで2ヶ月を超えてに高密度フィーダニューロンによって持続させることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53797/53797fig1.jpg" /> &lt;強い&gt;図高密度および低密度共培養プロトコルの1模式図。（A）E16.5-E17.5マウス胚の脳が収集され、海馬を摘出し、トリプシンで消化されています。 （B）消化さ海馬単一ニューロンに分離し、洗浄し、24ウェルプレート（250,000細胞/ ml）を高い密度でプレーティングします。一方、低密度（10,000細胞/ ml）でニューロンをカバーガラス上にプレーティングします。高密度培養用ウェルをカバースリップのために高められたサポートを提供するために、18 Gの注射針を用いてエッチングされます。 （C）共培養のイラスト。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53797/53797fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53797/53797fig2.jpg" /> 図2.高密度および低密度の両方のニューロンは共同を持っています共培養でmparable形態的発展。（A、B）、高密度および低密度層の両方の播種密度を示す顕微鏡写真。広範囲高い（C）の両方において神経突起の成長および低密度（D）ニューロンを示す（C、D）DIC画像。カバーガラス上に低密度ニューロンは右高密度ニューロンの上に休んでいます。隆起したプラスチック支持体の位置に注意してください。樹状タンパク質MAP2の（E）免疫細胞化学標識。総樹状突起の長さとニューロンあたりの樹状突起先端数の（F）定量（平均±SEM）。有意差（NS）は、高密度の共培養で増殖させた低密度ニューロン間見られませんでした。 （B、D）でのスケールバーは100μmが。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53797/53797fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> FO：= &quot;1&quot;&gt;キープtogether.withinページ<img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53797/53797fig3.jpg" /> 図 共培養で増殖させた低密度ニューロンの 3 実験操作低密度培養物中の（A）免疫細胞化学標識は、のGluR1（ 緑 ）、NR1（ 赤色 ）の共標識により定義された機能的シナプスの同定を可能にします。 （B）、ニューロンの樹状タンパク質MAP2（ マゼンタ ）、軸索タンパク質p型タウ（ 緑 ）の同時標識。 （C）のpEGFP-C3プラスミドでトランスフェクトされた低密度の海馬ニューロン、多量の樹状突起棘を示します。 （D）低密度ニューロンをポリ-D-リジン「マイクロ島」を用意し、高密度ニューロンの上に成長させました。記録パッチ電極は、ニューロンの形態を明らかにするのAlexa-555ヒドラジドとニューロンを埋めます。 ADにおけるスケールバーは20μm。7fig3large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture at JoVE.com

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

超低密度のために簡略化された方法、長期初代海馬ニューロンの文化

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

a-simplified-method-for-ultra-low-density-long-term-primary

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.7K ビュー.  University of Arizona College of Medicine-Phoenix. Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms. 

ビデオ: A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

神経科学

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

ニューロモデュレーションとミトコンドリア輸送：長時間にわたって海馬ニューロンのライブイメージング

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and memory. Primary hippocampal cell culturing allows neuroscientists to examine the activity and properties of neurons at the individual cell and single synapse level. In this video, we will demonstrate how to isolate and grow primary hippocampal cells from newborn rats. The hippocampus may be isolated from each newborn animal in as short as 2 to 3 minutes, and the cultures can be maintained for up to two weeks. We will also briefly demonstrate how to use these hippocampal neurons for ratiometric calcium imaging. While this protocol describes the process for the hippocampus, with little to no modification, it can be applied to other regions of the brain.

The dissection and growth of cells from an individual brain area facilitates investigation of cellular and physiological parameters. We describe a method for primary cell culturing that produces neuron-enriched cultures in a serum-free environment.

P0新生児ラットからの海馬ニューロンの初代培養

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

生物学

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

胎児マウスから海馬ニューロンの単離および培養

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

低密度初代海馬ニューロンの文化

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

一次ニューロンにおけるタンパク質とシナプスマーカーの共局在化を研究する超分解能イメージング

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons

Neuronal culture is a valuable system for evaluating synaptic functions and drug screenings. In particular, a low-density culture of primary hippocampal neurons allows the study of individual neurons or subcellular components. We have shown subcellular protein localization within a neuron by immunocytochemistry, neuronal polarity, synaptic morphology, and its developmental change using a low-density primary hippocampal culture. Recently, ready-to-use frozen stocks of neurons have become commercially available. These frozen stocks of neurons reduce the time needed to prepare animal experiments and also contribute to the reduction of the number of animals used. Here, we introduce a reproducible low-density primary culture method using a 96-well plate. We used a commercially available frozen stock of neurons from the rat embryonic hippocampus. The neurons can be stably cultured long-term without media changes by reducing the growth of glial cells at particular timepoints. This high-throughput assay using low-density culture allows reproducible imaging-based evaluations of synaptic plasticity.

A ready-to-use frozen stock of neurons is a powerful tool for evaluating synaptic functions. Here, we introduce an easy low-density primary culture from frozen stock using a 96-well plate.

胚性海馬ニューロンの凍結ストックを用いた容易で再現性の高い低密度初代培養

Neuronal culture is a valuable system for evaluating synaptic functions and drug screenings. In particular, a low-density culture of primary hippocampal ...

A Technique to Culture Mouse Hippocampal Neurons

Source: Yang, R., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61411">Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments.</a> J. Vis. Exp. (2021)
The video demonstrates a method for culturing neurons from murine hippocampi. Initially, the hippocampi undergo enzymatic digestion to break down the extracellular tissue matrix. Subsequently, the digested tissue is mechanically disrupted to isolate individual neurons. Finally, these neurons are cultured on glial feeder cells.

マウス海馬ニューロンの培養技術

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparing glia cell feeder dishes ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

神経細胞培養技術

一次神経細胞培養

Generating a Low-Density Primary Neuron Culture From Frozen Embryonic Neurons

Source: Koganezawa, N. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/64872">Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2023)
This video demonstrates the method of culturing cryopreserved embryonic neurons, involving controlled thawing, dilution with a neurobasal medium, and seeding onto a poly-L-lysine-coated plate. Subsequent incubation supports the growth and maintenance of neuronal connections.

凍結胚性ニューロンからの低密度初代ニューロン培養物の生成

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Plate coating

	Coat a 96-well ...

An Indirect Neuron-Astrocyte Co-Culture Technique for Studying Neuron-Glia Interactions

Source: Gottschling, C. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54757">The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video illustrates a method for establishing an indirect neuron-astrocyte co-culture using a compartmentalized approach. In this setup, neurons and astrocytes are spatially separated but share a conditioned medium. Neurotrophic factors released by astrocytes promote neuron differentiation and the formation of synaptic connections, suggesting neuron-glia interactions.

ニューロン-グリア相互作用を研究するための間接ニューロン-アストロサイト共培養技術

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...