著者らはまた、製造およびcDNAとのshRNAベクターをネオゲニンための構造を共有するためのジョージア健康科学大学の博士熊のグループを承認したいと思います。この研究は、韓国研究財団によっておよびSahmyook大学からの研究助成金によって賄わ基礎科学研究開発プログラム（2013R1A1A4A01012572）からの助成金によってサポートされていました。

注：動物の飼育や心配事のためのすべての手順はSahmyook大学、ソウル、韓国のIACUCの規則に従って行いました。 1.過排卵、繁殖や卵管の単離<ol><li> 22±3℃、〜60％の湿度、12時間の明/暗サイクル、水と食料を自由摂取：以下の条件の下で、近交系C57BL / 6マウスを維持します。 </li><li>誘導0.1ミリリットル/ヘッドで5 IU妊馬血清ゴナドトロピン（PMSG）の腹腔内注射によって3-5週齢の雌マウスの排卵は0.1ミリリットルで5 IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）の腹腔内注射によって後48時間続きます/頭。 </li><li>直後のhCG注射後、同じケージに一晩でそれらを保つことによって、同じ株の性的に成熟した雄と過剰排卵誘発性の雌を交尾。 </li><li>次の朝、女性の生殖管に嵌合プラグまたは膣栓の存在によって成功した交尾を確認。 </li><li>妊娠中の雌マウスを生け贄に捧げますhCG注射後に頸椎脱臼18-20時間、続いてCO 2中毒によります。 </li><li>皮膚、その後細かいハサミで腹膜層を切断することにより腹腔を開きます。 </li><li>細かい鉗子で子宮角をピックアップし、優しく体腔から子宮、卵管、卵巣、および脂肪パッドを引き離します。 </li><li>卵管と細かいハサミで卵巣の間の領域をカットします。添付子宮の上部の1cm以上を残して、鉗子を再配置し、卵管の近くに子宮を​​切りました。 </li><li>室温でM16培地を含む35ミリメートルペトリ皿に卵管膨大部を転送します。同じ皿にいくつかのマウスから卵管をプール。 </li><li>胚の検索用実体顕微鏡下皿を置きます。 </li></ol> 2. 2-前核の検索と文化（2-PN）胚<ol><li> 、30または32 G皮下注射針の端をカット鈍い先端にそれを挽くし、フラッシング針として使用することができます。 </li><li>つかいますフラッシング針の上に卵管の端をスライドさせる細かい鉗子。静かな場所でそれを保持するために皿の底に対してフラッシング針の先端を押してください。ペトリ皿に2-PN胚を解放するためにM16培地〜0.1ミリリットルで卵管をフラッシュします。 </li><li>滅菌ガラスピペットを用いて、実体顕微鏡下でフラッシュM16媒体から積雲塊を囲むとともに、2-PN胚を回復し、新しいペトリ皿に移します。 </li><li> 5〜10分間、37℃でダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で0.1から0.5パーセントのヒアルロニダーゼの1.0ミリリットルで酵素消化により2-PN胚からの卵丘細胞を解離します。 </li><li>静かにガラスピペットおよび卵丘細胞を物理的に除去してピペッティングすることにより胚をはぎ取ります。 </li><li>胚あたりの新鮮なリン酸緩衝生理食塩水（PBS）30〜50ミリリットルで裸に胚を3回洗浄します。 </li><li> 10 mg / mlウシ血清アルブミン（BSA、FRACTを補充M16培地中で35mmのプラスチック製ペトリ皿中で胚をインキュベート以下4時間後に通常はマイクロインジェクションが行われるまで加湿インキュベーターで5％CO 2中37℃でイオンV）。 </li></ol> 3.胚逆転写（RT）およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR） <ol><li>逆転写酵素、RNaseインヒビター、オリゴdTプライマー、ランダム6mers、のdNTP混合物、および反応バッファーを含む転写酵素プレ混合溶液を逆胚盤胞期までの各段階からの少なくとも10の胚を回収し、5倍の4.0μlのそれらをプールPCRチューブ。 </li><li> 20μlの総体積にRNaseフリーの蒸留H 2 Oを加え、200 W.で30秒間プール胚を超音波処理を95℃で5分間インキュベートし、続いて1時間42℃で直ちにRT反応を開始します。 </li><li>生成されたcDNA溶液のそれぞれ5.0μlのために、ネオゲニンのためのプライマーを用いて通常のPCR増幅を行い、Cdx2の、Sox2の、Tead4、Nanogの、のOct3 / 4、またはβアクチンの表に示す（プライマー配列</stronグラム&gt; 1。 PCRは、95℃で15秒のインキュベーションを40サイクル、（ 表1に示されている）アニーリング温度で30秒間、および72℃で30秒から成ります。 </li><li>別個のPCR産物の電気泳動による2％アガロースゲル上でエチジウムブロマイドで染色した後、UV光下でゲルを視覚化します。 </li><li> βアクチンレベルに対する標的遺伝子の発現を正規化します。 </li></ol>胚の4免疫細胞化学<ol><li>簡単な洗浄により、0.01％BSAを含むPBSで3回続いて室温で30分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドを用いて、各段階から胚を修正しました。 </li><li>室温で10分間、0.1％のTween 20および0.1％トリトンX-100を含むPBS 1.0 ml中に10の胚をインキュベートすることによって透過処理細胞膜。 </li><li> PBSの1.0ミリリットルで透過化​​胚を培養する非特異的結合ブロックするには、室温で30分間、10％正常ヤギ血清を補充しました。 </li><li>ブロックされた胚のウィットをインキュベート時間ウサギ抗ネオゲニン抗体を1：4℃で一晩、0.1％BSAを含むPBS中で100倍希釈。 </li><li> PBSの滴で30秒間それぞれについて3回洗浄した後、1でアレクサ488結合ヤギ抗ウサギIgGまたはアレクサ568結合ヤギ抗ウサギIgGのいずれかで胚をインキュベートする：PBS / BSA溶液中で500希釈を4℃で一晩。 </li><li>アクチンフィラメントを可視化するために、室温で1時間、PBS中1μg/ mlのファロイジンで胚をインキュベートします。 </li><li>室温で5分間に1μg/ mlのDAPI（4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩）を含む5 mlのPBSを添加することにより核を染色します。 </li><li>洗浄は、PBSで3回簡単に胚。 </li><li>ガラススライドに胚を移し、鉱物油の滴でそれらをカバーしています。 </li><li>適切な波長の励起との共焦点顕微鏡で1,000倍の倍率で画像を撮影します。 </li></ol>ネオゲニン-RFPおよびネオゲニン-siRNAのGFPプラスミドの5準備<ol><li>サブネオゲニンフラグ-RFPで得られたベクターを含有する赤色蛍光タンパク質（RFP）へのクローンをコードするcDNAマウスネオゲニン、。 </li><li> （ 図1参照）のpcDNA-EmGFP-MIR-ネオゲニン、その結果、ベクターを含有エメラルドグリーン蛍光タンパク質（EmGFP）にネオゲニン標的小ヘアピンRNAのサブクローニング。 </li><li>ネオゲニンフラグ-RFPとのpcDNA-EmGFP-のmiR-ネオゲニンプラスミドの両方を増幅し、従来の方法でそれらを浄化します。 </li><li>無菌のTris-EDTA（TE）緩衝液中のプラスミドに〜1.0μgの/ mlの最終濃度を調整します。 </li></ol> 2-PN胚へのプラスミドの6マイクロインジェクション<ol><li>新鮮なM16培地で、簡単に、一度裸に2-PN胚を洗ってください。 </li><li>前核の観察を可能にするためにテーブルトップ遠心機1,000×gで10分間、2-PN胚を遠心。 </li><li> additi、5％CO 2中37℃で鉱物油の下胚あたりのM16培地の20〜30μlに微小液滴で胚をインキュベートonal 1〜2時間。 </li><li>メカニカルプラーと、ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ（IDは= 0.94ミリメートルOD = 1.2ミリメートル）を引いて、注入ピペットと保持ピペットを製造しています。 </li><li>鈍ヒントとmicrogrinderとmicroforgerを使用して、&lt;500μmの先端の長さと1〜2μmの先端内径の研磨開口部を持つように注入ピペットを製作。 </li><li>彼らが20μmと100μmの外径の内径と鈍ヒントや研磨の開口部を有するようにピペットを保持して製作してください。 </li><li> 1.0μgの/μlのでプラスミド溶液の十分な量の負荷注入ピペット（&gt; 200 NL）。 </li><li>顕微注入する〜電動式マイクロマニピュレータに取り付けられたマイクロインジェクターを用いて、前核の1つにそれぞれ2-PN胚のためのプラスミド溶液の10 PL;このプロセスの間に、保持ピペットで負圧を適用することによって所定の位置に胚を保ちます。 </li><li>マイクロインジェクション後、リットル用の新鮮なM16培地で2-PN胚を3回洗浄1分毎の時間よりESS。 </li><li>培養培地の蒸発を防ぐためにミネラルオイル滴で覆われたプラスチック培養皿に新鮮なM16培地の滴中で2-PN胚。 </li><li> 200Xの倍率で微分干渉コントラスト（DIC）倒立顕微鏡下で24時間の間隔で胚を観察します。 </li></ol>

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	<li>Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+molecular+regulation+of+the+mouse+blastocyst.">Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst.</a> Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).</li><li>Sasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+trophectoderm+fate+specification+in+preimplantation+mouse+development.">Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development.</a> Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).</li><li>Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tead4+is+required+for+specification+of+trophectoderm+in+pre-implantation+mouse.">Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse.</a> Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).</li><li>Ovitt, C. E., Sch&#246;ler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+Oct-4+in+the+early+mouse+embryo.">The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo.</a> Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Oocyte+Microinjection,+Maturation+and+Ploidy+Assessment.">Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment.</a> J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).</li><li>Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mouse+blastocyst+genes+that+are+down+regulated+by+double-stranded+RNA-mediated+knockdown+of+Oct-4+expression.">Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression.</a> Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).</li><li>Khang, I., Sonn, S., Park, J. -. H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithin+in+mouse+preimplantation+development:+Its+role+in+compaction.">Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction.</a> Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).</li><li>Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+DNA-Specific+Stain+Methyl+Green+in+the+Fluorescent+Labeling+of+Embryos.">Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos.</a> J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).</li><li>Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neogenin+as+a+receptor+for+early+cell+fate+determination+in+preimplantation+mouse+embryos.">Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos.</a> PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).</li><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).</li></ol>

著者らは、開示することは一切競合する金融利害関係を持っていません。

現在のプロトコルでは、我々は、マウスの胚発生の初期に細胞分化におけるネオゲニンの役割を探求する2-PNのマウス胚に、cDNAまたはshRNAのいずれかで、遺伝物質のマイクロインジェクションの新規な方法を示しています。着床前胚の遺伝子改変は、例えばのための基礎となる分子メカニズムに関する重要な情報を暴くための強力な技術は、最初の細胞系譜の決意です。遺伝子改変は、遺伝子...

着床前胚発生は、1細胞期から桑実胚および胚盤胞に、いくつかの別個の段階に分けることができます。多くの証拠は、極性および位置合図は栄養外胚葉（TE）および内部細胞塊（ICM）に初期の細胞運命の決意に役割を果たすことを示唆しています。しかしながら、それらはセルラ信号に導入されているかの手がかりの性質、および生理学的コンテキストとは、そのような信号は、知られていない細胞系譜の分化を開始することが可能です。これらの分化した細胞は、その後胎盤1-3の胚適切な形成と成長のために必要な特徴的な構造と機能を取るために始めて、専門を受けます。 着床前胚は、siRNAまたは標的cDNAのような修飾された遺伝物質の直接注射による操作に特に適しているので、特定の標的分子を研究するために利用することができます。その遺伝的成長の理解があります脊椎動物の胚の分析は、胚発生4の我々の理解を進めるために重要です。 gain-または機能喪失型遺伝子のを達成するためのタイムリーな文脈での胚への野生型遺伝子または変異形の正確な導入が大幅に発達調節される遺伝子の研究を容易にしました。 loss-がと機能獲得型遺伝物質の微量注入を介して、個々の早期非哺乳動物および哺乳動物の胚には、その大きなサイズと大きな受容5の比較的単純です。マイクロインジェクションは、典型的には、非ウイルスベクターを使用して実行されます。特定の利点は、ウイルスベクターおよびトランスジーン上に非ウイルスベクターを使用することの容易さからとられています。マウス胚の急速なloss-がまたは機能獲得型の発現系は、私たちは解剖し、脊椎動物の発生学6,7における遺伝子機能を理解することを可能にするように開発されました。 胚の蛍光標識が大きくMICRの選択を容易にしますoinjectedまたは遺伝的に胚を操作し、同時に、間接的に蛍光強度8に基づいて、マイクロインジェクションsiRNAまたはcDNAの発現レベルを定量化する手段を付与します。この標識、蛍光タンパク質のcDNAを達成するために、GFPまたはRFPは、別々に融合構築物またはいずれかと同時注入されます。 GFPまたはRFPの蛍光強度は、loss-がを保証または機能獲得なされたものに対するsiRNAまたは外来DNAの発現の程度を明らかにする。 ここで、我々は、私たちは、着床前のマウス胚における初期の細胞分化に重要な細胞外の手がかりを中継受容体としてネオゲニン同定することを可能にしたloss-が、ゲインオブファンクション技術のためのマイクロマニピュレーションプロトコルを提示します。

<table><tbody><tr><td>M16 medium,</td><td>Gibco BRL (Grand Island, NY)</td><td>M7292 LOT# 11A832</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum,&amp;nbsp;</td><td>Dako (Glostrup, Denmark)</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Folligon, Intervet, Holland</td><td>G4877-1000IU LOT#SLBD0719V</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CG5-1VL LOT# SLBC6783V</td><td></td></tr><tr><td>human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin&amp;nbsp;</td><td>(Intervet, Holland)</td><td>(invitrogen , 15596-026)</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&amp;reg; III Reverse Transcriptase</td><td>lifetechnologies</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>PCR pre mixture</td><td>&amp;nbsp;(Bioneer, Daejon, S. Korea)</td><td>GenDEPOT , A0224-050</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (molecular grade)</td><td>BioRad</td><td>161-3101</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td><td>Affymetrix USA</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>polyclonal rabbit anti-neogenin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology, US</td><td>SC-15337</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody</td><td>Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td><td>A-11094</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody</td><td>Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 555 Phalloidin</td><td>Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>3720-RG</td><td></td></tr><tr><td>all plasmid constructs&amp;nbsp;</td><td>Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA).</td><td></td><td>for the present studies were kindly provided by&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Neon&amp;reg;&amp;nbsp; Transfection System</td><td>lifetech</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscrope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Micromainpulation system with Nikon</td><td>Nikon</td><td>Narishige ONM-1</td><td></td></tr><tr><td>Micro Injector</td><td>Nikon Narishige</td><td>GASTIGHT #1750</td><td></td></tr><tr><td>Holder</td><td>Nikon Narishige</td><td>Narishige IM 16</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Nikon Narishige</td><td>Narishige MF-900</td><td></td></tr><tr><td>grinder</td><td>Narishige</td><td>EG400</td><td></td></tr><tr><td>Puller</td><td>Sutter Instrumnet company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Thermo Scientific Forma</td><td>EW-39320-16</td><td></td></tr><tr><td>Veriti&amp;reg; 384-Well Thermal Cycler&amp;nbsp;</td><td>lifetechnologies</td><td>4388444</td><td></td></tr></tbody></table>

loss- and gain-of-function approach to investigate early cell fate determinants in preimplantation mouse embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

我々は、早ければ2細胞期でとして登場すると永続的な初期の桑実胚までは、後期桑実胚と胚盤胞段階（ 図2A）で欠損となって、ネオゲニンが一過着床前マウス胚の初期発生段階で発現していることを発見しました。また、ネオゲニンの空間分布は、主に細胞外に制限しました。 RT-PCR分析の結果は、4細胞期でピークに達するが、完全に16細胞期に欠く以降...

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Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

このプロトコルの目的は、ロスオブを説明し、利得の栄養外胚葉と着床前マウス胚における内部細胞塊分化につながる段階特異的受容体としてネオゲニン識別に適用可能である関数法です。

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

loss-gain-function-approach-to-investigate-early-cell-fate

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.7K ビュー.  Dankook University. このプロトコルの目的は、ロスオブを説明し、利得の栄養外胚葉と着床前マウス胚における内部細胞塊分化につながる段階特異的受容体としてネオゲニン識別に適用可能である関数法です。 

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Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, cell culture has been widely used in developmental biology studies. However, it is important to determine whether in vitro cultured cells truly represent in vivo cell types. Grafting cells into embryos, followed by an assessment of their contribution during development is a useful method to determine the potential of in vitro cultured cells. In this study, we describe a method for grafting cells into a defined site of early postimplantation mouse embryos, followed by ex vivo culture. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing precise localization and adjustment of the number of cells receiving exogenous DNA with both high transfection efficiency and low cell death. These techniques, which do not require any specialized equipment, render experimental manipulations of the gastrulation and early organogenesis-stage mouse embryo possible, allowing analysis of commitment in cultured cell subpopulations and the effect of genetic manipulations in situ on cell differentiation.

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

早期着床後のマウス胚への細胞やDNAの正確​​ローカライズ転送する方法

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

発生生物学

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

遺伝学

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

体内と組織や細胞植アプローチを使用して形態形成と胚および周産期の大動脈の病因を研究するには

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients and waste between the mother and fetus and the production and delivery of growth factors and hormones. Placental genetic manipulations in mice are critical for understanding the placenta's specific role in prenatal development. Placental-specific Cre-expressing transgenic mice have varying effectiveness, and other methods for placental gene manipulation can be useful alternatives. This paper describes a technique to directly alter placental gene expression using CRISPR gene manipulation, which can be used to modify the expression of targeted genes. Using a relatively advanced surgical approach, pregnant dams undergo a laparotomy on embryonic day 12.5 (E12.5), and a CRISPR plasmid is delivered by a glass micropipette into the individual placentas. The plasmid is immediately electroporated after each injection. After dam recovery, the placentas and embryos can continue development until assessment at a later time point. The evaluation of the placenta and offspring after the use of this technique can determine the role of time-specific placental function in development. This type of manipulation will allow for a better understanding of how placental genetics and function impact fetal growth and development in multiple disease contexts.

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

Here we describe a time-specific method to effectively manipulate critical developmental pathways in the mouse placenta in vivo. This is performed through the injection and electroporation of CRISPR plasmids into the placentas of pregnant dams on embryonic day 12.5.

マウス インビボ 胎盤標的CRISPR操作

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an oocyte by a spermatozoon creates a totipotent zygote. Recently, several publications have reported that haploid embryonic stem cells (haESCs) can be a substitute for gametic genomes and contribute to embryos, which develop into mice. Here, we present a protocol to apply parthenogenetic haESCs as a substitute of sperm to construct embryos by intracytoplasmic injection into oocytes. This protocol consists of steps for preparing haESCs as sperm replacement, for injection of haESC chromosomes into oocytes, and for culture of semi-cloned embryos. The embryos can yield fertile semi-cloned mice after embryo transfer. Using haESCs as sperm replacement facilitates genome editing in the germline, studies of embryonic development, and investigation of genomic imprinting.

This article aims to demonstrate the use of parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute for sperm for the construction of semi-cloned embryos.

マウスパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の精子代替としての応用

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

シングルセルシーケンシングのためのGastrulating Mouse Embryoの単離とジェノタイピング

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

著者スポットライト:系統特異的変異胚をシングルセル分解能で解析するパイプライン

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

要約

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早期着床後のマウス胚への細胞やDNAの正確ローカライズ転送する方法

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

体内と組織や細胞植アプローチを使用して形態形成と胚および周産期の大動脈の病因を研究するには

マウスインビボ胎盤標的CRISPR操作

初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製

マウスパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の精子代替としての応用

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

要約

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早期着床後のマウス胚への細胞やDNAの正確​​ローカライズ転送する方法

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

体内と組織や細胞植アプローチを使用して形態形成と胚および周産期の大動脈の病因を研究するには

マウス インビボ 胎盤標的CRISPR操作

初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製

マウスパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の精子代替としての応用

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

早期着床後のマウス胚への細胞やDNAの正確ローカライズ転送する方法

マウスインビボ胎盤標的CRISPR操作