We thank E. Arzt for his support through INM, M. Koch for help with the ESEM, and DENS Solutions for providing the microchips. Research in part supported by the Leibniz Competition 2013.

<ol>
	<li>Dukes, M. J., Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence+microscopy+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum-dot-labeled+proteins+in+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence microscopy and scanning transmission electron microscopy of quantum-dot-labeled proteins in whole cells in liquid.</a> ACS Nano. 4, 4110-4116 (2010).</li><li>Nishiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+scanning+electron+microscope+observes+cells+and+tissues+in+open+medium+through+silicon+nitride+film.">Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film.</a> J. Struct. 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B., Bandmann, V., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence-+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence- and scanning transmission electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Meth. Cell Biol. 124, 305-322 (2014).</li><li>Peckys, D. B., Dukes, M. J., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence+and+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence and electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Methods Mol. Biol. 1117, 527-540 (2014).</li><li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. 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H., Storm-Mathisen, J., Gundersen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+quantification+of+amino+acids+and+proteins+in+complex+subcellular+compartments.">Immunogold quantification of amino acids and proteins in complex subcellular compartments.</a> Nat. Protoc. 3, 144-152 (2008).</li><li>Orlov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+immunogold+labelling+of+RNA+polymerase.">Live cell immunogold labelling of RNA polymerase.</a> II. Sci. Rep. 5, 8324 (2015).</li><li>Fiala, G. J., Kaschek, D., Blumenthal, B., Reth, M., Timmer, J., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clustering+of+the+B+cell+antigen+receptor+demonstrated+by+mathematically+extended+electron+microscopy.">Pre-clustering of the B cell antigen receptor demonstrated by mathematically extended electron microscopy.</a> Front. Immunol. 4, 427 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

全細胞におけるこのようなEGFRなどの膜タンパク質の空間分布と化学量論を、学ぶこと、その機能と11-14その変化の可能性に関する重要なコンテキスト情報を提供します。これは、直接情報がセルまたはセル15の間の差異におけるタンパク質の局在化について失われるために一般的に使用される生化学的方法を用いて、細胞内レベルでのモノマー、ダイマー、およびクラスタの分布を研究するために挑戦しています。その化学量論は、個々の、無傷細胞4-7のコンテキスト内で研究することができるように、ここに記載の標識及び顕微鏡検査方法は、数ナノメートルの長さスケールでのタンパク質複合体の可視化を可能にします。その解像度はタンパク質複合体に従事した分子を区別するのに不十分であるため、これは（超解像度）光学顕微鏡23では不可能です。フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）は、&lt;アンサンブル平均化技術であります&gt; 24 SUP、必ずしもエネルギー移動25の短距離の結果として二量体およびより高次のクラスタを検出しません。近接ライゲーションアッセイ26は、実際の距離を測定しないため、高タンパク質濃度での細胞領域との間を区別することができない、必然的に類似のタンパク質濃度での細胞の領域から、偶然によって検出された近接の数につながるが、タンパク質を含みますかラベルの間に明確な距離を示す複合体。タンパク質複合体の成分を可視化するために必要な高解像度透過型電子顕微鏡（TEM）によって達成されます。しかし、細胞全体の従来のTEMは、原形質膜27、または形質膜リッピングを通してスライス又は膜のランダムに形成された小片の結果28,29を切り離す薄いサンプル/セクションの要件によって制限されます。細胞膜は、このように欠如につながる、全体として撮像されていません可能性が極めて重要な細胞のコンテキスト情報。 細胞におけるタンパク質の化学量論の研究のための他の実験的な課題は、印加されるタンパク質標識から生じます。一般的に使用される免疫標識は、受容体と標識との間の一対一の化学量論は、唯一の一価のプローブを用いて達成され得ることが困難に耐えます。これは、一次および二次抗体が必要とされている場合ではありません。タンパク質の化学量論についての情報を得るためには、プローブは、受容体上のエピトープに固有に結合し、蛍光プローブまたは他の側の高原子番号のナノ粒子のための1つの結合部位を有することが要求されます。近隣の単一タンパク質、ホモ二量体、またはより大きなクラスタ間の差別は、少なくともではないEGFRファミリーの受容体について、現実的ではありませんように、第二に、抗体標識で達成可能な精度は、その大きなサイズ30〜30ナノメートルのアカウントに制限されています。はるかに小さい特定のラベルは、文献およびCAで知られていますnは細胞内標識の31に対しても適用されるが、これらは一般的に使用されていません。全ラベル（EGF-ビオチン - ストレプトアビジンQD）の長さは、EGFRと同様の寸法のものであり、二量体を検出することができるように十分に小さいです。また、記載される二段階標識手順は、標識誘導される受容体のクラスタリングを回避します。 我々の方法は、標識されたタンパク質の蛍光顕微鏡よりもはるかに多く、非常に困難ではないではありません。ステップ数が合算とのいずれかの手順に誤りが実験で完全な故障につながる可能性があるのでしかし、実験では、細心の注意を払って行う必要があります。マイクロチップの取り扱いをお勧めしますTEMグリッドが、いくつかの訓練の空のチップの取り扱いよりも面倒ではありません。全体の水和細胞のESEM-STEMは、おそらく最も困難な側面であり、量子ドットを視覚化するために、必要に応じて3ナノメートルの周りの解像度に到達するために、少なくとも熟練したオペレータと実践の数日を必要とします。放射線ダム調査対象の試料の年齢はリスクを提示します。圧力及び温度は、慎重に水層を維持するために監視されるべきです。また、水の層の厚さは、セル間で変化してもよいです。他の場所で6記載のように、試料上の気体電子検出器を用いて水層の存在を監視することが望ましいです。細胞領域のみが損傷を避けるために一度か二度画像化されるべきです。 この方法の主要な制限は、超微細構造に関する高解像度情報が存在しないことです。他の技術は、例えば、クライオTEMのために、タンパク質の構造、および細胞の超微細構造15を研究するために必要とされます。第二に、タイムラプス顕微鏡で生細胞内のタンパク質の複数の動的相互作用を研究することは、放射線損傷のアカウントでは不可能である、と最先端の光学顕微鏡23を必要とします 。現在、私たちの方法は、L以来、二量体の絶対的なレベルを決定することはできませんabeling効率は不明であるが、我々は将来的にこのようなデータを追加する予定です。これは、二量体が存在しているかどう伝えるためにもかかわらず可能です。文献からは15％程度であっても標識効率は十分な統計的有意性32との二量体を検出するのに十分であることが知られています。 これは、特異的抗体のビオチニル化Fab断片を介して、それらのリガンドを介して他の膜結合型受容体を研究するために容易に可能であるか、または記載される二段階標識化プロトコルを使用して、他の小さなリンカーを介して、7。すでにQDの2つの異なる色（サイズ）を使用することができ、金ナノ粒子標識前ワーク 6に使用したことが実証されているので、同じ実験内の複数のタンパク質種を標識することが可能と思われます。複数のタンパク質種の化学量論の研究のための重要な課題は、尊敬に得られる相対的化学量論の正規化の両種または少なくとも類似の標識効率を確保していますラベリング効率をアイブ。しかし、この研究で使用される2つの異なるQDは、（ 図2および図4を参照）標識効率に大差がないようです。量子ドットとの二段階標識、および蛍光相関顕微鏡およびESEM-STEMを含む記載された方法は、全細胞の無傷の原形質膜に膜タンパク質の複雑な相互作用を研究するための実行可能な方法を提供します。

新しいアプローチは、STEM 1-3、または相関蛍光顕微鏡およびSTEM 4-7を用いて、液体の状態で標識したタンパク質を用いて画像全体の細胞に、最近導入されました。この方法は、全細胞の無傷の原形質膜における単一分子レベルでそれらの化学量論を含む膜タンパク質およびタンパク質複合体の空間分布を研究することが可能です。ここでは、蛍光量子ドット（QD）8、および相関光顕微鏡およびESEM-STEMと受容体タンパク質の二段階特異的な標識を含むプロトコルを記述します。例として、EGFR、タンパク質キナーゼスーパーファミリーに属する膜タンパク質を研究しました。リガンドが結合すると、受容体が活性化し、その後、別の活性化したEGFRとの二量体を形成し;後続のシグナルカスケードは、細胞増殖9を駆動します 。異常なEGFR発現または活性につながる変異は癌10の多くの種類の中で中心的な役割を果たしています。 StudyinG全細胞におけるこの膜受容体の空間的配置は、その機能と11-14その変化の可能性に関する重要なコンテキスト情報を提供します。しかし、それは直接biochemical-または従来の顕微鏡法15で（サブ）細胞レベルでのEGFRモノマー、ダイマー、およびクラスタの分布を調べるために困難なまま。我々の方法は、複合体中のタンパク質の位置を決定することができるように、数ナノメートルの空間分解能でのEGFRを可視化することが可能です。最も重要なのは、化学量論的分布に関する得られた情報は、無傷の細胞内タンパク質の天然の状況に関するものです。 ラベルと受容体との間の短い距離を達成するために、EGFRを直接QDにビオチン - ストレプトアビジン結合を用いて、そのリガンドEGFを介して標識しました。このラベルは、蛍光 - および電子顕微鏡の両方を検出することができます。私たちは、COS7細胞の相関イメージングでは、このラベルを使用しています以前1,16,17マイクロ流体チャンバ内に封入された液体。しかし、QDあたりストレプトアビジン分子の複数のアカウントで、このラベルは、低標識効率というより高価な実験につながる、受容体のクラスター化を誘導することができる、それは調査中のタンパク質の化学量論に結論することはできません。ラベル誘導される受容体のクラスタリングは一つだけのストレプトアビジン量子ドット（STR-QD）が結合されたビオチン化EGFを含むプローブで得られ、ここで提示二段階標識化手順を使用することによって完全に回避することができます。細胞は、まず、ビオチン化EGFと共にインキュベートし、次いで固定されています。固定工程は、タンパク質のプロセスは（固定の速度に依存）が停止された時点を決定します。 STR-QDは、標識プロトコルの2番目のステップで、その後に適用されます。タンパク質が固定されるとタンパク質の動的な膜の動きが阻害されるため、クラスタリングは行われません。である。また、STR-QDソリューション、実験の最も高価な成分は、最適化された低濃度で適用することができ、そして標識のこの第二段階は、時間重要ではない、 すなわち、QDは、数分内に結合することができます。 細胞全体に分布するようにEGFRの化学量論を研究するために、細胞試料は、シリコンマイクロチップ18上に作製しました。二段階QD標識、および蛍光顕微鏡画像の記録を適用した後、細胞を、純水でリンスし、そしてESEM-STEM 19を使用して水和状態で撮像されました。結果として得られる相関画像は、水和した細胞の彼らの自然な文脈での細胞のEGFR分布、および化学量論に関する情報を提供します。同様の方法は、最近の研究7乳癌細胞におけるHER2タンパク質を研究するために使用しました。

<table><tbody><tr><td>Inverted fluorescence microscope</td><td>Leica</td><td>AF6000 + DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>ESEM</td><td>FEI Company</td><td>Quanta 400 FEG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x) - Calcium chloride - Magnesium chlorid</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>Cellstripper</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-056 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Water, chromasolv Plus for HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34877-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>PBS Roti-Stock 10x PBS</td><td>Carl Roth</td><td>1058.1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, Rotisolv HPLC grade</td><td>Carl Roth</td><td>P076.2</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraction V, biotin-free (BSA)</td><td>Carl Roth</td><td>O163.2</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin, from cold water fish skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7041-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>T873.1</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor</td><td>Molecular Probes</td><td>E3477</td><td>Biotin-XX Conjugate (biotin EGF)</td></tr><tr><td>Sodium teraborate decahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9640-500G</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 655 streptavidin conjugate</td><td>Molecular Probes</td><td>Q10121MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 800 streptavidin conjugate</td><td>Molecular Probes</td><td>Q10173MP</td><td></td></tr><tr><td>Silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 50 &amp;micro;m x 0.40 mm</td><td>DENS Solutions</td><td>Custom made</td><td></td></tr></tbody></table>

studying the stoichiometry of epidermal growth factor receptor in intact cells using correlative microscopy

このプロトコルは、COS7線維芽細胞上の上皮成長因子受容体（EGFR）のラベル付けを説明し、その後の相関蛍光顕微鏡および水和状態における全細胞の環境制御型走査電子顕微鏡（ESEM）。蛍光量子ドット（QD）は、受容体の標識誘発性クラスタリングを回避しながら、効率的かつ特異的なタンパク質標識を提供し、二段階標識化プロトコルを介してEGFRに結合させました。蛍光顕微鏡は、EGFRの細胞位置の概観画像を提供しました。走査型透過電子顕微鏡（STEM）検出器は、ナノスケールの分解能でQDのラベルを検出するために使用しました。結果として得られる相関画像は、水和した無傷の細胞の自然な文脈での単一分子レベルでの細胞のEGFR分布、および化学量論のデータを提供します。 ESEM-STEM像は、モノマーとして、ホモ二量体として、そして小さなクラスターに存在するように受容体を明らかにしました。二つの異なる量子ドットを用いた標識、すなわち、一つは655 nmで発光すると800に類似した特性の結果を明らかにしました。

図1及び2は、無傷の 、完全に水和したCOS-7細胞中で可視化QD655標識し、膜に結合したEGFRの代表的な画像を示します。 図1のAでDIC画像は、細胞の膜地形の印象を与え、 図1Bに対応する蛍光画像は、EGFビオチンのインキュベーションの3分後にEGFRの分布を示している。 図1AおよびBは、それぞれ 2から一緒に縫合されています40Xエア目的で記録された画像。 EGFはEGFRの細胞表面全体にわたって分布している活性化されます。ほとんどの細胞では、蛍光のわずかな増強（ 図1B）は、EGFR 20の局所的に増大した発生したことを示す、セル端部で見られます。同様のプロトコルを用いて行った対照実験（データは示されていない）特定のEGFR標識を検証しました。これらのコントロールが含ま：CEの以前のインキュベーションなし1）対照用標識EGF-ビオチンとLLS、 すなわち、STR-QDを持つ唯一のインキュベーション、および非ビオチン化EGFおよびSTR-量子ドットと2）のインキュベーション。 四角形でマークされた三つのセルは、さらに、ESEM-STEMで調査しました。 図1Cに示されているESEM-STEM像- Eは 、これらの細胞の低倍率の概要を示しています。これらの透過画像は、窒化シリコン（SiN）覗き窓を有するシリコンマイクロチップ上に配置されたセルの上に存在する水の薄い層を有する水和状態で全細胞を反映します。顕微鏡の真空チャンバは、水蒸気を含有し、試料温度と圧力との間のバランスは、細胞上の液体の薄層を維持するように調整しました。個々の細胞は、容易にSiN膜ウィンドウにその形状および位置のために認識することができます。低倍率ESEM-STEM像は、糸状仮足、隣接セルに向かってセル端から延びる、およびいくつかの構造などの微細構造を明らかにする薄いセル領域の内側。サンプルを通る伝送が使用されるエネルギー（30keVの）の電子に対しては不可能であるため、核を含む厚い中央の細胞領域が白く見えます。 高解像度のESEM-STEM像が薄く、周辺領域に記録されました。薄い液体層内の細胞の薄い領域中のナノ粒子のESEM-STEM用の空間分解能は、3ナノメートルに達するために、以前の研究6で決定しました。 図2（a）に示す 4つの高解像度画像- Dは図1Cに小さな長方形の位置で記録した- E.を使用倍率は明るく、弾丸形状のロッドに現れる、個々の量子ドットを識別するのに十分であった、個別にバインドされた各EGFR。 QD655は6×14 nmの2の典型的な寸法を有します。 矩形領域に対応する図2Aは、（Figuのセルに表示されています1C RE）膜上のQDラベルが画像を横切る斜め倍を示しています。この膜構造は、周囲の膜の領域よりも高いEGFR密度を有します。いくつかの場所では、2つのラベルが近接にありました。 20および24ナノメートルの距離の2つの例が矢じりで示されています。ラベルのこれらのペアは、EGFR二量体に属するものとして解釈される。 図2Bは 、EGFRの単量体および二量体も同様に見ることができ、細胞（ 図1D、左の長方形）の端から例を示します。 図2C（図1C、右の矩形）低い蛍光信号、 すなわち、下のEGFR密度の領域から記録しました。それにもかかわらず、EGFRも同様に二量体で、ここで発見されました。また、10または11のEGFRの二つのクラスタが存在していた（楕円を参照）。 図2Dは ​​、いくつかの単量体に加えて、5-6のEGFRなどの小さいクラスターを有する膜倍（ 図1E）の他の例を示していますそして、二量体。 このデータから得られる情報の種類の一例として、対相関関数21 G（x）は、図2中のすべてのラベルの位置について決定した。この分析は、このプロトコルの一部ではないことに注意し、手順を説明しました他の場所で6,7。 G（x）は、基準粒子から一定の半径方向の距離xの中に発見される粒子の可能性の尺度です。 G（x）= 1ランダムな分布を示し、大きい値は、クラスタリングの証拠です。 210ラベルの合計の位置が自動的に図2A-Dの4つの画像で検出された、およびg（x）は5nmのビンサイズ及び10nmの帯域幅を有する平滑化フィルタを用いて計算しました。 G（x）の曲線（ 図3）は、25nmの好ましい中心QDの距離を示しています。 EGFRには、このようにランダムに配向していないが、それらの大部分は、この好ましい距離で存在します。 approximatから電子分子モデル6（ 図3挿入図）私たちは、QDおよびEGF結合ポケットの中心間距離は〜14nmであり、EGFRにダイマーに取り付けられた2つの量子ドット間の中心間の距離に達すると推定しています（この値は、リンカーの柔軟性のために、数ナノメートルだけ変化する可能性がある）〜27nmであること。好適なラベル距離は方法の精度内でのEGFR二量体の予想ラベル距離とこのように一致しています。 G（x）の曲線は、データと一致したクラスタの存在を示す、最大300nmの距離を統一よりも大きいです。この分析は、EGFRの化学量論は、提案手法を用いて研究できることを示しています。 図4は 、標識は、EGF-QD800で行い、63X油浸対物レンズは、蛍光画像のために使用したことを除いて、図2と同様の結果を示しています。このデータは、これらの典型的な結果も発見されたときことを確認しますEGFRの標識は近い赤色スペクトルで発光する量子ドットを用いて行われている。 図4（a）は、代表的な細胞の蛍光画像である、 図4Bは、ESEM-STEMの概要モードと図4Cの同じセルが記録15万倍の倍率の画像であることを示していますセルの上位膜の境界で（ 図4Bの四角形を参照）。 図2AおよびDを図のように 、画像は、膜倍にQDで標識されたEGFRをキャプチャして、モノマー、ダイマー、およびクラスタ化された受容体を示しています。 〜5nmの彼らの小さいコアサイズ22と一致し、電子密度の高い量子ドットのコアは655 nmで発光する量子ドットのコアよりもやや小さく、丸く表示されていることに注意してください。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig1.jpg" /> 図1.相関DIC、蛍光およびEGF-QD655のESEM-STEMは、完全に水和したCOS-7細胞に、EGFRをラベル </st原形質膜の地形的な印象を与えるのSiN膜のウィンドウ領域上で増殖した細胞の&gt;（A）DIC画像を栄。 （B）（破線の長方形でマーク）中央に位置するのSiN膜ウィンドウ上の細胞を示す蛍光画像。 （C - E）三ESEM-STEM低倍率の画像A、B内の四角形でマークされた細胞から。これらの細胞概観画像が記録され、その後、高解像度画像の正確な位置を決定するのに役立ちます。 （ 図2A-Dに示されている）4つの高解像度画像の位置は、白い長方形のマークが付いています。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53186/53186fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig2.jpg" /> <stroNG&gt;図2.高解像度ESEM-STEM像は、膜結合のEGFRを描いた。 図1（b）にマークされた領域の75,000Xの倍率で（A）顕微鏡写真。多くのモノマーは、表示されます。いくつかの二量体は矢頭で示しています。 （B）、左の50,000X倍率で取得（C）画像、 図1Cにマークされ、それぞれの権利、膜の領域。 EGFRのクラスタは概説されています。 （D）図1Dにマークされた場所に50,000X倍率で記録した画像は<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53186/53186fig2large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig3.jpg" /> 図3対相関関数g（x）の半径方向距離の関数がインターパルティについて決定xと<html>図2A-Dに検出されたすべての210のラベルのCLEの距離は25 nmでのピークは、Ag（x）は1に偶然を示し=なる中心QD距離は、ランダムより発生する非常に高い可能性を有することを示します。破線はラ​​ンダム分布の目表すG（x）のためのガイドです。挿入図は、ビオチンを介して結合した結合されたEGFおよびストレプトアビジンコーティングされた量子ドットとのEGFR二量体のおよその分子モデルを示します。 1stpのCPKモデルから得られたストレプトアビジン、EGFとEGFRのモデル（ストレプトアビジン）、1EGF（EGF）、1NQL、2JWA、1M17、1IVOと2GS6（EGFR）の構造のJmolバージョンで作成されたRCSBプロテインプロテインデータバンク、中12.2.15。 RCSBリガンドExplorerバージョン1.0に描かれたビオチンモデルである。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53186/53186fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> /53186/53186fig4.jpg &quot;/&gt; 図4.代表的なCOS-7細胞は、EGF-QD800で標識し、蛍光相関とESEM-STEMで撮像した。（A）蛍光画像、（B）低倍率の概要ESEM-STEM像。 （C）150,000X倍率でBにおける矩形の位置で記録された高解像度の画像。 、モノマー、ダイマー、およびクラスタのEGFRは、EGF-QD655での標識に似て検出されている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53186/53186fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

相関顕微鏡を用いて、無傷の細胞における上皮成長因子受容体の化学量論を学びます

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K ビュー.  INM-Leibniz Institute for New Materials. This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level. 

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Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.

This method is useful for quantifying the early dynamics of cellular adhesion and spreading of anchorage-dependent cells onto the fibronectin. Furthermore, this assay can be used to investigate the effects of altered redox homeostasis on cell spreading and/or cell adhesion-related intracellular signaling pathways.

酸化ストレス中のフィブロネクチン上皮細胞の細胞接着と広がりのダイナミクスを調べる

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

生化学

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

スペクトル的に解決された二光子顕微鏡を用いたGタンパク質共役受容体相互作用の in vivo定量で

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

生物学

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

三次元蛍光画像から細胞形態の変化を定量分析ツール

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

共焦点顕微鏡を明らかに細胞表面受容体画像相関分光法による凝集

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

クリック化学を用いた血管平滑筋細胞の増殖測定

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

数と明るさの分析と組み合わせた全内部反射蛍光顕微鏡による生細胞における細胞表面受容体のオリゴマー化ダイナミクス

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using scanning transmission electron microscopy (STEM). Cells of the mammalian breast cancer cell line SKBR3 were grown on silicon microchips with silicon nitride (SiN) windows. Cells were chemically fixed, and HER2 proteins were labeled with quantum dot nanoparticles (QDs), using a two-step biotin-streptavidin binding protocol. The cells were coated with multilayer graphene to maintain a hydrated state, and to protect them from electron beam damage during STEM. To examine the stability of the samples under electron beam irradiation, a dose series experiment was performed. Graphene-coated and non-coated samples were compared. Beam induced damage, in the form of bright artifacts, appeared for some non-coated samples at increased electron dose D, while no artifacts appeared on coated samples.

Presented here is a protocol for labeling membrane proteins in mammalian cells and coating the sample with graphene for liquid-phase scanning transmission electron microscopy. The stability of the samples against the damage caused by radiation can also studied with this protocol.

液相電子顕微鏡用化学固定哺乳類細胞のグラフェンエンクロージャ

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate multiple functions, including adhesion, proliferation, migration, and differentiation. Mechanical forces can be transmitted from the cell via the adhesion receptor integrin to ligands in the ECM. The amount and spatial organization of these cell-generated forces can be modulated by growth factor receptors, including epidermal growth factor receptor (EGFR). The tools currently available to quantify crosstalk-mediated changes in cell mechanics and relate them to&#160;focal adhesions, cellular morphology, and signaling are limited. DNA-based molecular force sensors known as tension gauge tethers (TGTs) have been employed to quantify these changes. TGT probes are unique in their ability to both modulate the underlying force threshold and report piconewton scale receptor forces across the entire adherent cell surface at diffraction-limited spatial resolution. The TGT probes used here rely on the irreversible dissociation of a DNA duplex by receptor-ligand forces that generate a fluorescent signal. This allows quantification of the cumulative integrin tension (force history) of the cell. This article describes a protocol employing TGTs to study the impact of EGFR on integrin mechanics and adhesion formation. The assembly of&#160;the TGT mechanical sensing platform is systematically detailed and the procedure to image forces, focal adhesions, and cell spreading is outlined. Overall, the ability to modulate the underlying force threshold of the probe, the adhesion ligand, and the type and concentration of growth factor employed for stimulation make this a robust platform for studying the interplay of diverse membrane receptors in regulating integrin-mediated forces.

TGT surface is an innovative platform to study growth factor-integrin crosstalk. The flexible probe design, specificity of the adhesion ligand, and precise modulation of stimulation conditions allow robust quantitative assessments of EGFR-integrin interplay. The results highlight EGFR as a 'mechano-organizer' tuning integrin mechanics, influencing focal adhesion assembly and cell spreading.

成長因子媒介インテグリン力学と接着を定量するためのテンションゲージテザープローブ

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate ...