Name: three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers
Uploaded: 2017-09-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
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この作品は、国立機関の健康補助金 K08 NS061039-01A2、神経研究のためのプログラムによって支えられた &#38; 探索、および、A. アルフレッド Taubman 医療研究所、ミシガン大学の。この作業には、形態と国内機関の健康の付与 5 P 90 DK-20572 国立糖尿病・消化器・腎臓病からによって資金を供給、ミシガン州糖尿病研究センターの画像解析コアが使用されます。著者感謝したい j. ロビンソン シングルトンとゴードン ・ スミス (ユタ大学) ヒトの皮膚のサンプルの寛大な寄付のため。

ないの利害衝突を宣言します。

このプロトコルを特定、定量化、サイズと人間の皮膚生検から 3 D で IENFs 内神経固有ミトコンドリアの分布を分析し設計されています。プロトコルのいくつかの重要な手順があります。浮遊蛍光免疫組織化学染色、各サンプルでは、探索的研究44,45より汎用性の高い方法論を提供することで複数の信号を分析して設計されています。この手順は、共焦点顕微鏡画像と 3 D 解析を取得するために必要な 50 μ m セクション全体イメージの獲得を最大化するために、抗体の組織への浸透のためできます。もう一つの重要なステップは、ミトコンドリアを測定するための解像度を維持しながら画像あたり十分な神経をキャプチャ間のバランス イメージ集録パラメーターです。ティッシュ セクションはこれで使用され、標準的な皮膚生検プロトコルが約 3 ミリメートル長い45,46,の47,48。アクイジション ・ パラメーターは、画像 1 枚あたり 4-6 神経線維の平均値を含むに表皮の十分なこのプロトコルのキャプチャで説明します。高い解像度でサンプリングは大幅に各画像に、ナイキスト ・ サンプリングで、特に神経の数を減らします。3 番目の重要なステップは、デコンボリューション アルゴリズムを使用して、解像度と信号、特にミトコンドリアのコントラストを向上させることです。画像のデコンボリューションは、ないより高い解像度でサンプリングを補うために助けた。最後の重要なステップは、画像解析ソフトを使用して、表皮の細胞に関連するミトコンドリアから神経固有ミトコンドリアを特定することです。これは、神経内でローカライズするミトコンドリアの信号をトリミングするマスキング ツールとして神経表面の使用で。
この手法を検討するいくつかの潜在的な変更があります。可能な変更の 1 つは、蛍光免疫組織化学の期間を短縮できることでしょう。4 ° C で一次および二次抗体溶液に一晩の孵化は、室温で 3-4 時間に短縮できるかもしれない。ただし、室温で短い孵化はしばしばバック グラウンド蛍光を増加する貧しい信号対雑音を避けるために注意する必要がありますので。もう一つの可能な変更は、画像集録パラメーターを調整することでしょう。前述のように、ここで説明した画像の取得は高画像解像度で画像ごと神経の合理的な数をキャプチャに偏っていた。1.3 開口 63 倍油浸対物レンズなど、高い倍率の目的を使用することが可能です。すべてのパラメーターは同じまま、63 X 目的が使用された場合、XY イメージ フィールドは 112 μ x 112 μ m になるし、したがって神経画像ごとの平均数を減らします。主なポイントは、獲得とその後の分析を通して一貫性のあるパラメーターを使用することです。
この手法の主な制限は、時間がかかることです。免疫組織を処理する 3 日間がかかる、画像集録は、画像によっては方法多くの光 z 手順が取られるあたり約 30-50 分、画像処理/解析まで約 20 分。これは重要な時間のコミットメントが、最後に重要な地形計測が得られます。この手法のもう一つの制限は、画像ごとにサンプリングされ表皮の限られた地域です。ただしより高速なコンピューターのプロセッサおよび解析ソフトウェアと組み合わせる改良された解像度で画像取り込み速度の進歩は、間違いなく向上します。
他の方法でこの議定書の意義は、共焦点顕微鏡と 3 D 画像解析を蛍光免疫組織化学を組み合わせることの力にあります。伝統的に、表皮内神経線維解析、免疫組織化学による発色と明視野顕微鏡、特に神経障害45,47,49の臨床診断のため行われます。蛍光免疫組織化学の使用を汚し、各サンプルでは、探索的研究44,45より汎用性の高い方法論を提供することで複数の信号を分析することが可能になります。この手法は、この場合神経固有ミトコンドリア、複雑な信号からミトコンドリアの表皮細胞に関連付けられている、興味の特定の信号を分離するための戦略を提供します。
この技術の力は、将来のアプリケーションには有用です。特定し神経固有のミトコンドリアを測定できるサイズとミトコンドリアの分布の疾患に伴う変化を評価することが可能になります。複数の神経学的な合併症には、病気の潜在的なメカニズムとしてミトコンドリアの機能低下が関与してください。特に、この方法の修正版は、糖尿病と糖尿病性末梢神経障害患者のサイズおよび年齢をマッチさせたに比べて神経固有ミトコンドリア分布の測定可能な変化を示すに使用されています50を制御します。この手法は改善したり、感覚神経症を治すための治療法の有効性を評価するために有用であります。最後に、技法の多様性は、他の蛍光信号からデータのサブセットを分離する 1 つの蛍光信号を使用する解析の広い範囲に適用されます。

ミトコンドリアは、バッファリング、カルシウムと規制壊死とアポトーシス細胞死1,2,3セルのエネルギーを生産を含む重要な細胞機能を提供します。中枢神経系は、ミトコンドリア呼吸を介してニューロンがアデノシン三リン酸 (ATP) の形で高度の細胞のエネルギーを生成することを示唆している体4と比較して高い代謝率は。多くの神経機能が ATP5、特にシナプス6に依存していること証拠書類。したがって、神経細胞内のミトコンドリアの分布は重要です。
最後の 10 年間で多くの情報が示している人身売買および神経細胞のミトコンドリアのドッキングは非常に調整されます。モーター蛋白質ニューロンを通して特定の細胞コンパートメントにミトコンドリアの配布に関与しています。ミトコンドリアの人身売買は、ニューロンの軸索と樹状突起、相馬から遠く離れたプロジェクトのために特に重要です。キネシン モーター蛋白質は主に (相馬) から前向性ダイニン モーター蛋白質直接 (相馬) に向かって逆行運動7,8,9ながら微小管に沿ってミトコンドリアの人身売買を直接します。,10です。 このようなミトコンドリア膜電位とインパルス伝導存在とミトコンドリア人身売買11,12,13の方向に影響を与える携帯電話の信号があります。
ミトコンドリアを輸送に加えて Ranvier のノードやシナプス8,14,などの高エネルギー要求がある特定の細胞コンパートメントにミトコンドリアをローカライズするのには特殊な蛋白質があります。17します。 実際には、軸索内のミトコンドリアの大半が非運動性9,13,18。アクチン細胞骨格19-21に他の蛋白質アンカーのミトコンドリア中の軸索に沿って微小管の syntaphilin アンカー ミトコンドリアのような専門にされた蛋白質。成長因子およびカルシウムなどのイオンは、ミトコンドリアが必要な21,22,23の地域にローカライズするため運動の停止をサポートする報告されています。
一緒に取られて、人身売買とミトコンドリアのドッキングがニューロンの適切な機能のために不可欠です。、これを支持するミトコンドリア輸送の混乱が関連付けられているアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、シャルコー ・ マリー ・ トゥース病、ハンチントン病、遺伝性痙性を含むいくつかの神経学的な条件対麻痺、視神経萎縮15,24,25,26,27.最近の研究が糖尿病神経障害、糖尿病28,29,30,31 に関連付けられている感覚の損失のための潜在的なメカニズムとしてミトコンドリアの機能低下と病理に焦点を当ててください。 ,32,33。仮説は、糖尿病が皮膚神経の感覚の投射内ミトコンドリアの分布を変更します。したがって、視覚化し、表皮内神経線維 (IENFs)、後根神経節感覚求心性神経の遠位先端内ミトコンドリアを定量化する技術が開発されました。技法を組み合わせた神経固有の分布を測定する強力な 3 D 画像解析ソフトウェアで信号の共焦点顕微鏡 z シリーズ取得特定のミトコンドリアと神経線維のラベルの蛍光免疫組織化学この目標を達成するために人間の皮膚パンチ生検からミトコンドリア。

<table><tbody><tr><td>2% Zamboni&#039;s Fixative</td><td>Newcomer Supply, Middleton, WI&amp;nbsp;</td><td>1459A</td><td>2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline (PBS)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>BP399-4</td><td>To make up 1x PBS</td></tr><tr><td>Image-iT FX Signal Enhancer</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>I36933</td><td>enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding</td></tr><tr><td>Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)</td><td>Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td><td>14730-1-AP</td><td>abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody</td></tr><tr><td>Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)</td><td>abcam, Cambridge, MA</td><td>ab110333</td><td>abbreviated as PDH</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>A-11034</td><td>red-fluorescent conjugated secondaryantibody</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>A-11032</td><td>green-fluorescent conjugated secondaryantibody</td></tr><tr><td>Albumin, from Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A7906-100</td><td>abbreviated as BSA</td></tr><tr><td>Triton X- 100</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T9284</td><td>abbreviated as TX-100</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m Filter</td><td>EMD Millipore, Billerica&lt;br/&gt; MA</td><td>MILLEX GP SLGP 033NS</td><td>0.22 &amp;micro;m Millipore filter</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>13-374-10</td><td>Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)</td></tr><tr><td>Non-calibrated Loop</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>22-032092</td><td>inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)</td></tr><tr><td>96-well Assay Plate</td><td>Corning Incorporated, Corning, NY</td><td>3603</td><td>96-well flat bottom plate</td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>P-36931</td><td>DAPI staining of nuclei</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass 50 x 24 mm</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>12-544E</td><td>Coverslips</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>12-550-15</td><td>Microscope Slides</td></tr><tr><td>Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope</td><td>Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL</td><td>SP5</td><td>Confocal Microscope</td></tr><tr><td>Volocity x64 Software&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Waltham , MA</td><td>version 4.4.0</td><td>Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing</td></tr><tr><td>Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software</td><td>Bitplane, Concord, MA</td><td>version 7.7.1</td><td>Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft, Redmond, WA</td><td>version Office 2013</td><td>Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features</td></tr><tr><td>Optimum Cutting Temperature Compound</td><td>Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td><td>4583</td><td>abbreviated as OCT</td></tr><tr><td>Leica Cryostat</td><td>Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td><td>CM1850</td><td>Cryostat for cutting 50 &amp;micro;m sections</td></tr><tr><td>CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>C10600</td><td>Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal</td></tr></tbody></table>

three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers

このプロトコルの目的は、表皮内神経線維内のミトコンドリアを勉強することです。したがって、神経固有のミトコンドリアを分離し、感覚神経の遠位先端のミトコンドリアの病気による変化を評価する 3 D 画像処理・解析技術が開発されました。プロトコルは、蛍光免疫組織化学、共焦点顕微鏡と神経固有のミトコンドリアを定量化を視覚化して 3 D 画像解析手法を組み合わせたものです。詳細なパラメーターは、神経固有のミトコンドリアを分離するこれらのテクニックを使用する方法の具体的な例を提供するために手順の中で定義されます。抗体を用いて神経をラベルし、皮膚の組織切片内ミトコンドリア信号パンチ生検、それぞれ緑、赤の蛍光シグナルとミトコンドリア神経を視覚化する間接蛍光抗体法が続いています。Z シリーズ画像を共焦点顕微鏡で取得した、3 D 解析ソフトウェアが処理し、信号を分析する使用されました。記述されている正確なパラメーターに準拠する必要はありませんが、染色、集録・解析手順全体の選択のものと一致することが重要です。このプロトコルの強さださまざまな状況に適用されるそれ以外の場合、一人で勉強することが可能となるだろう他の信号を分離する 1 つの蛍光信号が使用されています。

可視化と人間 IENFs 内ミトコンドリアの定量化
蛍光免疫染色により, 神経, ミトコンドリアと核を視覚化する人間の皮膚生検内複数信号の同時表示が可能です。96 ウェル プレートは、免疫組織染色の手順を整理するための便利な方法です。図 1は、ソリューションの 12 段階を通じて処理する 8 つのセクションまでこの構成アカウントを示しています。フラット ロッカーで穏やかな攪拌と組み合わせてフローティング メソッドは、抗体に両側からセクションを貫通する十分なアクセス権があることを確認します。プロトコルの完了するために 3 日間は主に神経とミトコンドリアに一貫したラベル 4 ° c、第一次および二次抗体の孵化を一晩のため。
プロシージャの残りの部分では、画像処理、蛍光信号の解析を組み込まれています。共焦点顕微鏡活用蛍光信号の光学的セクションに離散信号焦点面から焦点のずれた信号を排除することによって。ティッシュ セクションを通じて z シリーズの買収は、神経、ミトコンドリア、核の蛍光信号の 3 D 表現を提供します。パラメーターは、5 神経の平均を含む表皮の長さに沿って画像 172 μ m に最適化されています。図 2は、表皮から収集される 3 つの蛍光信号の典型的な 3 D イメージを示しています。PGP9.5 染色 (図 2 b) は、組織のバック グラウンド自動蛍光よりも高い強度のある表皮と皮膚の神経の豊富な信号を提供します。核染色 (図 2) は、表皮内神経線維が支配する表皮の境界を識別するのに役立ちます。角質層を構成する角質細胞の残りの DNA が原因かもしれない拡散信号に表皮の外側の層が一般的です。ミトコンドリア染色 (図 2 D) 信号の大部分はケラチノ サイト主には、表皮の細胞に関連付けられて PDH 明確に分類されます。
アクイジション ・ パラメーターはこのプロトコルで記述されているは、1.25 の開口と倍率 2.2 倍油浸対物レンズ 40 を使用します。30-50 μ m × 176.1 μ m × 176.1 μ m の XYZ のイメージ サイズでこの結果します。これらの設定は、画像 (図 3 a) あたり 4-6 神経線維の平均値を含むに表皮の十分をキャプチャします。高い解像度でサンプリングは、各イメージの神経の数を減らすでしょう。図 3 bは、画像ごとの少ない神経の結果 114.8 μ m × 114.8 μ m、XY 領域を縮小、3.3、ズームの倍率を示しています。理想的なサンプリング密度 1.25 数値の絞りに油浸対物レンズ x 40 のナイキスト (http://www.svi.nl/NyquistCalculator) によって定義されているは、54 nm x 54 nm x 205 nm の XYZ のスキャン解像度を示しています。これは解像度 1,024 × 1,024 で 6.6 倍の倍率が必要し XY 57.4 μ m x 57.4 μ m まで縮小し、キャプチャ画像 (図 3) ごとの 1-2 神経の平均。
次の段階は、画像の不要な領域を削除し、信号を向上させるイメージ処理を実行することです。このプロトコルでは、真皮や角質層は表皮の IENFs が支配する領域に分析を集中するために削除されます。三次元ソフトウェアを分離、強化および蛍光信号を分析することが可能になります。地域 (図 4 aC) 表皮の上下をトリミングして表皮の神経とミトコンドリアを分離するソフトウェア ツールが必要です。このプロセスは信号の拡張表示をまとめると、表皮一帯がフリーハンドをトレースして簡素化します。トリミングされた画像は、画像修復アルゴリズムによってさらに処理されます。デコンボリューションは、神経やミトコンドリア信号 (図 4) の解像度を最適化するために使用されます。
最終段階は、検出し、信号形態特徴を抽出します。このプロトコルの重要な側面は、神経固有のミトコンドリアの機能を測定することです。画像解析ソフトでは、その表面の内で (この場合ミトコンドリア) で別の蛍光信号を分離するマスキング ツールとして作成されたサーフェスを使用して、(この場合は神経の表面) で 1 つの信号の機能があります。ミトコンドリア神経固有の分析の最初の手順、神経 (図 5 aB) 周りの 3D サーフェスを作成します。神経表面神経固有蛍光ミトコンドリア信号 (図 55D 5 e、 5 G) をトリミングに使用されます。最後に、体積を測定 (図 5 階5H) ミトコンドリア神経固有信号のまわり 3 D サーフェスが作成されます。画像解析ソフトと集計データからエクスポートされる地形計測を表 3に示します。エクスポートする主な値は、神経と神経固有ミトコンドリア信号のボリューム値です。ミトコンドリアからボリューム データのサイズ頻度分布 (図 6) を作成するために使用し、ミトコンドリアのサイズ周波数データを生成するビニングです。ボリュームのデータは、IENF ボリューム内のミトコンドリアのボリュームの IENF ボリュームあたりミトコンドリアの数と割合の要約指標を作るにも使用されます。
表 3 および図 6に表示されるデータは、この手法が皮膚生検から人間 IENFs 内ミトコンドリアを定量化するための手段を提供することを示しています。このサンプルから神経ミトコンドリア全体に分散してミトコンドリアの大半は 0.02 - 間、0.32 μ m3。これらのサイズは通常ミトコンドリア36,37,38,39に関連付けられている範囲内にあります。小さなミトコンドリアより大きなミトコンドリア39これらの神経内のミトコンドリアがより運動性かもしれないと示唆しているよりも運動性が示されています。確かに、研究は大きく、腫れのミトコンドリアがない小さなミトコンドリアだけでなく、輸送を行うし、軸索変性39,40,41につながる可能性があります関与しています。したがって、ミトコンドリア神経固有の特性は、ミトコンドリア形態と輸送の変化が軸索変性に関連付けられている神経変性疾患の研究に適用される貴重な技術15,25,26,27,42,43。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">5 %bsa 遮断ソリューション</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>解決を妨げる 5 %bsa のコンポーネント</td>
			<td>必要な量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ウシ血清アルブミン (BSA) [最終濃度: 5%]</td>
			<td>0.625 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0% トリトン X-100 (テキサス州-100) [最終濃度: 0.3%]</td>
</tr></tbody></table>			<td>3.75 mL</td>
		
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>~8.125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>合計(12.5 mL に容量をもたらす 1x PBS を使用して)</td>
			<td>12.5 mL</td>
		</tr>
	

表 1:ソリューションをブロック 5 %bsa 。免疫のプロトコルの初期のステップで 5 %bsa ブロック ソリューションを使用することで、抗体の非特異的結合をブロックします。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">1 %bsa 洗浄ソリューション</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>リンス液 1 %bsa のコンポーネント</td>
			<td>必要な量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ウシ血清アルブミン (BSA) [最終濃度: 1%]</td>
			<td>0.125 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0% テキサス州-100 [最終濃度: 0.3%]</td>
			<td>3.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>~8.125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>合計(12.5 mL に容量をもたらす 1x PBS を使用して)</td>
			<td>12.5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2:リンス液 1 %bsa 。リンス液 1 %bsa は抗体の非特異的結合をブロックする免疫プロトコルで使用され、第一次および二次抗体を希釈して使用します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="9">IENFs と神経固有ミトコンドリアの形態計測</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="9">画像解析ソフトウェアからエクスポートおよび概要データ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mt のサイズ周波数ビン</td>
			<td>Mt サイズ周波数ビンでの数</td>
			<td>箱に Mt の割合</td>
			<td>Mt の合計数</td>
			<td>Mt ボリューム (μ m3)</td>
			<td>IENF ボリューム (μ m3)</td>
			<td>IENF ボリューム (数/100 μ m3) あたりの山数</td>
			<td>IENF ボリュームで Mt ボリュームの割合</td>
			<td>IENFs の数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>間 .02.04 μ m3</td>
			<td>20</td>
			<td>24.4%</td>
			<td>82</td>
			<td>13.41</td>
			<td>518.88</td>
			<td>15.8</td>
			<td>2.58%</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>間 .04.08 μ m3</td>
			<td>28</td>
			<td>34.1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>間 .08.16 μ m3</td>
			<td>14</td>
			<td>17.1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>間 .16.32 μ m3</td>
			<td>12</td>
			<td>14.6%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>間 .32.64 μ m3</td>
			<td>4</td>
			<td>4.9%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>間 .64 1.28 μ m3</td>
			<td>3</td>
			<td>3.7%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>間 1.28 2.56 μ m3</td>
			<td>1</td>
			<td>1.2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>間 2.56 + μ m3</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
テーブル 3:IENFs と神経固有ミトコンドリアの形態計測します。テーブルは、測定、画像解析ソフトと集計データからエクスポートされた計測値を表します。省略形: IENF、表皮内神経線維;Mt、ミトコンドリア。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/53369/53369fig1.jpg"> 
図 1: 皮膚生検の免疫組織化学の 96 ウェル プレートの設定を表す模式図。プレート内の行を表すブロック、洗浄、インキュベーションのソリューションのためのプロトコルの手順、列が (1 プレートあたり 8 つのセクション) から個々 の組織のセクションを表します。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53369/53369fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/53369/53369fig2.jpg"> 
図 2:蛍光免疫組織化学の代表的な 3 D 共焦点顕微鏡画像人間の表皮生検から組織切片の処理します。未処理の 3 D 投影画像(A)合併の蛍光シグナルと(B)神経 (神経、緑)、 (C)核 (原子、青) と(D)ミトコンドリア (Mt、赤) 表皮の個々 の信号を示していて、真皮。表皮の角質層の信号の欠如を注意してください。スケール バー = 20 μ m.<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53369/53369fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/53369/53369fig3.jpg"> 
図 3: その後の分析の少ない神経画像解像度結果が向上します。すべての画像は 1.25 開口 40 X 石油目的で捕獲され、3 D 投射を示す神経 (緑)、(Mt、赤) のミトコンドリアと核 (原子、青) の蛍光信号。2.2 (A)の倍率で撮影した画像には、ビュー内でいくつかの神経が含まれています。3.3 (B)または(C)6.6 にズーム倍率を増やす、理想的なナイキスト ・ サンプリングは大幅各画像内の神経の数を減らします。スケール バー = 20 μ m.<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53369/53369fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/53369/53369fig4.jpg"> 
図 4: 画像処理します。代表は、人間の表皮生検組織切片の共焦点顕微鏡から画像のフォーカス (最大強度投影) ビューを拡張しました。未処理の投影画像は、 (A)神経 (緑)、核 (原子、青) とミトコンドリア (Mt、赤) の結合された蛍光信号を示しています。真皮や角質層、inte の領域のトリミング(B)残りの部分 (ROI) フリーハンド選択ツール (強調表示された領域を青、ROI をトリミング) 表皮の信号のみを分離します。(C)トリミング表皮は計算された点に(D)デコンボリューション広がって神経 (緑) の分解能を向上するための関数処理、およびミトコンドリア (Mt、赤) 信号。スケール バー = 20 μ m.<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53369/53369fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/53369/53369fig5.jpg"> 
図 5: 画像解析します。代表的な 3 D 共焦点顕微鏡画像を示しています (A) 神経固有の緑色蛍光の信号。(B) 3 D 面 (水色) の神経信号が作成されます。神経固有のミトコンドリア信号は(D)神経表面のマスキング ツールとして使用(C)表皮ミトコンドリア信号 (Mt、赤) の残りの部分から分離されます。神経固有ミトコンドリア赤蛍光信号を使用し、結果として得られる(E, G) (F, H)神経表面 (シアン) 内ミトコンドリアのまわりの表面 (Mt 表面、マゼンタ)。G および H は、E の白いボックスの拡大ビューと f. スケール バー = 20 μ m (A ~ F), 5 μ m (G H)。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53369/53369fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/53369/53369fig6.jpg"> 
図 6: ミトコンドリアのサイズ周波数ヒストグラム。Mitochondrialsurface データは、彼らの量 (μ3) に応じて様々 な箱のそれぞれに存在するミトコンドリアの割合を視覚化するためのサイズ周波数ヒストグラムとして表示されます。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53369/53369fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

このプロトコルは、神経固有のミトコンドリアを定量化を視覚化して三次元 (3 D) 画像処理・解析技術を使用します。テクニックは別の蛍光信号からデータのサブセットを分離する 1 つの蛍光信号が使用されている場合に適用されます。

三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.2K ビュー.  University of Michigan Medical School. このプロトコルは、神経固有のミトコンドリアを定量化を視覚化して三次元 (3 D) 画像処理・解析技術を使用します。テクニックは別の蛍光信号からデータのサブセットを分離する 1 つの蛍光信号が使用されている場合に適用されます。

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Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. At present, it is common practice to collect 3 mm skin biopsies from the distal leg (DL) and the proximal thigh (PT) for the evaluation of length-dependent polyneuropathies 3. However, due to the multidirectional nature of IENFs, it is challenging to examine overlapping nerve structures through the analysis of two-dimensional (2D) imaging. Alternatively, three-dimensional (3D) imaging could provide a better solution for this dilemma.
In the current report, we present methods for applying 3D imaging to study painful neuropathy (PN). In order to identify IENFs, skin samples are processed for immunofluorescent analysis of protein gene product 9.5 (PGP), a pan neuronal marker. At present, it is standard practice to diagnose small fiber neuropathies using IENFD determined by PGP immunohistochemistry using brightfield microscopy 4. In the current study, we applied double immunofluorescent analysis to identify total IENFD, using PGP, and nociceptive IENF, through the use of antibodies that recognize tropomyosin-receptor-kinase A (Trk A), the high affinity receptor for nerve growth factor 5. The advantages of co-staining IENF with PGP and Trk A antibodies benefits the study of PN by clearly staining PGP-positive, nociceptive fibers. These fluorescent signals can be quantified to determine nociceptive IENFD and morphological changes of IENF associated with PN. The fluorescent images are acquired by confocal microscopy and processed for 3D analysis. 3D-imaging provides rotational abilities to further analyze morphological changes associated with PN. Taken together, fluorescent co-staining, confocal imaging, and 3D analysis clearly benefit the study of PN.

In order to study the changes of nociceptive intraepidermal nerve fibers (IENFs) in painful neuropathies (PN), we developed protocols that could directly examine three-dimensional morphological changes observed in nociceptive IENFs. Three-dimensional analysis of IENFs has the potential to evaluate the morphological changes of IENF in PN.

人間の皮膚生検における侵害受容性表皮内神経線維の三次元イメージング

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

医学

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

神経科学

膵臓がん細胞のミトコンドリアクリスタを可視化する3D技術

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a three-dimensional (3D) perspective, is critical for mechanistic studies. Electron microscopy (EM) offers good imaging depth and allows for the reconstruction of high-resolution image stacks to investigate the ultrastructural morphology of cellular organelles even at the nanometer scale; therefore, 3D reconstruction is gaining importance due to its incomparable advantages. Scanning electron microscopy (SEM) provides a high-throughput image acquisition technology that allows for reconstructing large structures in 3D from the same region of interest in consecutive slices. Therefore, the application of SEM in large-scale 3D reconstruction to restore the true 3D ultrastructure of organelles is becoming increasingly common. In this protocol, we suggest a combination of serial ultrathin section and 3D reconstruction techniques to study mitochondrial cristae in pancreatic cancer cells. The details of how these techniques are performed are described in this protocol in a step-by-step manner, including the osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) method, the serial ultrathin section imaging, and the visualization display.

著者スポットライト:膵臓がん細胞におけるミトコンドリアの超微細構造変化を視覚化するための3次元技術  

This protocol describes how to reconstruct mitochondrial cristae to achieve 3D imaging with high accuracy, high resolution, and high throughput.

膵臓癌細胞のミトコンドリアの微細構造変化を可視化する3次元技術

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

がん研究

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

4次元蛍光イメージングと住んでいる神経末端におけるエンドソームダイナミクスの可視化

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

シリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いて脳ミトコンドリアの解析

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human neurons, which may contribute to neurodegeneration in various disease states. Although it is challenging to examine mitochondrial dynamics in live human nerves, such paradigms are critical for studying the role of mitochondria in neurodegeneration. Described here is a protocol for analyzing mitochondrial transport and mitochondrial morphology in forebrain neuron axons derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). The iPSCs are differentiated into telencephalic glutamatergic neurons using well-established methods. Mitochondria of the neurons are stained with MitoTracker CMXRos, and mitochondrial movement within the axons are captured using a live-cell imaging microscope equipped with an incubator for cell culture. Time-lapse images are analyzed using software with &#34;MultiKymograph&#34;, &#34;Bioformat importer&#34;, and &#34;Macros&#34; plugins. Kymographs of mitochondrial transport are generated, and average mitochondrial velocity in the anterograde and retrograde directions is read from the kymograph. Regarding mitochondrial morphology analysis, mitochondrial length, area, and aspect ratio are obtained using the ImageJ. In summary, this protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology to facilitate studies of neurodegenerative diseases.

Impaired mitochondrial transport and morphology are involved in various neurodegenerative diseases. The presented protocol uses induced pluripotent stem cell-derived forebrain neurons to assess mitochondrial transport and morphology in hereditary spastic paraplegia. This protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology, which will facilitate the study of neurodegenerative disease.

遺伝性痙性対麻痺におけるヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおけるミトコンドリア輸送と形態学の解析

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

要約

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人間の皮膚生検における侵害受容性表皮内神経線維の三次元イメージング

皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で

膵臓癌細胞のミトコンドリアの微細構造変化を可視化する3次元技術

膵臓癌細胞のミトコンドリアの微細構造変化を可視化する3次元技術

膵臓癌細胞のミトコンドリアの微細構造変化を可視化する3次元技術

4次元蛍光イメージングと住んでいる神経末端におけるエンドソームダイナミクスの可視化

シリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いて脳ミトコンドリアの解析

遺伝性痙性対麻痺におけるヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおけるミトコンドリア輸送と形態学の解析

切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

軸索輸送の In Vivo イメージングのためのツールキットの拡張