Name: validation of a mouse model to disrupt linc complexes in a cell-specific manner
Uploaded: 2015-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
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著者らは、分子遺伝学のコア（眼科およびVisual科学科）の医学のセントルイス校のワシントン大学でマウス遺伝学コアの形態とイメージングコアのスタッフに、感謝します。作者は、携帯用のマクドネルセンター分子神経生物学、神経疾患のためのホープセンターから小規模助成プログラムでサポートされている、国立眼研究所（DHへ＃R01EY022632）、国立眼研究所センターコアグラント（＃1 P30EY002687）と眼科およびVisual科学科に失明を防止するための研究から無制限の助成金。

倫理声明：動物を対象とする手順は、セントルイスにあるワシントン大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。 1.マウスの繁殖とジェノタイピング<ol><li> （PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2）19,20のTgを生成するためのTg（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）Tgを有するマウス（PCP2-CRE）マウスを飼育。注：このプロトコルの残りは小脳内のプルキンエ細胞にEGFP-KASH2発現を制限するためのTg（PCP2-CRE）マウス系統の使用に焦点を当てているが、同様の手順は、他のTg（CRE）マウスで追跡することができます（ 図2A）。 </li><li>以前に19を説明したように、両方のEGFPとのCre導入遺伝子を保有する子犬を識別するために、遺伝子型判定を行います。 </li></ol>解剖および組織収集のための材料の作製<ol><li> -20℃で30％のPBS中のスクロース（1×PBS、30gのスクロース/ 100ミリリットル）と店の100ミリリットルを準備します。組織Hの日transcardial灌流35 mlシリンジにarvesting、解凍およびショ糖液の負荷〜30〜35ミリリットル。 </li><li> PBS中の4％PFA（10ミリリットル、16％パラホルムアルデヒド、30 mlのPBS）の40ミリリットルを準備します。 transcardial灌流35 mlシリンジにロード〜30〜35ミリリットルの4％PFA。 </li><li>組織切開のためにPBS 10mlで10cmの組織培養プレートを埋めます。 </li><li> 16 mg / mlのケタミンおよび3 mg / mlのキシラジンから成るケタミン/キシラジンのカクテルを用意します。 </li><li>解剖のための70％エタノール溶液を調製します。 </li></ol> 3.解剖と組織収集<ol><li> 1mlシリンジを使用して、体重25グラムあたりのケタミン/キシラジンのカクテルの500μLを注入し、15分〜を待ちます。あるいは、目的の生物学的システムに適した別の制度承認鎮静メソッドを使用します。 </li><li>鎮静時に、そっとの背側と発泡スチロールのトレイ上のすべての足をピン、疼痛応答の欠如を確認するために、後部足を挟まマウスを下に向けて。 </li><li> 70％エタノールで腹部をスプレーし、心臓へのアクセスを得るために胸郭の上に下腹部から切開を行います。 </li><li>心臓の右心房に小さな切開を行い、心臓の左心室に30％ショ糖溶液を含む注射器を挿入します。 </li><li> 〜2〜5ミリリットルあたり分の速度で溶液を灌流。ときに空のシリンジを除去し、4％PFA溶液で繰り返します。 </li><li>発泡スチロールのトレイからマウスの固定を解除し、脳にアクセスするために首を切ります。 </li><li>ピンセットやハサミを用いて動物の頭の周りの皮膚を削除します。針で頭蓋骨の後部の穴を突く、慎重にはさみや解剖鉗子で頭蓋骨を削除します。 </li><li>脳は明らかにアクセス可能になると、小脳を除去し、PBS中でそれを置くために鉗子を使用しています。メスで矢状面で小脳を二等分し、4℃で一晩、30％スクロース溶液に移します。注：準備へパラフィン切片は、組織が埋め込み、切片の前に4％PFA中で4℃で一晩小脳を修正しています。 </li></ol> 4.組織処理とセクショニング<ol><li>ドライアイスのスラリーと2-メチルブタンを準備します。浴の温度を5分間平衡化させます。 </li><li> OCT化合物でcryomoldを記入し、金型に二分小脳の半分を置きます。 </li><li>解剖顕微鏡とピンセット位置のペア（小脳の正中線に近い）二等分面が上を向いているように、小脳を使用。 </li><li> OCT化合物は、組織標本の周りの白色の固体マトリックスを形成されるまで5分間ドライアイススラリーにcryomoldを転送します。注：必要に応じて凍結標本は現在、-20℃で保存することができます。 </li><li>組織切片を収集するために前処理されたポリリジンスライドにラベルを付け、Cereの15ミクロン切片を収集するために、製造業者の指示に従ってクライオスタットを準備bellum。セクションを収集するには、慎重にスライドのポリリジンコーティングした側を10月セクションにお問い合わせください。セクションの向きを維持するために、このステップの間にスライドを回転させないでください。 </li><li> -20℃で保存組織切片染色およびイメージングに進むまで。 </li></ol> 5.染色および小脳切片のイメージング<ol><li>組織染色の前に、以下のソリューションを準備します。 PBSの〜50ミリリットル 〜PBS中の4％PFA 5〜10mlの 〜PBS中0.5％トリトンX-100、10％ロバ血清の10-20 mlの</li><li>小脳のセクションを解凍します。重要なことは、EGFPの退色を防止するために、連続した強い光の任意のソースへの露出を最小限に抑えることができます。 </li><li>疎水性バリアペンを使用して、組織切片の周囲に四角形を描画します。 </li><li> 5分間、4％PFAでセクションをポスト修正。疎水性バリア（通常〜500μL）で区切ら領域全体をカバーするのに十分な液体を使用してください。真空またはピペットを使用して、再組織切片を乱さないように特に注意しながら固定液を移動します。 </li><li>ピペットを用いて、やさしく組織切片を乱すことなく、スライド上のPBSを適用します。 5分後、慎重に液体を除去するために真空またはピペットを使用しています。 PBSを繰り返して合計3回すすいでください。 </li><li>ピペットを使用して、慎重にPBS中0.5％トリトンX-100、10％ロバ血清中（溶液の900μLあたり3μlのカルビンジンおよび/またはNesprin2抗体）は、適切な一次抗体の希釈物を適用します。暗所で室温で1時間インキュベートします。 注：EGFP-KASH2は、凍結切片上の直接蛍光顕微鏡によって見えるようになり、それは抗EGFP抗体を利用する必要はありません。パラフィン切片を調製している場合は、EGFP-KASH2のイメージングは​​、抗EGFP抗体を用いた免疫検出を必要とします。 </li><li>抗体溶液を除去し、PBSで3回すすいでください。 </li><li> 、0.5％トリトンX-100でアレクサ・フルーア二次抗体の希釈液千：1を準備します10％ロバ血清、PBS中、暗所で保管してください。 </li><li>静かに最後のPBSリンスを削除し、暗所で1時間、二次抗体の希釈を適用します。 </li><li>二次抗体溶液を除去し、セクションを3回洗浄し、洗浄してください。必要であれば、最初のPBS適用中に、このようなDAPI​​などの核染色、（〜300nmの）を適用します。 </li><li>完全組織と組織切片上でメディアをマウントする場所〜5-7μlの周りからのPBS溶液を除去。組織切片の上にカバーガラスを置き、暗所で室温〜15〜30分間のために確保さ。 </li><li> EGFPおよびステップ5.8 / 5.9で使用される二次抗体のための適切な任意の他の波長を可視化するために、適切なフィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用してください。小脳切片では、EGFP-KASH2核リムを表示するには、20Xの対物レンズを使用しています。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

正常のTg（CAG-のLacZ / EGFP-KASH2）モデルを用いてインビボで LINC複合体の役割を研究するための最も重要なステップは、適切なのCreマウス系統を同定することです。 Creが同様の経路に関与する他の細胞型で活性であれば確かに、それは結果の解釈を複雑にすることができます。小脳（ 図2B）の分子および顆粒細胞層にここに示されるように、したがって、それは、近隣の細胞を調べることが重要です。同様に、任意の生理学的に関連する表現型を最大化するためには、目的の細胞型を横切る広範Cre発現とのCre株を同定することが重要です。これは、目的のシステムの開発時にLINC複雑なコンポーネントの発現パターンの詳細な特性評価を行うことも重要です。実際、Tgは（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）マウスモデルの欠点の1つは、Sunタンパク質またはNesprins変異体は、生物学的システムに関与しているためにどのように任意の情報を提供しないということであるUファインダーの考慮。しかし、この問題は、両方の転写物およびタンパク質レベルでの厳密な特性評価を実施することによって克服することができます。実際には、このような研究は、CNSの開発と恒常性21,22の間に特定のLINC複雑なコンポーネントの役割についての重要な発見につながったいくつかの場面で行われています。 このプロトコルは、固定されたCNS組織の使用に焦点を当てている間に最後に、Tgは（CAG-のLacZ / EGFP-KASH2）マウスは 、in vitroでLINC複合体を破壊する効果を研究するために一次細胞を単離し、培養するために使用することができます。このスキームを使用して、このようなタイムラプスビデオ顕微鏡検査などのアプリケーションのためにEGFP-KASH2陽性細胞の初代培養物の単離及び精製することが可能です。これは、ニューロンなどの低トランスフェクション効率または一次培養システムに必要なレンチウイルスの生産を、バイパスします。 要約すると、Tgは（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）マウスは楽しみを研究する新しいエキサイティングな可能性を開きます基本的な細胞生物学の質問に対処するための組織および細胞型の多種多様な胚および出生後の哺乳動物の発生過程中にin vivoでの LINC複合体のction。

核膜（NE）は、細胞質から核質を分離します。これは、核膜孔に接続し、内側と外側核膜（INMとそれぞれONM）で構成されています。両方の膜で区切らルーメンは核周辺領域（PNS）と呼ばれています。 ONMは、粗面小胞体（ER）を拡張したものであり、INMは核ラミナ、核A-で表さタイプ-Vの中間フィラメントおよびB型ラミン1,2の網目構造に準拠しています。細胞核の骨格と細胞骨格（LINC）複合体のリンカーは、物理的に細胞骨格フィラメントと分子モーター（ 図1A）に核の内部を接続するための全体の核エンベロープにまたがる高分子集合体です。日（SAD1 / Unc84）タンパク質とNesprins（核膜SPectRINS）：彼らは、NEの一体型膜貫通型タンパク質の2家族を特徴づける進化的に保存されたモチーフ間の相互作用で構成されています。哺乳類では、Sun1とSun2 ARN末端 ​​核質地域INMの電子の膜貫通タンパク質は、A及びB型ラミン3-5と直接対話します。 INMの反対側には、PNS内、日タンパク質は、〜150のC末端アミノ酸の進化的に保存されたストレッチを抱い日ドメインと呼ばれます。日ドメインは、進化的に保存さKASH（Klarsicht / ANC-1、あれから相同性）ドメイン、Nesprinsの分子署名と直接対話。 KASHドメインは、膜貫通ドメイン6に続いて、PNS内に突出〜30のC末端アミノ酸のストレッチで構成されています。少なくとも4つの異なるNesprin遺伝子（Nesprin1-4）は、NE 7に局在KASH含有タンパク質をコードします。サイズ〜50kDa（Nesprin4）から驚くほどの千キロダルトン（Nesprin1巨人）に変わるNesprins、の細胞質領域は、複数のスペクトリンは、アクチン、プレクチンと分子モーター8のような細胞骨格成分との相互作用を可能にするだけでなく、特定のモチーフを繰り返し含ま13。 &lt;脊椎動物と無脊椎動物のpクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;研究は、ラミン/日/ Nesprin /分子モーターは、進化的に保存された「軸」の核移行と足場を制御を構成していることが示されています。 LINC複雑なコンポーネントのいくつかのノックアウト（KO）マウスモデルが記載され、哺乳類の発生9,14,15中のNEで太陽とNesprinタンパク質の役割を理解するためのフレームワークを提供することに尽力したされています。最も顕著なのが、本これらのモデルには、いくつかの重大な欠点、：細胞非自律的効果による表現型の解釈に1）困難、KASHレスNesprinは16アイソフォーム対KASH含有の表現型の貢献を区別するのに2）難易度、3）多数の細胞タイプで、NEで太陽とNesprinタンパク質の機能的冗長性は、両方のKASHドメインを欠損したマウス17内のすべてのSUN-KASH相互作用およびマウスの4）周産期致死性を不活性化するために、複雑な繁殖スキームが必要ですNesprins1と2は、大人の表現型18の分析を排除します。 このプロトコルは、このように上記で概説した欠点の多くをバイパスして、細胞自律的かつ発生的に調節方法で、 生体内でのすべてのSUN-KASH相互作用を破壊するように設計された新規マウスモデルを記述しています。これのCre / LOXベースのマウスモデルは、2つの重要な概念に依存している：1）任意の公知Nesprinタンパク質のKASHドメインが細胞培養系内のNEにEGFPを標的とし、2）SUNドメインがの過剰発現、従って、KASHドメインと無差別に相互作用するのに十分です任意のKASHドメインは、すべての内因性日ドメインを飽和させ、ドミナントネガティブな方法17（ 図1B）にLINC複合体を不活性化します。このプロトコルは、小脳プルキンエ細胞内のすべてのSUN-KASHの相互作用の破壊を確認するために使用される組織の収穫と処理手順について説明します。

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde Solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Adhesion Slides</td><td>StatLab</td><td>M1000W</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ImmuEdge Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Calbindin Antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9848</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFP Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nesprin2 Antibody</td><td></td><td></td><td>Previously described in Ref. 21</td></tr><tr><td>Fluorescent Mounting Media</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>2-methyl butane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3551</td><td></td></tr></tbody></table>

validation of a mouse model to disrupt linc complexes in a cell-specific manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

このプロトコルは、Tgは（PCP2-CRE）マウスを用いた小脳プルキンエ細胞にEGFP-KASH2発現を制限するためのTg（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）マウスモデルの有用性を示しています。 Tgは（PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2）の子孫では、LacZを/ V5オープンリーディングフレームは、それによって特異的にプルキンエ細胞（ 図2A）を対象とし、EGFP-KASH2の発現を導くCreリコンビナーゼによってP6で切除されます。予想されたように核（ 図2B）を中心に観察EGFP陽性リム状のパターンによって示されるように、EGFP-KASH2は核膜を対象にしています。任意の生理学的な表現型を最大にするために、それは、EGFP-KASH2は、細胞特異的抗体マーカーで共染色されたEGFP-KASH2陽性細胞の割合を計算することにより、標的細胞の大部分で発現されることを保証することが重要です。この例では、EGFP-KASH2発現がカルビンジン陽性プルキンエ細胞（ 図2B）の70％以上で検出されました。これらのコンディでン、我々は、10ヶ月齢のTg（PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2）マウス20内の任意の重要な組織学的または行動の表現型を観察しませんでした。これは、任意の形態学的または行動表現型が意図しない細胞型/組織におけるEGFP-KASH2の異所性発現によるものではないことを確認することが重要です。その点には、EGFP-KASH2は、顆粒細胞層またはTgが（PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2）小脳（ 図2B）の分子層では観察されませんでした。 最後に、EGFP-KASH2を発現する細胞におけるLINC複雑な混乱の程度を確認することが重要です。これは、EGFP-KASH2を発現する細胞のNEからの変位を強調するために高品質の抗Nesprin抗体を用いて達成することができます。 図3に示すように 、内因性Nesprin2はEGFP-KASH2 RETAを発現しないプルキンエ細胞つつ、EGFP-KASH2（ 図3トップパネル、黄色の矢印）を発現プルキンエ細胞の核膜からずれています核膜に内因性Nesprin2（ 図3トップパネル、白矢印）です。予想されるように、Creをリコンビナーゼを発現しない対照同腹子は、全プルキンエ細胞集団（ 図3下部に白い矢印）の核膜でNesprin2を表示します。いくつかの報告は今、このような骨格筋線維と錐体光受容体19,21などの追加の組織および細胞型において、内因性Nesprinsの変位を伴って、EGFP-KASH2の発現が確認されました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig1.jpg" /> 図1. LINC複合体は、細胞骨格に核を接続し、EGFP-KASH2の過剰発現によって破壊されている。細胞質細胞骨格に核の内部を接続するLINC複合体の（A）描写。日ドメインがKASHドメインと無差別に相互作用することに注意してくださいすべてNesp​​rins（Nesprins 1-4）から。 EGFP-KASH2の（B）の過剰発現は、このように、周囲の細胞質の細胞骨格から核を切断し、ドミナントネガティブな様式で、ERに核膜から内因性Nesprinsを置換します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig2.jpg" /> Tgは（PCP2-CRE）Tgのマウスの結果（PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2）子孫へのTg（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）のEGFP-KASH2の図2過剰発現は、特に小脳プルキンエ細胞を標的とする。（A）繁殖ここでCreリコンビナーゼは、小脳プルキンエ細胞に特異的に発現しています。式（P6）の際に、Creリコンビナーゼは、LacZのORFを切除し、EGFP-KASH2発現を誘導する核に移行。 （B）のTg（PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2）マウスは、具体的には、小脳プルキンエ細胞identifにEGFP-KASH2を表現カルビンジンとIED（赤に着色）。分子層の両方の小脳顆粒ニューロンと介在はEGFP-KASH2の発現に関して陰性であることに注意してください。略語：MOL：分子層、PCL：プルキンエ細胞層とGCL：顆粒細胞層。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig3.jpg" /> 小脳プルキンエ細胞における内因性LINC複合体の図3.破壊。プルキンエ細胞（上の黄色の矢印）の核膜から（赤に着色）内因性Nesprin2を変位EGFP-KASH2の発現を示す単一の共焦点面。 EGFP-KASH2の発現を欠くプルキンエ細胞がその核エンベロープ（白矢印上）で内因性Nesprin2を維持することに注意してください。 Tgは（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）対照同腹子では、何のEGFPシグナルは観察されず、Nesprin2はすべてPurkiの核膜で検出されますこのプロトコルは、の有用性を示していますTgは（PCP2-CRE）マウスを用いた小脳プルキンエ細胞にEGFP-KASH2発現を制限するためのTg（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）マウスモデル。 Tgは（PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2）の子孫では、LacZを/ V5オープンリーディングフレームは、それによって特異的にプルキンエ細胞（ 図2A）を対象とし、EGFP-KASH2の発現を導くCreリコンビナーゼによってP6で切除されます。予想されたように核（ 図2B）を中心に観察EGFP陽性リム状のパターンによって示されるように、EGFP-KASH2は核膜を対象にしています。任意の生理学的な表現型を最大にするために、それは、EGFP-KASH2は、細胞特異的抗体マーカーで共染色されたEGFP-KASH2陽性細胞の割合を計算することにより、標的細胞の大部分で発現されることを保証することが重要です。この例では、EGFP-KASH2発現がカルビンジン陽性プルキンエ細胞（ 図2B）の70％以上で検出されました。これらの条件では、我々はすべての重要な組織学的またはbehavioraは観察されませんでした10ヶ月齢のTg（PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2）マウス20リットルの表現型。これは、任意の形態学的または行動表現型が意図しない細胞型/組織におけるEGFP-KASH2の異所性発現によるものではないことを確認することが重要です。その点には、EGFP-KASH2は、顆粒細胞層またはTgが（PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2）小脳（ 図2B）の分子層では観察されませんでした。 最後に、EGFP-KASH2を発現する細胞におけるLINC複雑な混乱の程度を確認することが重要です。これは、EGFP-KASH2を発現する細胞のNEからの変位を強調するために高品質の抗Nesprin抗体を用いて達成することができます。 図3に示すように 、内因性Nesprin2はEGFP-KASH2が核エンベロープで内因性Nesprin2を保持発現しないプルキンエ細胞つつ、EGFP-KASH2（ 図3トップパネル、黄色の矢印）を発現プルキンエ細胞の核膜（ 図からずれています3 </strong&gt;トップパネル、白矢印）。予想されるように、Creをリコンビナーゼを発現しない対照同腹子は、全プルキンエ細胞集団（ 図3下部に白い矢印）の核膜でNesprin2を表示します。いくつかの報告は今、このような骨格筋線維と錐体光受容体19,21などの追加の組織および細胞型において、内因性Nesprinsの変位を伴って、EGFP-KASH2の発現が確認されました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig1.jpg" /> 図1. LINC複合体は、細胞骨格に核を接続し、EGFP-KASH2の過剰発現によって破壊されている。細胞質細胞骨格に核の内部を接続するLINC複合体の（A）描写。日ドメインはすべてNesp​​rins（Nesprins 1-4）からKASHドメインと無差別に相互作用することに注意してください。 （B）の過剰発現OF EGFP-KASH2は、このように、周囲の細胞質の細胞骨格から核を切断、ドミナントネガティブな様式で、ERに核膜から内因性Nesprinsを変位させる。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53318/53318fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig2.jpg" /> Tgは（PCP2-CRE）Tgのマウスの結果（PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2）子孫へのTg（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）のEGFP-KASH2の図2過剰発現は、特に小脳プルキンエ細胞を標的とする。（A）繁殖ここでCreリコンビナーゼは、小脳プルキンエ細胞に特異的に発現しています。式（P6）の際に、Creリコンビナーゼは、LacZのORFを切除し、EGFP-KASH2発現を誘導する核に移行。 （B）のTg（PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2）マウスは、具体的には赤に着色カルビンジン（）で識別小脳プルキンエ細胞にEGFP-KASH2を発現します。分子層の両方の小脳顆粒ニューロンと介在はEGFP-KASH2の発現に関して陰性であることに注意してください。略語：MOL：分子層、PCL：プルキンエ細胞層とGCL：顆粒細胞層は、 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53318/53318fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53318/53318fig3.jpg" /> 小脳プルキンエ細胞における内因性LINC複合体の図3.破壊。プルキンエ細胞（上の黄色の矢印）の核膜から（赤に着色）内因性Nesprin2を変位EGFP-KASH2の発現を示す単一の共焦点面。 EGFP-KASH2の発現を欠くプルキンエ細胞が核エンベロープで内因性Nesprin2を維持することに注意してください（聖霊降臨祭電子矢印上）。 Tgは（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）対照同腹子では、何のEGFPシグナルが観察されないとNesprin2はすべてのプルキンエ細胞（白矢印下）の核膜で検出される。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53318/53318fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

細胞特異的にLINC複合体を破壊するマウスモデルの検証

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K ビュー.  Washington University in St. Louis School of Medicine. Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

ビデオ: Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific Cre models, deletion of a protein throughout a tissue or cell population often leads to complex phenotypes resulting from multiple interacting mechanisms. Determining whether a phenotype results from disruption of a cell autonomous mechanism, which is intrinsic to the cell in question, or from a non-cell autonomous mechanism, which would result from impairment of that cell&#8217;s environment, can be difficult to discern. To gain insight into protein function in an in vivo context, in utero electroporation (IUE) enables gene deletion in a small subset of cells within the developing cortex or some other selected brain region. IUE can be used to target specific brain areas, including the dorsal telencephalon, medial telencephalon, hippocampus, or ganglionic eminence. This facilitates observation of the consequences of cell autonomous gene deletion in the context of a healthy environment. The goal of this protocol is to show how IUE can be used to analyze a defect in radial migration in a floxed transgenic mouse line, with an emphasis on distinguishing between the cell autonomous and non-cell autonomous effects of protein deletion. By comparing the phenotype resulting from gene deletion within the entire cortex versus IUE-mediated gene deletion in a limited cell population, greater insight into protein function in brain development can be obtained than by using either technique in isolation.

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

タンパク質の削除の誘導を介して<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーションは、トランスジェニックモデルにおいて神経細胞の移動の欠損を定義する

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

発生生物学

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

の定位注入マイクロRNA発現マウス海馬CA1領域にレンチウイルスと行動アウトカムの評価

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

行動学

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

条件を使用して、マウス腸の再生成にパネート細胞の役割を分析するためのプロトコル<em&gt;のCre-LOX</em&gt;マウスモデル

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

遺伝学

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all females are heterozygous for X-linked gene expression. One of the key regulators of XCI is Xist, which is essential for the initiation and maintenance of XCI. Previous studies have identified 13 trans acting X chromosome inactivation factors (XCIFs) using a large-scale, loss-of-function genetic screen. Inhibition of XCIFs, such as ACVR1 and PDPK1, using short-hairpin RNA or small molecule inhibitors, reactivates X chromosome-linked genes in cultured cells. But the feasibility and tolerability of reactivating the inactive X chromosome in vivo remains to be determined. Towards this goal, a Xist&#916;:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp mouse model has been generated with non-random XCI due to deletion of Xist on one X chromosome. Using this model, the extent of inactive X reactivation was quantitated in the mouse brain following treatment with XCIF inhibitors. Recently published results show, for the first time, that pharmacological inhibition of XCIFs reactivates Mecp2 from the inactive X chromosome in cortical neurons of the living mouse brain.

Here, we describe a protocol to generate a viable female murine model with non-random X chromosome inactivation, i.e., the maternally-inherited X chromosome is inactive in 100% of the cells. We also describe a protocol to test feasibility, tolerability, and safety of pharmacological reactivation of the inactive X chromosome in vivo.

不活性 X 染色体上の Mecp2 の薬理学的再活性化のための非ランダムマウスモデル

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

精製造血幹細胞/前駆細胞のDNAの変異を特定する

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

免疫・感染学

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

神経科学

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Modeling Prostate Cancer in Genetically-engineered Mouse Models: A CRISPR/Cas9-mediated Localized Gene Editing Technique in Mouse Anterior Prostate Lobe Cells

Source: Riedel, M. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/57525" target="_blank">Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video describes a method for editing specific genes in prostate gland cells using an adenovirus-based delivery system. The approach allows for orthotopic and localized alteration of gene expression utilizing CRISPR technology to develop novel mouse models for prostate cancer.

遺伝子改変マウスモデルにおける前立腺癌のモデリング:マウス前立腺葉細胞におけるCRISPR/Cas9媒介局所遺伝子編集技術

Source: Riedel, M. et al. Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration. J. Vis. Exp. (2018)
This video describes a method ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

がん研究

前立腺がん

動物モデル研究

Establishing a Focal Demyelination Mouse Model via a Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine

Source: Pang, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/64059">A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the generation of a focal demyelination mouse model using a two-point Lysophosphatidylcholine (LPC) injection. The skull of an anesthetized mouse is exposed. The injection coordinates are determined, and a hole is drilled to enable LPC injections at targeted sites. LPC induces focal demyelination of neurons via inflammation, while a two-point injection ensures its sustainability.

Source: Pang, X., et al. A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice. J. Vis. Exp. ...

細胞特異的にLINC複合体を破壊するマウスモデルの検証

要約

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この動画の章

タンパク質の削除の誘導を介して

の定位注入マイクロRNA発現マウス海馬CA1領域にレンチウイルスと行動アウトカムの評価

条件を使用して、マウス腸の再生成にパネート細胞の役割を分析するためのプロトコル

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

不活性 X 染色体上の Mecp2 の薬理学的再活性化のための非ランダムマウスモデル

精製造血幹細胞/前駆細胞のDNAの変異を特定する

マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射

子宮内エレクトロポレーションマウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

遺伝子改変マウスモデルにおける前立腺癌のモデリング:マウス前立腺葉細胞におけるCRISPR/Cas9媒介局所遺伝子編集技術

Establishing a Focal Demyelination Mouse Model via a Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine

細胞特異的にLINC複合体を破壊するマウスモデルの検証

要約

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タンパク質の削除の誘導を介して

の定位注入マイクロRNA発現マウス海馬CA1領域にレンチウイルスと行動アウトカムの評価

条件を使用して、マウス腸の再生成にパネート細胞の役割を分析するためのプロトコル

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

不活性 X 染色体上の Mecp2 の薬理学的再活性化のための非ランダムマウスモデル

精製造血幹細胞/前駆細胞のDNAの変異を特定する

マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射

子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

遺伝子改変マウスモデルにおける前立腺癌のモデリング:マウス前立腺葉細胞におけるCRISPR/Cas9媒介局所遺伝子編集技術

Establishing a Focal Demyelination Mouse Model via a Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine

子宮内エレクトロポレーションマウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。